基于PPARγ/AMPK/NF-κB信號通路研究對羥基苯甲醛對TNBS誘導的小鼠克羅恩病的治療作用

許曉飛，羅愛林，徐笑天，盧 曦，王宇暉，段小群

桂林醫(yī)學院藥學院，桂林 541199

克羅恩病(Crohn’s disease，CD)是一種慢性復發(fā)性胃腸道疾病，是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的主要疾病之一，其發(fā)病通常以腹瀉、腹痛、直腸出血、發(fā)燒、體重減輕和疲勞等常見癥狀為特征[1]。在CD中，炎癥通過腸壁從黏膜延伸到漿膜，這種疾病持續(xù)復發(fā)和緩解，隨著多次復發(fā)，CD可以從最初的輕度至中度炎癥發(fā)展為嚴重的穿透性(瘺管形成)或狹窄性疾病，更嚴重者會導致癌變，嚴重影響患者的生活質量[2]。另外，CD患者還表現出許多腸外炎癥，如眼睛、肝臟、皮膚和關節(jié)中等炎癥反應，反映了這種疾病的全身性[3]。CD的治療包括一線治療和其他治療，其中一線治療包括類固醇、抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)，可快速緩解癥狀。其他治療可能包括針對IL-12/23或整聯蛋白α4β7的單克隆抗體、免疫調節(jié)劑、聯合療法或手術[4]。然而，這些藥物的統(tǒng)一機制是免疫抑制，長期使用會導致患者感染風險增加，除此之外還伴隨其他嚴重的副作用，包括骨髓抑制、骨質疏松癥和肝損傷[5]。因此，迫切需要開發(fā)來自自然資源和功能性食品的替代藥物來治療CD。

雷公菌(Nostoccommune)是一種藍藻生物，由于其營養(yǎng)全面豐富，經常被用于預防和治療疾病。近年來，其提取物已被證明對腸道疾病有效[6]。我們在前期研究中發(fā)現，雷公菌的主要活性成分對羥基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde，HD)能通過抑制腸道炎癥反應改善潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)疾病癥狀[7]?；赨C與CD的諸多相似性，我們推測HD也許會有抗CD作用，為了驗證此假設，我們使用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導建立小鼠CD模型和TNF-α誘導的Caco-2細胞炎癥模型，探究HD對CD的保護作用及機制，為富含HD的食物作為防治IBD的補充替代治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

2-16KL低溫高速離心機(Sigma-aldrich公司)；80-2C室溫低速離心機(常州市凱航儀器有限公司)；DSZ5000X熒光倒置顯微鏡(重慶澳浦光電技術有限公司)；EPS 300蛋白電泳、轉膜系統(tǒng)(北京原平皓生物技術有限公司)；iMark酶標儀、CFX Opus 96 PCR儀(Bio Rad公司)；ES-J120分析天平(天津市德安特傳感技術有限公司)；Tanon 6600全自動化學發(fā)光圖像分析檢測系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；NanoDrop 2 000分光光度計(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 藥物與試劑

HD(C7H6O2，分子量為122.12，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，Lot：123-08-0)；柳氮磺胺吡啶(SASP，上海源葉生物科技有限公司，Lot：1346606-50-5)；TNBS(C6H3N3O9S，分子量為293.17，純度 ≥5.0%(w/v)水溶液，西亞化學科技有限公司，Lot：23407-1)；TNF-α、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢新啟迪生物科技有限公司，Lot：06460、05884、05874)；髓過氧化物酶(MPO)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，Lot：044-1-1)；Caco-2細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)；胎牛血清(北京同立海源生物科技有限公司，Lot：07133)、DMEM(Gibco公司，8118251)；重組刺激因子TNF-α(R&D Systems公司，Lot：10291)；anti-PPARγ、anti-p-AMPK、anti-AMPK、anti-NF-κB p65、anti-p-NF-κB p65和anti-β-actin(Bioworld公司，Lot：4444、4457、1009、1256、4137、6007)；RIPA裂解液、5× SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所，Lot：0013、0015、0012)；Super ECL Plus超敏發(fā)光液、Hi-script RT Super Mix和Ace Q-PCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Lot：412-01、123-01、131-02)。

1.3 動物

本實驗的所有程序均經過桂林醫(yī)學院動物倫理委員會的嚴格審核和批準，動物協(xié)議批準文號為GLMC201904008。36只SPF級健康雄性Balb/c小鼠，7周齡，體重20±2 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。所有小鼠均在標準條件下(溫度：22～25 ℃；濕度：45%～50%；12～12 h光/暗循環(huán))，自由采食標準飼料和水。

1.4 方法

1.4.1 動物造模、分組及處理

根據我們前期研究發(fā)現劑量為40 mg/kg的HD可以顯著改善小鼠UC[7]，基于CD與UC具有一定的相似度，我們在TNBS誘導的小鼠CD模型上使用40 mg/kg的HD進行預實驗，發(fā)現HD可以顯著改善小鼠CD，因此選擇40 mg/kg作為高劑量組，并將劑量以倍數減少的方式分別選擇20 mg/kg和10 mg/kg作為中劑量和低劑量。適應性喂養(yǎng)一周后，將小鼠隨機分組正常組(N)、模型組(M)、HD高劑量組(HD-H，40 mg/kg)、HD中劑量組(HD-M，20 mg/kg)、HD低劑量組(HD-L，10 mg/kg)和柳氮磺胺吡啶組(SASP，300 mg/kg)，每組6只。如前所述[8]，使用TNBS(250 mg/kg)誘導CD小鼠模型。除正常組外，其余各組小鼠實驗前均禁食不禁水24 h，實驗當天灌腸前擠出小鼠糞便，進一步排空，隨后用戊巴比妥鈉麻醉小鼠。將灌腸管連接在注射器上，用棉簽蘸取花生油，涂抹在灌腸管上；將灌腸管從小鼠肛門插入3.5 cm，之后緩緩注入100 μL含有2.5% TNBS的50%乙醇溶液，同時向外拔出灌腸管，灌腸后將小鼠尾巴用膠帶紙粘在桌邊，保持倒吊狀態(tài)4 min，確保肛門無滴液后放回鼠籠。小鼠給予TNBS 1次后，SASP組與HD組小鼠在模型組的基礎上每天灌胃給予相應的治療藥物(0.1 mL/10 g)，共給藥7天。正常組和模型組小鼠給予水作為對照。第7天，給藥4 h后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，收集小鼠距離肛門邊緣3 cm處的長度大約為1 cm的結腸組織。

1.4.2 疾病活動性指數(DAI)評分

每天記錄小鼠體重變化、大便稠度及糞便隱血情況。DAI評分為(體重減輕+大便稠度+大便隱血)/3[9]。評分見表1。

表1 DAI 評分表

1.4.3 結腸組織病理觀察

第7天處死所有小鼠，取出結腸，量取長度，縱向打開，用PBS沖洗干凈。取部分結腸用4%多聚甲醛固定24 h，經過脫水、石蠟包埋、切片(5 μm)、蘇木精-伊紅染色(H&E)，使用顯微鏡觀察組織病變情況并拍照。并根據杯狀細胞耗竭(存在=1，不存在=0)、隱窩膿腫(存在=1，不存在=0)、黏膜結構破壞(正常=1，中度=2，廣泛=3)，肌肉增厚(正常=1，中度=2，廣泛=3)和細胞浸潤(正常=1，中度=2，透壁=3)[10]情況來量化結腸組織的損傷程度。

1.4.4 ELISA檢測結腸組織和細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達

將結腸組織剪碎后，以PBS作為勻漿液將結腸組織置于研磨管中充分研磨，制備結腸組織勻漿，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，分離上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠結腸組織勻漿上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白表達水平。另外，采用10 ng/mL的TNF-α誘導Caco-2細胞模型進一步研究HD的抗克羅恩病作用。實驗分為對照組(C，無HD和TNF-α)、模型組(M，添加10 ng/mL的TNF-α)、HD低濃度組(HD-L，添加10 ng/mL的TNF-α和3 μmol/L的HD)、HD中濃度組(HD-M，添加10 ng/mL的TNF-α和10 μmol/L的HD)、HD高濃度組(HD-H，添加10 ng/mL的TNF-α和30 μmol/L的HD)和柳氮磺胺吡啶組(SASP，添加10 ng/mL的TNF-α和30 μmol/L的SASP)?；衔锾幚砑毎?4 h后，收集各組培養(yǎng)基并根據ELISA試劑盒說明書檢測細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白表達水平。

1.4.5 結腸組織MPO活性檢測

收集結腸組織，稱重、剪碎勻漿后，按照試劑盒說明書操作，檢測結腸組織中的MPO活性，該試劑盒以每克濕組織的重量為單位。

1.4.6 小鼠結腸和Caco-2細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達

采用Trizol試劑從結腸組織和Caco-2細胞中提取總RNA。使用Nano Drop 2000分光光度計量化總RNA。隨后，用Hi-script RT Super Mix將RNA轉錄為cDNA。以cDNA為模板，在95 ℃，10 s和60 ℃，30 s的條件下，用Ace Q-PCR SYBR Green Master Mix和MyiQ2檢測系統(tǒng)檢測TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達，共40個循環(huán)。目的基因的表達以GAPDH作為內參，數據分析使用2-ΔΔCt方式計算，平行三次實驗。引物序列及長度見表2。

表2 引物序列

1.4.7 小鼠結腸中PPARγ/AMPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達

結腸組織用PBS清洗后，用濾紙吸干水分，準確稱量40 mg樣品，使用含有PMSF的RIPA裂解液提取組織和Caco-2細胞總蛋白。根據制造商的方案，使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白總濃度。制備10%的電泳凝膠，將等量蛋白樣品加到凝膠中，然后通過80 V，30 min和120 V，50 min的電泳條件進行蛋白分離。根據目標蛋白的分子量，將所需蛋白轉移到PVDF膜上。然后在添加5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉膜2 h。隨后，PVDF膜與一抗在4 ℃條件下孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗后，室溫下用二抗避光孵育1.5 h。通過ECL系統(tǒng)檢測免疫反應性蛋白質，用全自動化學發(fā)光圖像分析檢測系統(tǒng)下收集圖片。β-actin用作蛋白標準化對照。最后，通過Quantity One軟件量化條帶中的蛋白質強度。

1.4.8 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 HD對TNBS誘導的CD小鼠體重、腹瀉、隱血和結腸長度的影響

為了確定HD是否具有改善TNBS誘導的小鼠克羅恩病疾病癥狀的作用，我們對克羅恩病小鼠灌胃HD治療7天，并以SASP為陽性藥物。結果如圖1所示，與正常組相比，使用TNBS可以導致小鼠體重出現明顯減輕、嚴重的腹瀉和血便，說明建模成功。然而給予HD干預后，大大阻止小鼠體重降低(見圖1A)、DAI評分升高(見圖1B)以及結腸縮短(見圖1C)。同時研究發(fā)現，HD(40 mg/kg)的作用優(yōu)于SASP(100 mg/kg)，說明HD具有改善CD小鼠結腸疾病癥狀的作用。

圖1 HD對TNBS誘導的CD小鼠體重、腹瀉、潛血和結腸長度的影響

2.2 各組小鼠結腸組織形態(tài)學變化

為了研究HD對各組小鼠結腸組織形態(tài)學變化的影響，顯微鏡下觀察各組小鼠結腸組織形態(tài)學，結果如圖2所示，正常組小鼠結腸表現為黏膜和杯狀細胞形態(tài)正常，未見炎性細胞浸潤與潰瘍。模型組小鼠結腸組織黏膜上皮出現缺失，大量杯狀細胞被破壞，黏膜下層明顯增厚水腫，血管增生，黏膜層及黏膜下層可見較多的炎癥細胞浸潤，另外淋巴組織增生，黏膜層有裂隙狀潰瘍形成，并且部分潰瘍可深達腸壁肌層。然而，HD組發(fā)現小鼠的黏膜上皮較為完整，少見炎性細胞浸潤，杯狀細胞多數表現為完整，腺體排列較為規(guī)則，黏膜下層增厚減輕，組織水腫減少。以上說明HD具有改善小鼠結腸病理情況。

圖2 HD對各組小鼠結腸組織形態(tài)學變化的影響(×200)

2.3 HD對結腸炎癥反應的影響

為了證明促炎因子在克羅恩病的炎癥反應中發(fā)揮重要作用，我們研究了促炎因子在TNBS誘導的小鼠CD中的表達。如表3和4所示，相對于對照組，TNBS增加了結腸中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白質和mRNA的表達。HD干預后，顯著抑制TNF-α和IL-6蛋白質和mRNA的表達，且呈劑量依賴性，然而不影響IL-1β的表達。研究還發(fā)現，HD(40 mg/kg)幾乎可以使TNF-α和IL-6的表達恢復到正常水平。另外，體外實驗也進一步證明了HD的抗結腸炎炎癥作用。以上表明，HD的抗CD作用與其抑制促炎因子的表達密切相關。

表3 HD對TNBS誘導的CD小鼠結腸組織中促炎因子mRNA表達的影響

表4 HD對TNBS誘導的CD小鼠結腸組織中促炎因子蛋白質表達的影響

表5 HD對TNF-α誘導的Caco-2細胞炎癥模型中促炎因子mRNA表達的影響

表6 HD對TNF-α誘導的Caco-2細胞炎癥模型中促炎因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)蛋白質表達的影響

2.4 HD對TNBS誘導的CD小鼠結腸MPO活性的影響

MPO是由中性粒細胞嗜酸性顆粒表達的一種血液蛋白，通常被用作中性粒細胞的標記物。為了探究HD對CD小鼠結腸MPO含量表達的影響，通過試劑盒檢測小鼠結腸中MPO的表達水平。結果發(fā)現，與正常組相比，TNBS處理導致小鼠結腸MPO活性升高(P<0.01)。而HD干預后，可以顯著抑制MPO的活力，且呈劑量依賴性。HD(40 mg/kg)抑制MPO作用優(yōu)于SASP(見圖3)。以上說明HD可以抑制中性粒細胞在CD小鼠結腸的浸潤。

圖3 HD對TNBS誘導的CD小鼠結腸MPO活性的影響

2.5 HD對PPARγ/AMPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

為了檢測HD是否通過PPARγ/AMPK/NF-κB信號通路改善小鼠克羅恩病，通過蛋白免疫印跡法檢測小鼠結腸中PPARγ/AMPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達。結果發(fā)現(見圖4)，與正常組相比，模型組小鼠結腸組織中PPARγ、p-AMPK蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，SASP和HD均可以使結腸組織中PPARγ、p-AMPK蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，其中對HD(40 mg/kg)效果最佳。另外，在TNF-α誘導的Caco-2細胞炎癥模型中發(fā)現，HD對PPARγ/AMPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響與動物實驗結果相一致(見圖5)。以上結果表明，HD通過激活PPARγ促進AMPK磷酸化抑制NF-κB活化，進而改善小鼠CD癥狀。

圖4 HD對結腸中PPARγ/AMPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

圖5 HD對細胞中PPARγ/AMPK/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

3 討論與結論

CD是一種病因不明的特發(fā)性慢性炎癥性疾病，易復發(fā)，累及口腔到肛門的整個消化道。在歐洲和北美人群的發(fā)病率最高，但近年來亞洲人群的發(fā)病率急劇上升[11]。研究發(fā)現，CD的發(fā)病機制與腸黏膜免疫反應失調引起的腸道炎癥密切相關[12]。多項研究表明，改善腸道炎癥反應可以顯著緩解CD。例如，沙利度胺通過恢復TH17/Treg細胞的失衡和改變促炎和抗炎細胞因子的平衡減輕炎癥反應來改善小鼠CD[13]。馬基多酚提取物通過下調COX-2和iNOS的表達抑制腸道炎癥改善小鼠CD[14]。以上說明抑制腸道炎癥反應是治療CD的一個主要手段。一致地，我們發(fā)現HD可以通過抑制炎癥反應來改善TNBS誘導的CD。

炎癥是IBD發(fā)病的主要誘因，引起IBD腸組織損傷。作為重要的炎癥生物標志物，相關細胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17，它們在炎癥反應中起重要作用，抑制其過表達可以改善CD的腸道炎癥反應[15]。例如LB可以抑制TNBS誘導的小鼠腸道IL-6、IL-1β、TNF-α的過表達改善克羅恩病[16]。丁酸鈉在TNBS誘導的炎癥性腸病小鼠模型中抑制炎癥并維持上皮屏障完整性[10]。以上研究均表明抑制促炎細胞因子的產生對CD具有治療作用。在這項研究中，TNBS會誘發(fā)小鼠出現腸道嚴重炎癥反應。然而，HD治療后減輕了結腸炎癥細胞浸潤，并且在動物和細胞水平上均顯著下調了這些炎性細胞因子水平，說明HD可以抑制炎癥反應改善小鼠CD。

NF-κB是IBD炎癥細胞因子轉錄的重要信號轉導途徑，負責調節(jié)促炎細胞因子(TNF-α和IL-6)的轉錄[17]。作為NF-κB家族成員之一，p65一旦被激活可以轉位到細胞核中上調促炎細胞因子的轉錄表達[18]。研究發(fā)現，通過抑制NF-κB信號通路可以減輕TNBS模型中的炎癥[15]。在本研究中，TNBS的誘導使CD小鼠結腸中NF-κB p65的磷酸化蛋白表達增多，而HD的干預導致NF-κB p65的磷酸化蛋白表達降低。另外，HD還可以抑制TNF-α誘導的Caco-2細胞中NF-κB p65的磷酸化蛋白表達的升高。說明HD通過抑制NF-κB信號通路改善結腸炎癥反應。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在葡萄糖和脂質代謝、細胞生長和凋亡、自噬和炎癥中發(fā)揮重要作用[19]。研究發(fā)現，AMPK通過抑制NF-κB的激活來實現抗炎作用[20]。Xu等[21]發(fā)現AMPK的激活可以抑制NF-κB通路進而抑制缺氧和復氧過程中的炎癥反應。Chen等[22]發(fā)現，使用化合物C(AMPK抑制劑)可以阻止紅景天苷抑制NF-κB信號通路改善AGEs誘導的內皮炎癥和氧化應激。同樣，本研究發(fā)現HD具有促進AMPK磷酸化的作用，且呈劑量依賴性。以上說明HD通過激活AMPK抑制NF-κB通路從而改善TNBS誘導的炎癥反應。

PPARγ是一種轉錄因子，在抗炎、抗氧化和吞噬細胞介導的清除過程中起重要作用，在結腸上皮中高度表達[23]。許多研究表明，PPARγ是AMPK的激活因子，而PPARγ的抗炎作用是通過激活AMPK來實現。例如，PPARγ激動劑(噻唑烷二酮藥物)可以通過AMPKα的磷酸化激活AMPK抑制腸道病理性炎癥[24]。而GW9662、T0070907和PPARγsiRNA可阻止羥基積雪草酸激活AMPK恢復Th17/Treg平衡來改善結腸炎[25]。本研究發(fā)現HD具有PPARγ激動劑作用，說明HD通過激活PPARγ抑制CD的炎癥反應。

綜上所述，HD可有效減緩TNBS誘導的小鼠CD炎癥反應，其機制可能與PPARγ/AMPK/NF-κB信號通路介導的炎癥反應有關。我們的研究表明，在日常生活中補充雷公菌不僅可以防治UC，對CD也有一定的防治作用，在IBD發(fā)病率逐年增高以及當前治療藥物諸多局限的大背景下，我們的研究為富含HD的食物作為防治IBD的補充替代治療提供科學依據。