基于TLR4/NF-κB/NLRP3和PI3K/Akt通路研究甘遂及其炮制品對水負(fù)荷小鼠的利尿作用及機制

寧晨旭，蘇曉娟，任可樂，劉曉琴，孟祥龍，趙彩蓉，趙泓瑜，王 娟，張朔生*

基于TLR4/NF-κB/NLRP3和PI3K/Akt通路研究甘遂及其炮制品對水負(fù)荷小鼠的利尿作用及機制

寧晨旭1, 2，蘇曉娟1, 2，任可樂1, 2，劉曉琴1, 2，孟祥龍1, 2，趙彩蓉1, 2，趙泓瑜1, 2，王 娟1, 2，張朔生1, 2*

1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619 2. 山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥炮制山西省重點實驗室，山西 晉中 030619

研究甘遂及其炮制品對水負(fù)荷小鼠的利尿作用及機制。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究甘遂的利尿作用機制。ICR小鼠給予甘遂及其炮制品后，ig大量生理鹽水建立水負(fù)荷模型，測定水負(fù)荷差值及臟器指數(shù)；取十二指腸及空腸，觀察病理變化；采用ELISA法測定小鼠血清中炎性因子指標(biāo)白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18、IL-4、IL-10及小腸組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（malondialdehyde，MDA）和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平；采用Western blotting測定小鼠小腸組織中Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、磷脂肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）蛋白表達。通過構(gòu)建“中藥-成分-疾病-通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)及通路富集分析得到甘遂及其炮制品主要通過參與氧化應(yīng)激反應(yīng)及PI3K/Akt等信號通路調(diào)節(jié)水腫。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，各給藥組小鼠水負(fù)荷差值在各個時間段均顯著升高（＜0.01）；血清中IL-1β、IL-18及小腸組織MDA水平均顯著降低（＜0.05、0.01），血清中IL-4、IL-10及小腸組織GSH水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；小腸組織TLR4、NLRP3、p-NF-κB/NF-κB、p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01）。在各給藥組中，1～6 h甘遂的利尿作用最強，醋甘遂和甘草制甘遂的利尿作用均有所緩解，說明甘遂經(jīng)炮制后會緩和其刺激性而平衡其利尿作用。甘遂及其炮制品對水負(fù)荷小鼠均可以不同程度地抗水負(fù)荷并產(chǎn)生利尿作用，并可以通過抑制TLR4通道介導(dǎo)的NF-κB/NLRP3信號通路及PI3K/Akt信號通路從而抑制IL-1β和IL-18的表達。

甘遂；甘草制甘遂；醋甘遂；水負(fù)荷模型；炎性細(xì)胞因子；磷脂肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路；NOD樣受體蛋白3

甘遂是大戟科植物甘遂T. N. Liou ex T. P. Wang的干燥塊根，其性苦味寒，有毒，具有瀉水逐飲、消腫散結(jié)的功效，傳統(tǒng)臨床常用來治療水腫脹滿、胸腹積水、痰飲積聚、氣逆咳喘、二便不利，現(xiàn)代臨床常用于治療肝硬化腹水及胰腺炎等。甘遂主要含有大戟二烯醇、表大戟二烯醇、巨大戟醇、甘遂萜酯A及甘遂萜酯B等萜類成分[1-2]。甘遂臨床上常利用利尿作用治療水腫、臌脹、胸脅停飲及其引起的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)。生甘遂雖然利尿作用明顯，但甘遂的生品具有強烈的刺激性。依據(jù)中藥傳統(tǒng)炮制理論，中藥經(jīng)炮制后會減毒增效，故臨床常應(yīng)用甘遂醋制品及甘草制品來減緩甘遂的刺激性。生甘遂經(jīng)醋制后會降低其毒副作用并緩解其刺激性[3]。清代的《外科證治全生集》認(rèn)為甘遂經(jīng)甘草制可以祛其苦寒之性[4]。本課題組前期應(yīng)用熱重-微商熱重技術(shù)模擬炮制過程，從定性角度闡釋醋炙甘遂的整體化學(xué)成分變化規(guī)律；運用響應(yīng)曲面法，優(yōu)選出醋甘遂的最佳炮制工藝，并從抗炎因子、促炎因子水平的角度初步探究甘遂醋炙后的利尿作用以及醋炙后毒性的變化及其炮制減毒的機制；依據(jù)甘遂不同提取部位受熱過程中揮發(fā)成分的動態(tài)變化來確定甘遂炮制的最佳炮制溫度點（即炮制火力），以CCK-8和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測法來篩選生甘遂毒性部位[3]；運用響應(yīng)曲面法優(yōu)選甘草制甘遂的炮制工藝[5-6]?，F(xiàn)代研究中以醋甘遂研究居多，而甘草制甘遂研究居少。

水腫激發(fā)炎性通路進而抑制利尿作用[7-8]。NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體對眾多抗炎因子、促炎因子的表達起到至關(guān)重要的作用，磷脂肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）在炎癥細(xì)胞的遷移中也有很重要的作用，蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）是PI3K的直接靶蛋白，PI3K/Akt信號通路也是常見的炎性信號通路[9-10]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）上游蛋白激發(fā)NLRP3炎性小體，從而促進促炎因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的釋放，而PI3K/Akt信號通路的激活也可能會直接促進IL-1β和IL-18的釋放。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[11]方法對甘遂的瀉水逐飲機制進行分析，并基于PI3K/Akt及TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路對生甘遂、醋甘遂及甘草制甘遂3個炮制品進行藥效驗證實驗，探究甘遂利尿的作用機制。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http://tcmspw. com/tcmsp.php）；Swisstargetsprediction（http://www. swisstargetprediction.ch/）；人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www.genecards.org/）；美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI，https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）；String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/ input.pl）；Venny 2.1軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/index.html）；Cytoscape 3.8.0軟件（http:// cytoscape.org）。

1.2 動物

清潔級ICR雄性小鼠96只，體質(zhì)量（20±3）g，7周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物批號110324200103969947，實驗動物許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制省重點實驗室動物房，溫度（24±1）℃，濕度（50±10）%，自由進食飲水，光照條件保持晝夜交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。動物實驗經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2019LL201）。

1.3 藥材

生甘遂（批號20200909）、甘草（批號20190807）購自山西和仁堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)張朔生教授鑒定分別為大戟科植物甘遂T. N. Liou ex T. P. Wang的干燥塊根、豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖。

1.4 藥品與試劑

米醋購自山西紫林醋業(yè)有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號20190201）購自天津百倫斯生物技術(shù)有限公司；呋塞米（批號2003022）購自天津力生制藥股份有限公司；小鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號30369）、小鼠IL-4 ELISA試劑盒（批號MU30385）、小鼠IL-18 ELISA試劑盒（批號MU30380）、小鼠IL-10 ELISA試劑盒（批號MU30380）、小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA試劑盒（批號MU30447）、小鼠還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）ELISA試劑盒（批號MU30932）、TLR4抗體（批號BS3489）、NF-κB p65抗體（批號BS1253）、p-NF-κB p65抗體（批號AP0475）購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號20190711）購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇（批號20191023）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二甲苯（批號200926）購自天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；石蠟（批號20180725）購自北京北化康泰臨床試劑有限公司；PI3K抗體（批號BS3678）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）抗體（批號AP0153）、Akt抗體（批號BS1810）、p-Akt抗體（批號BS4006）、β-actin抗體（批號AP0060）購自Bioworld Technology公司；NLRP3抗體（批號BA3677）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔單克隆抗體（批號BA1054）、增強型RIPA裂解液（批號AR0102-500）、廣譜磷酸酶抑制劑混合物（批號AR1195）、蛋白質(zhì)抑制劑PMSF（批號AR1178），麗春紅染色液（批號AR0142-100）、5×蛋白上樣緩沖液（批號AR1112-10）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 儀器

Histocentre 3型石蠟包埋機、Finesse 325型石蠟切片機、系統(tǒng)全自動組織脫水機（英國Shandon有限公司）；BX53型熒光顯微成像（日本Olympus公司）；DM6000B型生物顯微鏡（德國Leica公司）；U3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；AX224ZH/E型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；TGL16M型高速冷凍離心機（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；DNM9602型酶標(biāo)儀、GeneGnome成像系統(tǒng)（基因有限公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.1.1 甘遂活性成分及水腫靶點的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進行甘遂活性成分的篩選，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，將篩出的活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swisstargets數(shù)據(jù)庫中進行靶點預(yù)測[12]。在GeneCards數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫進行人類基因檢索，篩選得到水腫相關(guān)靶點。

2.1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）構(gòu)建、GO功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路通路富集分析 將活性成分和疾病的共有的靶點輸入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將共有靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫，篩選校正值≤0.05的條目。

2.2 實驗驗證

2.2.1 醋甘遂及甘草制甘遂的制備 醋甘遂及甘草制甘遂均按本課題組通過響應(yīng)曲面優(yōu)化而得的工藝進行炮制：醋甘遂最佳炮制工藝為加醋量為31.54%，270 ℃炒制3.5 min；甘草制甘遂的最佳炮制工藝為加甘草汁的量為27%，干燥溫度為180 ℃，干燥時間為11 min。按照《中國藥典》2020年版方法分別測定甘遂生品、醋甘遂及甘草制甘遂中的大戟二烯醇含量[13]，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（0.230 50±0.043 72）、（0.122 00±0.018 12）、（0.144 60±0.030 80）mg/g。《中國藥典》2020年版規(guī)定甘遂含大戟二烯醇（C30H50O）不得少于0.12%，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

2.2.2 分組、造模及給藥 根據(jù)《中國藥典》2020年版確定人的給藥劑量為0.5～15.0 g[13]，按照《中藥藥理研究方法學(xué)》（第3版）[14]中小鼠與人的等效劑量比值為9.1進行換算，并依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，ICR雄性小鼠隨機分為對照組、模型組、呋塞米（15 mg/kg）組及甘遂高、中、低劑量（300、150、75 mg/kg）組及醋甘遂高、中、低劑量（300、150、75 mg/kg）組和甘草制甘遂高、中、低劑量（300、150、75 mg/kg）組。呋塞米及甘遂不同炮制品的粉末用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解。對照組和模型組ig 0.2 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉，各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥前禁食24 h，給藥1 h后，輕輕按壓小鼠腹部使其排盡余尿，模型組和各給藥組小鼠ig 1 mL生理鹽水造模，即刻稱定體質(zhì)量作為水負(fù)荷零時體質(zhì)量，在水負(fù)荷實驗后1、2、4、6 h后稱定體質(zhì)量，作為水負(fù)荷實時體質(zhì)量，計算水負(fù)荷差值。

水負(fù)荷差值＝水負(fù)荷零時體質(zhì)量－水負(fù)荷實時體質(zhì)量

2.2.3 十二指腸及空腸病理變化 實驗結(jié)束后，取各組小鼠十二指腸及空腸，于10%福爾馬林液中固定48 h，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、4 μm切片后，進行HE染色，透明并封片后，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.4 血清炎性因子水平的檢測 實驗結(jié)束后，用采血管收集各組小鼠血液，室溫凝固30 min，10 000 r/min離心15 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書測定血清IL-1β、IL-18、IL-4和IL-10水平。

2.2.5 小腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA及GSH水平的檢測 取小鼠小腸組織，用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。稱定小腸組織質(zhì)量，剪碎后加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）于冰上勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心5～10 min，取上清，于?20 ℃或?80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書測定MDA及GSH水平。

2.2.6 小腸組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達 取小鼠小腸組織100 mg，加入1 mL增強型RIPA裂解液勻漿，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉3 h，用TBST溶液洗3次；分別加入p-PI3K抗體（1∶500）、PI3K抗體（1∶500）、p-Akt抗體（1∶500）、Akt抗體（1∶500）、TLR4抗體（1∶500）、NLRP3抗體（1∶500）、NF-κB抗體（1∶500）和β-actin抗體（1∶5000），4 ℃靜置過夜，TBST 溶液洗3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2000），室溫孵育1 h，TBST洗3次后顯影，將PVDF膜進行掃描，采用Image J圖像分析軟件測定目的條帶灰度值。

2.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphpad Prism 8軟件進行統(tǒng)計并作圖，實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布并用來表示，采用單因素方差分析并經(jīng)過方差齊性檢驗及組間檢驗。

3 結(jié)果

3.1 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠利尿作用的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠水負(fù)荷差值在各個時間段均顯著升高（＜0.01），說明水負(fù)荷模型造模成功；與模型組比較，呋塞米組水負(fù)荷差值在各個時間段均顯著升高（＜0.01）；1、2、6 h后，甘遂、醋甘遂及甘草制甘遂高、中劑量組水負(fù)荷差值均顯著高于模型組（＜0.01）；4 h時，甘遂及醋甘遂高、中劑量和甘草制甘遂各劑量組水負(fù)荷差值顯著高于模型組（＜0.01）。

表1 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠利尿作用影響(, n = 8)

Table 1 Effect of different processed products of Kansui Radix on diuretic effect of water-loaded mice (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)水負(fù)荷差值/g 1 h2 h4 h6 h 對照—0.22±0.020.23±0.010.27±0.050.37±0.04 模型—0.81±0.12##1.23±0.05##1.23±0.05##2.20±0.09## 呋塞米151.76±0.05**2.77±0.50**3.30±0.11**3.75±0.09** 甘遂3001.73±0.09**2.86±0.74**3.36±0.19**3.71±0.10** 1502.46±0.32**2.85±0.34**3.50±0.07**3.90±0.40** 750.53±0.131.34±0.111.45±0.132.12±0.33 醋甘遂3001.53±0.36**1.95±1.52**2.48±0.20**3.31±0.25** 1501.46±0.12**2.35±0.35**3.06±0.06**3.42±0.15** 750.70±0.100.90±0.121.10±0.162.15±0.31 甘草制甘遂3001.84±0.10**2.66±1.08**3.15±0.03**3.85±0.17** 1501.55±0.13**2.15±1.70**3.00±0.17**3.57±0.14** 750.79±0.131.54±0.222.32±0.19**2.56±0.32

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，表2～4同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as tables 2—4

3.2 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠臟器指數(shù)的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組腎、胃、小腸的臟器指數(shù)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，醋甘遂高劑量組和甘草制甘遂高劑量組小鼠的胃臟指數(shù)顯著升高（＜0.05、0.01），說明醋甘遂高劑量組及甘草制甘遂高劑量組可能對受損傷的胃有治療作用，表明甘遂炮制可增強療效；甘遂高、中劑量組及醋甘遂高、中劑量組和甘草制甘遂各劑量組小腸指數(shù)均顯著高于模型組（＜0.05、0.01），而甘草制甘遂高劑量組及醋甘遂高劑量的小腸指數(shù)要高于甘遂高劑量組的小腸指數(shù)，說明甘遂經(jīng)炮制后可能會降低對小腸的刺激性，從而提高小腸指數(shù)。

3.3 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠十二指腸和空腸病理變化的影響

如圖1所示，對照組小鼠十二指腸與空腸黏膜完整，且無增生。模型組十二指腸絨毛增生、肥大，黏膜層增厚伴有腸黏膜層壞死；空腸絨毛增生、肥大，充滿整個腸腔，黏膜層增厚，局部性壞死并伴有腸萎縮，說明急性水負(fù)荷模型造模成功，導(dǎo)致小鼠水腫并伴有炎癥。呋塞米組小鼠十二指腸絨毛輕度損壞，空腸輕度增生。甘遂高劑量組十二指腸絨毛增生，空腸黏膜組增厚，腸腔消失，甘遂中劑量組腸絨毛增生，空腸絨毛增生；甘遂低劑量組十二指腸和空腸絨毛增生，腸粘連；醋甘遂高劑量組十二指腸絨毛輕度損壞，空腸黏膜和腸腺增生；醋甘遂中劑量組十二指腸和空腸的黏膜輕度損壞；醋甘遂低劑量組絨毛增生并有一定程度的損壞，空腸絨毛輕度增生肥大；甘草制甘遂高劑量組十二指腸和空腸絨毛增生伴有腸萎縮；甘草制甘遂中劑量十二指腸絨毛增生充滿腸腔，空腸基本正常；甘草制甘遂低劑量組十二指腸和空腸絨毛增生充滿腸腔，腸萎縮腸腔消失。

表2 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠臟器指數(shù)的影響(, n = 8)

Table 2 Effect of different processed products of Kansui Radix on organ index of water loaded mice (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)臟器指數(shù)/(mg·g?1) 腎胃小腸 對照—22.52±1.699.36±0.3143.55±2.98 模型—15.68±1.57##6.56±1.10##24.42±2.12## 呋塞米1517.47±1.718.10±0.9033.32±2.81** 甘遂30016.96±1.417.00±0.5531.54±1.88** 15016.36±1.276.76±0.9232.00±2.23** 7515.94±1.317.19±0.9527.17±3.90 醋甘遂30016.90±1.578.86±1.03*38.98±1.55** 15016.69±1.917.31±0.7329.87±3.24* 7516.44±1.717.34±0.9232.77±2.62 甘草制甘遂30016.59±1.169.13±1.45**39.96±2.46** 15016.62±1.407.74±1.0931.06±3.04* 7516.91±1.007.76±1.1131.16±3.66*

圖1 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠十二指腸(A) 和空腸(B) 病理變化的影響(HE, ×200)

3.4 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠血清IL-1β、IL-18、IL-4和IL-10水平的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β和IL-18水平顯著升高（＜0.01），IL-4和IL-10水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組血清中IL-18水平顯著降低（＜0.05、0.01），IL-10水平顯著升高（＜0.05、0.01）；除甘遂高劑量組和甘草制甘遂低劑量組外，其余各組血清中IL-1β水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；甘遂中劑量組、醋甘遂高劑量組和甘草制甘遂高、中劑量組血清中IL-4水平顯著升高（＜0.05、0.01）。在各給藥組中，炮制品組的IL-1β、IL-18水平低于生品組，IL-4、IL-10水平高于生品組。在炮制品組中，甘草制甘遂組的IL-1β、IL-18、IL-4及IL-10水平與醋甘遂無顯著差異。

3.5 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠小腸組織MDA和GSH水平的影響

如表4所示，與對照組比較，模型組小鼠小腸氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平顯著升高（＜0.01），GSH水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，除甘遂高劑量組外，其余各給藥組MDA水平均顯著降低（＜0.05、0.01），GSH水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

表3 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠血清IL-1β、IL-18、IL-4和IL-10水平的影響(, n = 8)

Table 3 Effect of different processed products of Kansui Radix on IL-1β, IL-18, IL-4and IL-10 levels in serum of water loaded mice (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)IL-1β/(pg·mL?1)IL-18/(pg·mL?1)IL-4/(pg·mL?1)IL-10/(pg·mL?1) 對照—244.10±12.82256.20±29.14157.00±8.71162.00±7.43 模型—351.00±25.62##448.90±32.14##114.20±4.41##115.10±3.10## 呋塞米15313.10±18.92*347.40±31.68**137.80±6.91**130.30±3.47* 甘遂300334.20±20.27385.00±18.96*116.00±1.77128.40±10.75* 150278.20±7.26**333.10±37.91**131.10±9.18*132.30±10.54* 75262.10±25.77**300.80±45.15**124.00±2.56130.90±5.04* 醋甘遂300250.70±13.12**262.10±28.81**130.40±7.25*142.30±3.48** 150254.50±24.18**281.00±31.46**124.60±5.41138.60±4.87** 75279.60±21.56**302.60±29.13**123.50±4.21126.80±2.76* 甘草制甘遂300278.30±20.36**264.00±36.47**138.80±4.79**150.20±8.28** 150290.90±26.98**286.60±36.33**136.10±4.74*142.20±5.49** 75299.70±23.96302.40±38.28**120.30±8.71128.20±8.79*

表4 甘遂不同炮制品對水負(fù)荷小鼠小腸組織MDA和GSH水平的影響(, n = 8)

Table 4 Effect of different processed products of Kansui Radix on MDA and GSH levels in small intestinal of water loaded mice (, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)MDA/(nmol·L?1)GSH/(μg·mL?1) 對照—142.50±15.852.78±0.18 模型—452.30±29.42##1.94±0.11## 呋塞米15388.50±28.26*2.28±0.17* 甘遂300424.80±33.132.04±0.20 150364.70±18.97**2.12±0.07** 75357.80±22.25**2.31±0.07** 醋甘遂300321.20±27.72**2.45±0.18** 150368.60±25.34**2.44±0.11** 75382.20±34.69*2.00±0.14* 甘草制甘遂300342.30±33.41**2.54±0.05** 150367.50±30.84**2.30±0.06** 75372.30±20.52*2.05±0.10**

3.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析

甘遂獲得8個活性成分，347個靶點。甘遂瀉水逐飲的活性成分主要有大戟二烯醇（euphol）、多根烏頭堿（karacolidine）及甘遂醇（kanziol）等（表5）。以“Edema”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫和NCBI基因數(shù)據(jù)庫進行人類基因檢索，共得到1334個水腫相關(guān)基因。將篩選出的靶點與疾病靶點輸入Venny 2.1軟件，得到111個共有靶點，作為藥物作用于疾病的預(yù)測靶點（圖2）。將藥物和疾病的共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，得到PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3-A、B），該網(wǎng)絡(luò)中有111個節(jié)點、1015條邊，平均度值為18.3。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.8.0，通過NetworkAnalyzer工具進行拓?fù)浞治?，以度值為參考?biāo)準(zhǔn)，通過度值排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點，共選出40個關(guān)鍵靶點，將前20個靶點使用R3.6.3進行圖片繪制，橫坐標(biāo)為每個靶點的度值（圖3-C）。將成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中進行拓?fù)浞治觯瑢⒊煞诌M行度值排序，度值越高說明成分越重要，構(gòu)建成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制（圖4）。甘遂瀉水逐飲的成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖顯示關(guān)鍵靶點主要包括：有絲分裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、MAPK1、MAPK8等。MAPK3、MAPK1、MAPK8屬于細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)機制的關(guān)鍵靶點，CASP3與NLRP3炎性小體密切相關(guān)。將共有靶點進行GO功能分析，引用String數(shù)據(jù)庫，篩選校正值≤0.05的條目，總共富集到1533條生物過程，110條分子功能，61條細(xì)胞組成，使用R 3.6.3軟件繪制柱狀圖（圖5-A）。將共有靶點進行KEGG通路富集分析，使用String數(shù)據(jù)庫，篩選校正值≤0.05的條目，總共富集到134條信號通路，使用R 3.6.3繪制柱狀圖（圖5-B）。將中藥-成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制（圖6），甘遂中的活性成分主要作用于PI3K/Akt信號通路、癌癥信號通路、RAS信號通路、RAS相關(guān)蛋白1（Ras related protein 1，RAP1）信號通路以及缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factors，HIF）信號通路。PI3K/Akt信號通路、RAS及HIF信號通路同為炎性通路，RAS信號通路與PI3K/Akt信號通路也有一定的相關(guān)性，在一定程度上可以參與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路。

表5 甘遂活性成分

Table 5 Active ingredients in Kansui Radix

編號化合物名稱OB/%DL MOL002587euphorbetin35.890.54 MOL002588(3S,5R,10S,13R,14R,17R)-17-[(1R)-1,5-dimethyl-4-methylenehexyl]-4, 4,10,13,14-pentamethyl-2,3,5,6,7, 11,12,15,16,17-decahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol42.370.77 MOL002590karacolidine60.530.71 MOL002593kansuinin A44.520.55 MOL002597euphol42.120.75 MOL00259820-OD-ingenol Z32.050.85 MOL002599kanziol41.650.75 MOL0026033-O-(2,3-dimethylbutanoyl)-13-O-dodecanoyl-20-deoxyingenol30.820.65

圖2 甘遂活性成分與水腫靶點的Venn圖

綜上所述，本研究經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)甘遂瀉水逐飲的活性成分包含大戟二烯醇及甘遂醇，通過拓?fù)浞治龈仕斓年P(guān)鍵靶點有MAPK3、CASP3及EGFR等，而通過GO功能及KEGG通路分析預(yù)測出的信號通路主要為PI3K-Akt信號通路及RAS等信號通路。MAPK超家族包括Janus激酶（Janus kinase，JNK）/應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）、大絲裂原活化蛋白激酶1（big mitogen-activated protein kinase l，BMK1）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases 5，ERK5）和p38 MAPK等家族。其中JNK/SAPK和p38 MAPK主要對炎癥因子和多種細(xì)胞的應(yīng)激信號進行傳導(dǎo)。MAPK是細(xì)胞反應(yīng)機制的一部分，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中起著重要作用。CASP3在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著關(guān)鍵作用。EGFR對腫瘤細(xì)胞的繁殖、生長、修復(fù)和存活等起著重要作用。RAS信號通路可能與慢性腎炎有一定的相關(guān)性。PI3K/Akt信號通路及這些關(guān)鍵靶點基因均與炎癥因子相關(guān)，說明甘遂的利尿作用與炎性因子的表達有關(guān)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖 (A、B) 和拓?fù)浞治鰣D(C)

紫色為中藥，綠色為活性成分，淡紫色為藥物作用于疾病的靶點，紅色矩形為疾病

圖5 GO功能(A) 和KEGG通路(B) 富集分析

紫色為中藥，藍色為化合物，黃色為中藥作用于疾病的靶點，綠色為最顯著的前20條通路，紅色為疾病

3.7 實驗驗證

3.7.1 TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路相關(guān)蛋白表達 如圖7-A～D所示，與對照組比較，模型組小鼠小腸組織TLR4、NLRP3和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小腸組織TLR4、NLRP3和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01），說明甘遂生品及各個炮制品均可不同程度地抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路。

3.7.2 PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達 如圖7-E～G所示，與對照組比較，模型組小鼠小腸組織p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，呋塞米組、甘遂高劑量組、醋甘遂各劑量組及甘草制甘遂高劑量組小腸組織p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01），說明甘遂生品及各個炮制品均可不同程度地抑制PI3K/Akt信號通路。

4 討論

根據(jù)中醫(yī)藥的基本理論，甘遂為瀉水逐飲的要藥，且治療水腫具有明顯的療效。但目前關(guān)于甘遂瀉水逐飲的機制尚不清楚。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進行系統(tǒng)研究，旨在探索甘遂瀉水逐飲的作用機制，并通過體內(nèi)水負(fù)荷實驗對甘遂不同炮制品的瀉水逐飲作用機制進行驗證。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選出甘遂瀉水逐飲的活性成分主要有千金子素（euphorbetin）、(3,5,10,13,14,17)-17-[(1)-1,5- dimethyl-4-methylenehexyl]-4,4,10,13,14-pentamethyl- 2,3,5,6,7,11,12,15,16,17-decahydro-1-cyclopenta[a] phenanthren-3-ol、甘遂萜酯A（kansuinin A）、大戟二烯醇（euphol）、多根烏頭堿（karacolidine）和甘遂醇（kanziol）。千金子素會導(dǎo)致腸道脂褐素和活性氧的堆積，從而引起腸道毒性[15]。甘遂萜酯A在體內(nèi)外均具有抗腫瘤的作用[16]。大戟二烯醇作為一種四環(huán)三萜，可誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬，對腸上皮細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性，是甘遂中既具有抗癌作用又具有細(xì)胞毒性的毒效活性成分[17]。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

根據(jù)GO功能富集分析顯示，關(guān)鍵靶點關(guān)聯(lián)的生物學(xué)過程有氧化應(yīng)激反應(yīng)、MAPK活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育。根據(jù)KEGG通路富集分析顯示，甘遂中的活性成分主要作用于PI3K/Akt信號通路、癌癥信號通路、RAS信號通路、RAP1信號通路以及HIF信號通路。以上通路都和炎癥反應(yīng)相關(guān)，研究表明，PI3K/Akt信號通路是產(chǎn)生水腫的重要通路，并且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[18-19]。PI3K/Akt信號通路的核心成分為PI3K和Akt蛋白，PI3K蛋白由1個催化亞基和1個調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成。Akt蛋白是一類PH結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞未受信號刺激時，游離于細(xì)胞質(zhì)。因此推測甘遂的活性成分可能通過PI3K/Akt/NLRP3/NF-κB或者直接影響NLRP3炎性小體信號通路介導(dǎo)炎癥，下調(diào)Caspase-1蛋白，抑制IL-1β前體成為IL-1β。

本研究結(jié)果顯示，對照組水負(fù)荷差值6 h內(nèi)并無明顯變化，而甘遂高、中劑量組及醋甘遂高、中劑量組和甘草制甘遂高、中劑量組水負(fù)荷差值均有明顯上升的趨勢，而甘遂低劑量組、醋甘遂低劑量組以及甘草制甘遂低劑量組水負(fù)荷差值在1～2 h有明顯的上升的趨勢，而在2～4 h水負(fù)荷差值則趨于平緩，但在6 h內(nèi)，甘遂低劑量組、醋甘遂低劑量組以及甘草制甘遂低劑量水負(fù)荷差值總體仍為上升的趨勢。1～6 h，甘遂的利尿作用最強，醋甘遂和甘草制甘遂的利尿作用均有緩解，而醋甘遂和甘草制甘遂相比并無顯著差異。

IL-1β和IL-18屬于促炎因子，IL-4和IL-10屬于抗炎因子。IL-1β和IL-18的釋放與NLRP3炎性小體的激活息息相關(guān)[20]。NLRP3炎性小體是一種大分子蛋白質(zhì)混合體。IL-1β和IL-18的釋放有2種途徑激發(fā)，一種是由NF-κB等上游蛋白激發(fā)NLRP3炎性小體，從而促進IL-1β和IL-18的釋放；另一種直接觸發(fā)NLRP3炎性小體，導(dǎo)致Casepase-1的活化，而將IL-1β和IL-18前體進行切割，最終產(chǎn)生IL-1β和IL-18。IL-4和IL-10主要是由Th2細(xì)胞分泌而來，且能促進Th2細(xì)胞的分化[21]。IL-4可以誘導(dǎo)B細(xì)胞轉(zhuǎn)換成免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE），并且上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）II類的產(chǎn)生。IL-10可以通過活化的巨噬細(xì)胞來抑制炎性因子的產(chǎn)生[22]。機體小腸發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時，氧化最終產(chǎn)物為MDA，會引起蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合并具有細(xì)胞毒性。MDA可以反映機體小腸的過氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度[23-24]。GSH是機體主要的抗氧化巰基物質(zhì)，這2個指標(biāo)能夠反映機體小腸組織的氧化還原狀態(tài)[25-26]。

體內(nèi)實驗表明甘遂的不同炮制品對水負(fù)荷小鼠均有較強的利尿作用，甘遂瀉下作用最強。ICR小鼠短時間ig大量生理鹽水可引起小腸的局部水腫并促進炎癥因子的表達，因而進一步驗證甘遂瀉水逐飲的作用與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，甘遂的不同炮制品中，甘遂生品組炎性因子表達高于其他炮制品，而甘遂醋制品與甘草制品的炎性因子表達并無顯著差異，甘遂及其炮制品均顯著抑制TLR4/NF-κB/NLRP3和PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達，說明甘遂通過醋制及甘草制均會抑制炎性蛋白信號通路進而減少其炎性因子的表達（圖8）。

圖8 甘遂不同炮制品通過抑制TLR4通道介導(dǎo)的NF-κB/NLRP3及PI3K/Akt信號通路從而抑制炎性因子表達

綜上所述，甘遂及其炮制品對水負(fù)荷小鼠均可以不同程度地抗水負(fù)荷并產(chǎn)生利尿作用，并可以通過抑制TLR4通道介導(dǎo)NF-κB/NLRP3信號通路及PI3K/Akt信號通路從而抑制炎性因子的表達。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Diuretic effect and mechanism ofand its prepared products on water-loaded mice through TLR4/NF-κB/NLRP3 and PI3K/Akt signaling pathways

NING Chen-xu1, 2, SU Xiao-juan1, 2, REN Ke-le1, 2, LIU Xiao-qin1, 2, MENG Xiang-long1, 2, ZHAO Cai-rong1, 2, ZHAO Hong-yu1, 2, WANG Juan1, 2, ZHANG Shuo-sheng1, 2

1. College of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China 2. Key Laboratory of Chinese Medicine Processing in Shanxi Province, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China

To study the diuretic effect and mechanism of Gansui () and its prepared products on water-loaded mice.Diuretic effects ofwas explored by network pharmacology. After ICR mice were givenand its processed products, a large amount of normal saline was used to establish a water load model, water load difference and organ index were measured; Duodenum and jejunum were taken to observe the pathological changes; ELISA method was used to measure levels of inflammatory factor indicators interleukin-1β (IL-1β), IL-18, IL-4, IL-10 in serum and oxidative stress indicators malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) in small intestinal tissue; Western blotting was used to measure protein expressions of Toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear factor-κB (NF-κB), NOD-like receptor protein 3 (NLRP3), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) and protein kinase B (Akt) in small intestinal tissue.and its processed products mainly regulated edema by participating in oxidative stress response and PI3K/Akt and other signaling pathways through the construction of “traditional Chinese medicine-ingredient-disease-pathway-target” network and pathway enrichment analysis. The results ofexperiments showed that compared with model group, water load difference of mice in each administration group was significantly increased at each time period (< 0.01); Levels of IL-1β, IL-18 in serum and MDA in small intestinal tissue were significantly decreased (< 0.05, 0.01), levels of IL-4, IL-10 in serum and GSH in small intestinal tissue were significantly increased (< 0.05, 0.01); TLR4, NLRP3, p-NF-κB/NF-κB, p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt protein expressions in small intestinal tissue were significantly decreased (< 0.01). In each administration group, diuretic effect ofwas the strongest at 1—6 h, and diuretic effect of vinegarandetprocessedwere relieved, indicating that processedwould ease its irritation and balance its diuretic effect.and its prepared products can resist water load to different degrees and produce diuretic effect on water-loaded mice, and inhibit IL-1β and IL-18 expressions through NF-κB/NLRP3 signaling pathway and PI3K/Akt signaling pathway mediated by TLR4 channel.

;etprocessed; vinegar; water-loaded model; inflammatory cytokines; phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B signaling pathway; NOD-like receptor protein 3

R285.5

A

0253 - 2670(2022)13 - 4007 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.014

2021-12-30

山西應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃面上自然科學(xué)基金資助項目（201901D111342）；山西省中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制學(xué)科建設(shè)項目（2018-1）；山西省中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制與方藥配伍研究科技創(chuàng)新團隊（2018TD-006）

寧晨旭，碩士研究生，研究方向為中藥炮制現(xiàn)代研究。E-mail: sunshine213112@163.com

張朔生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制現(xiàn)代研究。E-mail: zhangshuosheng@aliyun.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]