清肺口服液黃酮類成分對(duì)呼吸道合胞病毒感染小鼠壞死性凋亡的影響

凌曉穎，丁雅荔，陶嘉磊，袁 斌

清肺口服液黃酮類成分對(duì)呼吸道合胞病毒感染小鼠壞死性凋亡的影響

凌曉穎，丁雅荔，陶嘉磊，袁 斌*

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029

研究清肺口服液黃酮類成分對(duì)呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染小鼠壞死性凋亡的影響。將BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及黃酮類成分低、高劑量（30、60 mg/kg）組和利巴韋林（46 mg/kg）組，建立RSV感染的小鼠模型，給藥4 d后，蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肺組織病理學(xué)變化；qRT-PCR檢測(cè)肺組織中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，）和mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織細(xì)胞壞死性凋亡率；ELISA法檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）水平；Western blotting檢測(cè)肺組織受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein 1，RIP1）、RIP3、混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）、磷酸甘油酸變位酶5（phosphoglycerate mutase 5，PGAM5）、動(dòng)力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）蛋白表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)肺組織RIP1和RIP3的共定位以及p-MLKL與上皮細(xì)胞的共定位。與模型組相比，黃酮類成分組小鼠肺組織病理?yè)p傷減輕；肺組織中、和mRNA表達(dá)水平降低（＜0.05、0.01）；肺組織細(xì)胞壞死性凋亡率下降（＜0.05、0.01）；BALF中HMGB1和LDH水平降低（＜0.05、0.01）；肺組織RIP1、RIP3、MLKL、PGAM5、DRP1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；肺組織RIP1/RIP3壞死復(fù)合物的形成減少，肺上皮細(xì)胞中p-MLKL的熒光表達(dá)降低。清肺口服液黃酮類成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)RIP1/RIP3/ MLKL/PGAM5/DRP1信號(hào)通路，抑制壞死性凋亡，改善RSV感染的小鼠肺部炎癥損傷。

清肺口服液；黃酮類成分；呼吸道合胞病毒；壞死性凋亡；受體相互作用蛋白激酶1；受體相互作用蛋白激酶3；混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域；磷酸甘油酸變位酶5；線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是全球嬰幼兒、老年人和免疫功能低下人群病毒性肺炎最常見的病原體之一。據(jù)估計(jì)，RSV感染每年導(dǎo)致超過(guò)300萬(wàn)人住院和近6萬(wàn)人死亡，主要發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1]。嬰幼兒早期RSV感染還與隨后發(fā)生反復(fù)喘息及哮喘的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[2]。目前RSV感染的防治方式有限，尚無(wú)安全有效的抗病毒藥物及批準(zhǔn)用于臨床的疫苗[3]。

細(xì)胞凋亡并不能引起或加重炎癥反應(yīng)，而壞死則會(huì)釋放過(guò)多的細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)一步放大炎癥風(fēng)暴和肺損傷。壞死性凋亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種不依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cystein-asparate protease，Caspase）活化的新型細(xì)胞程序性壞死，它具有典型的壞死樣形態(tài)：細(xì)胞體積增大，細(xì)胞器腫脹，細(xì)胞膜穿孔，之后為細(xì)胞崩解，內(nèi)容物釋放，導(dǎo)致大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和激活[4]。越來(lái)越多研究表明，壞死性凋亡在RSV的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要的角色，抑制壞死性凋亡不僅能降低RSV感染小鼠肺部病毒載量，還能減輕肺部炎癥[5]。因此，靶向壞死性凋亡可能是防治RSV感染的新方向。

RSV肺炎可歸屬于中醫(yī)兒科學(xué)“肺炎喘嗽”的范疇，急性期以痰熱閉肺證最為多見[6]。全國(guó)名中醫(yī)汪受傳教授結(jié)合其證候特點(diǎn)，在經(jīng)方麻杏石甘湯基礎(chǔ)上，加宣肺止咳之前胡，肅肺平喘之桑白皮，瀉肺滌痰之葶藶子，解毒活血之虎杖等，組方制成以開肺化痰、解毒活血為主要功效的清肺口服液[7]。清肺口服液臨床運(yùn)用多年，隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)其治療RSV肺炎安全有效[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分是清肺口服液的主要藥效物質(zhì)，能夠顯著抑制RSV復(fù)制，減輕肺組織的病理?yè)p傷[9]，但對(duì)壞死性凋亡的調(diào)控作用還尚未可知。因此本研究建立RSV感染小鼠模型，探究清肺口服液黃酮類成分抑制壞死性凋亡的作用機(jī)制，也為清肺口服液的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 病毒

RSV A2型long株，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，RSV在Hep-2細(xì)胞上擴(kuò)增，收集病毒備用。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自SIPEIFU生物科技有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物于室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度40%～70%，晝夜交替照明的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)201805A019）。

1.3 藥品與試劑

清肺口服液按原比例配制：炙麻黃4 g，生石膏24 g，杏仁10 g，桑白皮10 g，葶藶子6 g，紫花前胡10 g，虎杖12 g，拳參12 g，制僵蠶6 g，丹參6 g，以上藥材由江蘇省中醫(yī)院提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定均符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。取藥材5 kg粉碎，加12倍量85%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，濾過(guò)，濾液合并，減壓濃縮、冷凍干燥，獲得凍干粉600 g，經(jīng)聚酰胺樹脂純化后，減壓濃縮、冷凍干燥獲得黃酮類成分凍干粉，轉(zhuǎn)移率為78.7%，并采用UPLC-MS/MS技術(shù)，定量檢測(cè)出兒茶素、木犀草素等26種黃酮類化合物[10]。

利巴韋林購(gòu)自源葉生物有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液、Tris-Glycine SDS電泳緩沖液、快速轉(zhuǎn)膜液購(gòu)自蘇州新賽美公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR、細(xì)胞/組織RNA提取試劑盒、Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）ELISA試劑盒、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）ELISA試劑盒購(gòu)自南京謹(jǐn)庭公司；受體相互作用蛋白1（receptor-interacting protein 1，RIP1）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；RIP3、磷酸甘油酸變位酶5（phosphoglycerate mutase 5，PGAM5）抗體購(gòu)自Abmart公司；混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）抗體、動(dòng)力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）抗體、鈣黏蛋白E（E-cadherin）抗體購(gòu)自Proteintech公司；p-MLKL抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自Affinity公司。

1.4 儀器

蛋白核酸分析儀（德國(guó)Eppendorf公司）；Quant Studio 7 Flex PCR System（Life technologies公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（Bio-Rad公司）；流式細(xì)胞儀（BD公司）；酶標(biāo)儀（Tecan公司）；光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡（Carl Zeiss公司）。

2 方法

2.1 模型的建立和給藥

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及黃酮類成分低、高劑量（30、60 mg/kg/d）組和利巴韋林（46 mg/kg）組，每組6只。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照本課題組前期已建立的造模方法[10]，除對(duì)照組外，其余小鼠于實(shí)驗(yàn)第0天，在異氟烷麻醉狀態(tài)下予滴度為1×107PFU/mL的RSV病毒液80 μL滴鼻。小鼠感染后，各給藥組ig溶于0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）的相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig 0.5% CMC-Na，1次/d，連續(xù)4 d。末次給藥后禁食不禁水，次日處死小鼠，取樣備用。

2.2 肺組織HE染色

取各組小鼠肺組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片、脫蠟，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織炎癥情況。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)肺組織白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和RSV-F mRNA表達(dá)

取各組小鼠肺組織，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取RNA。使用蛋白核酸分析儀測(cè)定RNA濃度，根據(jù)HiScript III RT SuperMix for qPCR的說(shuō)明，依次進(jìn)行基因組DNA去除、配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，加熱得到cDNA。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說(shuō)明配制體系，加樣上機(jī)，使用QuantStudio 7 Flex系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增，數(shù)據(jù)采用2?ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，相關(guān)基因的引物序列見表1。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺組織壞死性凋亡情況

取各組小鼠肺組織，制備肺組織單細(xì)胞懸液，使用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞死亡形式，右上象限Annexin V（＋）和PI（＋）雙陽(yáng)性被定義為壞死性凋亡。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因引物序列 (5’-3’) β-actinF: GTATCCTGACCCTGAAGTACC R: TGAAGGTCTCAAACATGATCT IL-6F: CTCCCAACAGACCTGTCTATAC R: CCATTGCACAACTCTTTTCTCA TNF-αF: ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC R: GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA RSV-FF: TGAAAGTCCACCTCCTTACAGA R: CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG

2.5 ELISA檢測(cè)肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中LDH和HMGB1水平

取各組小鼠BALF，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定LDH和HMGB1水平。

2.6 Western blotting檢測(cè)肺組織RIP1、RIP3、MLKL、PGAM5和DRP1蛋白表達(dá)

取各組小鼠肺組織20 mg，加入200 μL RIPA裂解液和20 μL蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液混勻，研磨組織勻漿，提取肺組織的總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，等量蛋白加樣，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入RIP1抗體（1∶1000）、RIP3抗體（1∶1000）、MLKL抗體（1∶1000）、PGAM5抗體（1∶1000）、DRP1抗體（1∶1000）和GAPDH抗體（1∶3000），4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，使用ECL發(fā)光液對(duì)目的條帶進(jìn)行成像與分析。

2.7 免疫熒光檢測(cè)肺組織RIP1、RIP3、p-MLKL和E-cadherin蛋白表達(dá)

取各組小鼠肺組織石蠟切片，依次脫蠟、抗原修復(fù)、封閉；分別加入RIP1抗體（1∶200）、RIP3抗體（1∶200）、p-MLKL抗體（1∶200）和E-cadherin抗體（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜；PBS清洗后，滴加熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1 h，PBS清洗后，DAPI染核；用抗熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，結(jié)果以表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Tukey檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況和體質(zhì)量變化

對(duì)照組小鼠精神、毛發(fā)和活動(dòng)程度等無(wú)明顯異常變化。RSV感染小鼠出現(xiàn)飲水進(jìn)食減少、蜷縮少動(dòng)、擻毛等現(xiàn)象，而給藥組小鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)和食量均逐漸恢復(fù)，其中以黃酮類成分高劑量組恢復(fù)最好。RSV造模后每天監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量，如圖1所示，除對(duì)照組外，其余各組小鼠的體質(zhì)量均明顯降低，提示模型制備成功。小鼠在造模后第1天體質(zhì)量最低（＜0.01），給藥后略有促進(jìn)體質(zhì)量恢復(fù)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺部炎癥和病毒復(fù)制的影響

HE染色用于評(píng)估清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染小鼠肺組織病理的影響，如圖2-A所示，與對(duì)照組相比，RSV感染的小鼠肺組織充血、水腫，可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；而黃酮類成分及利巴韋林均能明顯改善上述病理特征，且黃酮類成分高劑量組療效優(yōu)于利巴韋林。

IL-6和TNF-α是重要的促炎介質(zhì)，能促進(jìn)RSV誘導(dǎo)的肺部炎癥進(jìn)展[11]。因此使用qRT-PCR檢測(cè)了肺組織中上述炎癥因子的表達(dá)水平，如圖2-B、C所示，模型組肺組織和mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高（＜0.01），而不同劑量的黃酮類成分均能有效降低上述炎癥因子mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01），提示黃酮類成分有較好的抗炎作用。RSV感染后，小鼠肺組織中可以檢測(cè)到特異性核酸，與模型組相比，不同劑量的黃酮類成分均可抑制的mRNA表達(dá)水平（圖2-D，＜0.05、0.01）。以上結(jié)果表明，清肺口服液黃酮類成分能夠改善RSV感染小鼠肺組織病理?yè)p傷，減輕肺部炎癥，抑制病毒復(fù)制。

A-小鼠體質(zhì)量連續(xù)變化 B-第1天各組小鼠體質(zhì)量 Fla-黃酮類成分 與對(duì)照組比較：##P＜0.01

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.3 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺組織壞死性凋亡的影響

壞死性凋亡是RSV感染中常見的細(xì)胞死亡方式之一。使用Annexin V/PI染料標(biāo)記肺組織單細(xì)胞混懸液，如圖3-A、B所示，RSV可以顯著增加Annexin V和PI雙陽(yáng)性率（＜0.01），提示RSV感染增加了肺組織細(xì)胞的壞死性凋亡，而黃酮類成分可以降低RSV感染后的壞死性凋亡（＜0.05、0.01）。

不同于凋亡，壞死性凋亡通常伴隨著嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)、HMGB1的釋放以及細(xì)胞膜的破壞[12]。如圖3-C所示，RSV誘導(dǎo)HMGB1大量釋放到BALF中（＜0.01），而黃酮類成分抑制了這一過(guò)程（＜0.05、0.01）。LDH可用于檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)膜的破壞，如圖3-D所示，黃酮類成分顯著降低RSV感染的小鼠BALF中LDH水平（＜0.01）。

圖3 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺組織細(xì)胞壞死性凋亡率 (A、B) 及BALF中HMGB1 (C)、LDH (D) 水平的影響(, n = 6)

3.4 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺組織RIP1/RIP3/MLKL通路蛋白表達(dá)的影響

盡管壞死性凋亡的分子機(jī)制尚未完全闡釋清楚，但RIP1/RIP3/MLKL已被證實(shí)是壞死性凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)[13]。為進(jìn)一步闡述清肺口服黃酮類成分抑制壞死性凋亡的具體機(jī)制，對(duì)上述蛋白進(jìn)行檢測(cè)。Western blotting結(jié)果（圖4）顯示，與對(duì)照組相比，RSV感染后肺組織中RIP1、RIP3、MLKL蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）。進(jìn)一步證實(shí)了RSV感染通過(guò)激活壞死性凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)，促進(jìn)肺組織細(xì)胞的壞死性凋亡，而黃酮類成分通過(guò)抑制RIP1/RIP3/MLKL通路減輕了RSV誘導(dǎo)的壞死性凋亡（＜0.05、0.01）。

3.5 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺組織RIP1/RIP3壞死復(fù)合物的影響

通過(guò)免疫熒光對(duì)肺組織中RIP1和RIP3的相互作用進(jìn)行檢測(cè)，如圖5所示，RIP1和RIP3的共定位提示RSV促進(jìn)了壞死復(fù)合物的形成，而黃酮類成分的干預(yù)降低了它們的共定位，抑制了RIP1和RIP3的相互作用。

3.6 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺上皮細(xì)胞p-MLKL蛋白表達(dá)的影響

MLKL磷酸化是細(xì)胞壞死性凋亡通路中不可或缺的步驟[14]，免疫熒光結(jié)果（圖6）顯示，RSV感染的小鼠肺組織中p-MLKL陽(yáng)性綠色信號(hào)明顯增加，黃酮類成分處理顯著抑制了p-MLKL的表達(dá)。肺上皮細(xì)胞是RSV感染的主要靶細(xì)胞，增加的p-MLKL染色主要與E-cadherin（上皮細(xì)胞的標(biāo)記物）共定位，這表明黃酮類成分降低了肺上皮細(xì)胞中p-MLKL的表達(dá)。

圖4 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺組織RIP1、RIP3和MLKL蛋白表達(dá)的影響(, n = 6)

圖5 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺組織中RIP1/RIP3壞死復(fù)合物形成的影響(×400)

圖6 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺組織p-MLKL蛋白表達(dá)的影響(×400)

3.7 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺組織PGAM5/DRP1蛋白表達(dá)的影響

RIP1/RIP3形成的壞死復(fù)合物可能通過(guò)誘導(dǎo)線粒體功能紊亂引起壞死性凋亡，這種紊亂涉及多種機(jī)制，如激活PGAM5和DRP1[15]。PGAM5被激活并移動(dòng)到線粒體外膜，繼而激活DRP1，導(dǎo)致線粒體裂變。PGAM5和DRP1在調(diào)節(jié)壞死性凋亡和線粒體功能中都發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步檢測(cè)參與壞死性凋亡的線粒體蛋白PGAM5和DRP1，如圖7所示，與對(duì)照組相比，RSV導(dǎo)致小鼠肺組織中PGAM5和DRP1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），給予黃酮類成分干預(yù)后PGAM5和DRP1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），提示黃酮類成分可能通過(guò)抑制PGAM5/DRP1減輕壞死性凋亡，改善線粒體功能。

4 討論

RSV嚴(yán)重威脅人類健康，尤其是對(duì)嬰幼兒、老年人及免疫功能缺陷患者，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前批準(zhǔn)用于RSV預(yù)防和治療的藥物分別為帕利珠單抗和利巴韋林[16]。但兩者均僅適用于RSV感染的高?；颊?，在療效和安全性方面存在爭(zhēng)議[17-18]。多項(xiàng)臨床研究試驗(yàn)證明清肺口服液治療RSV肺炎取得了顯著療效，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染的小鼠肺組織中檢測(cè)出病毒特異性核酸，肺組織病理充血水腫，炎性細(xì)胞因子水平明顯升高，提示該模型構(gòu)建成功；經(jīng)清肺口服液黃酮類成分治療后，、和的mRNA表達(dá)水平明顯降低，肺組織中炎性浸潤(rùn)減輕，說(shuō)明清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV導(dǎo)致的肺部炎癥具有改善作用。

圖7 清肺口服液黃酮類成分對(duì)RSV感染的小鼠肺組織PGAM5和DRP1蛋白表達(dá)的影響(, n = 6)

壞死性凋亡通常導(dǎo)致大量炎癥因子釋放[4]，是一種新型細(xì)胞死亡方式，在RSV肺炎的發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要的角色。壞死性凋亡表現(xiàn)為Annexin V和PI雙陽(yáng)性染色，伴隨著HMGB1的釋放以及細(xì)胞膜的破壞，而LDH釋放是細(xì)胞質(zhì)膜破壞的標(biāo)志[12]。越來(lái)越多研究顯示黃酮類成分具有減輕壞死性凋亡的作用，蘆丁能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路改善鎘誘導(dǎo)的肝臟損傷和壞死性凋亡[20]；橙皮苷能夠通過(guò)抑制RIP3/MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡，改善腸道上皮屏障損傷，從而緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[21]；槲皮素通過(guò)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）和NF-κB通路來(lái)抑制大鼠脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M1表型，從而減輕少突膠質(zhì)細(xì)胞的壞死性凋亡[22]。在本研究中，RSV誘導(dǎo)了肺組織細(xì)胞的壞死性凋亡，并導(dǎo)致HMGB1和LDH釋放到BALF中，而清肺口服液黃酮類成分可以減輕RSV感染后肺組織細(xì)胞的壞死性凋亡，并降低BALF中HMGB1、LDH水平。

壞死性凋亡通路是由RIP1激活啟動(dòng)的，隨后RIP1和RIP3形成壞死復(fù)合物，募集并磷酸化MLKL蛋白，損傷細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。MLKL的磷酸化和膜易位是壞死性凋亡的最終執(zhí)行者。RIP1抑制劑Nec-1可以減輕RSV誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞壞死性凋亡以及HMGB1釋放[23]。本研究結(jié)果顯示，清肺口服液黃酮類成分能夠減少RSV感染后肺組織中RIP1、RIP3、MLKL的表達(dá)，同時(shí)減少壞死復(fù)合物的形成，說(shuō)明清肺口服液黃酮類成分可以參與調(diào)節(jié)RIP1/RIP3/MLKL信號(hào)通路。肺上皮細(xì)胞是RSV感染的主要靶細(xì)胞，p-MLKL與上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的熒光共定位提示，清肺口服液黃酮類成分主要抑制了肺上皮細(xì)胞的壞死性凋亡。以上結(jié)果說(shuō)明清肺口服液黃酮類成分可以通過(guò)調(diào)控RIP1/RIP3/MLKL減輕RSV感染后肺上皮細(xì)胞的壞死性凋亡。

壞死性凋亡伴隨著細(xì)胞器的損傷，包括線粒體形態(tài)和功能障礙。線粒體蛋白PGAM5和DRP1激活后導(dǎo)致的線粒體裂變也促進(jìn)了壞死性凋亡[15]。抑制或敲低PGAM5表達(dá)可以通過(guò)抑制DRP1減少心肌細(xì)胞的壞死性凋亡，改善線粒體膜電位和活性氧，從而緩解心肌缺血/再灌注損傷[24]。本研究中，清肺口服液黃酮類成分可以降低RSV感染后小鼠肺組織中PGAM5和DRP1蛋白的表達(dá)，提示清肺口服液黃酮類成分可以通過(guò)調(diào)控PGAM5/DRP1，減輕RSV誘導(dǎo)的壞死性凋亡和線粒體功能紊亂。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)清肺口服液黃酮類成分可能通過(guò)抑制RIP1/RIP3/MLKL/PGAM5/DRP1介導(dǎo)的壞死性凋亡，從而減輕RSV導(dǎo)致的肺部炎癥損傷，也為清肺口服液的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of flavonoids in Qingfei Oral Liquid on necroptosis in RSV-infected mice

LING Xiao-ying, DING Ya-li, TAO Jia-lei, YUAN Bin

Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China

To explore the effect of flavonoids in Qingfei Oral Liquid (清肺口服液) on necroptosis in respiratory syncytial virus (RSV)-infected mice.BALB/c mice were randomly divided into control group, model group, flavonoids low-, high-dose (30, 60 mg/kg) groups and ribavirin (46 mg/kg) group. RSV-infected mice model was established. After continuous administration for 4 d, HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue; qRT-PCR was used to detect interleukin-6 (), tumor necrosis factor-α () andmRNA expressions in lung tissue; Flow cytometry was used to detect necroptosis rate of lung tissue cell; ELISA assay was used to detect lactate dehydrogenase (LDH) and high mobility group protein B1 (HMGB1) levels in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of mice; Western blotting was used to detect protein expressions of receptor-interacting protein 1 (RIP1), RIP3, mixed lineage kinase domain-like (MLKL), phosphoglycerate mutase 5 (PGAM5), dynamin-related protein 1 (DRP1) in lung tissue; Immunofluorescence was used to detect the co-localization of RIP1 and RIP3, co-localization of p-MLKL with epithelial cells.Compared with model group, pathological damage of lung tissue in flavonoids group was alleviated;,andmRNA expressions in lung tissue were decreased (< 0.05, 0.01); Necroptosis rate of lung tissue cells was decreased (< 0.05, 0.01); HMGB1 and LDH levels in BALF were decreased (< 0.05, 0.01); RIP1, RIP3, MLKL, PGAM5 and DRP1 protein expressions in lung tissue were decreased (< 0.05, 0.01); Formation of RIP1/RIP3 necrotic complex in lung tissue was decreased, fluorescence expression of p-MLKL in lung epithelial cells was decreased.Flavonoids in Qingfei Oral Liquid may inhibit necroptosis by regulating RIP1/RIP3/MLKL/PGAM5/DRP1 signaling pathway, and improve lung inflammation in RSV-infected mice.

Qingfei Oral Liquid; flavonoids; respiratory syncytial virus; necroptosis; receptor-interacting protein 1; receptor-interacting protein 3; mixed lineage kinase domain like pseudokinase; phosphoglycerate mutase 5; dynamin-related protein 1

R285.5

A

0253 - 2670(2022)13 - 4019 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.015

2022-03-23

國(guó)家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2019XZZX-ek003）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81873340）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82174436）；江蘇省研究生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYCX21_1647）

凌曉穎，博士研究生。E-mail: 295047667@qq.com

袁 斌，教授，主要從事中醫(yī)藥防治小兒肺系疾病的研究。E-mail: yfy0045@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]