鞣花酸納米混懸劑的制備、表征及其體內藥動學研究

秦芳芳，彭有梅，蘇海波，高守甲

鞣花酸納米混懸劑的制備、表征及其體內藥動學研究

秦芳芳1，彭有梅2，蘇海波3*，高守甲3

1. 鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007 2. 河南省醫(yī)藥科學研究院，河南 鄭州 450052 3. 上海雷允上有限公司技術中心，上海 201401

制備鞣花酸納米混懸劑（ellagic acid nanosuspensions，EA-NPs），并考察在SD大鼠體內的藥動學特征。采用高壓均質法制備EA-NPs。在單因素實驗基礎上，以穩(wěn)定劑與藥物用量比例、均質壓力、均質次數(shù)為主要影響因素，粒徑和多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）為考察指標，采用Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化EA-NPs制備工藝。采用透射電子顯微鏡（TEM）和X射線粉末衍射（XRPD）對EA-NPs進行表征，透析袋法考察體外釋藥情況。SD大鼠分別ig給予鞣花酸混懸液、物理混合物（比例同EA-NPs）和EA-NPs，HPLC法測定大鼠血漿中的鞣花酸質量濃度，并計算主要藥動學參數(shù)。EA-NPs的最處方工藝：以磷脂-聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）K30（2∶3）為穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑與藥物比例4∶1，制備溫度為25 ℃，均質壓力73 MPa，均質次數(shù)為11次。EA-NPs呈球形或類球形，粒徑為70～400 nm，平均粒徑為（148.16±7.61）nm，PDI為0.089±0.014，ζ電位為（?29.64±1.82）mV。鞣花酸在EA-NPs中以無定形狀態(tài)存在，6 h內藥物的累積釋放率為96.24%。藥動學結果顯示，EA-NPs的半衰期（1/2）延長至（3.17±0.64）h，達峰濃度（max）提高至（1 172.04±182.51）ng/mL，相對口服生物利用度提高至5.61倍。EA-NPs可促進藥物體外溶出，提高鞣花酸在大鼠體內的口服生物利用度。

鞣花酸；納米混懸劑；Box-Behnken設計-效應面法；表征；溶出；藥動學；高壓均質法；生物利用度

鞣花酸是沒食子酸的二聚衍生物，是一種多酚二內酯，廣泛存在于石榴、草莓和五倍子等植物中[1]，在石榴皮中含量較高。研究顯示[2-5]，鞣花酸具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、消炎、抗過敏、抗纖維化、調節(jié)雌激素分泌等藥理活性。鞣花酸在水中溶解度僅為9.81 μg/mL[6]，溶出度低，且藥物本身滲透性差[7]，導致口服吸收生物利用度較低，不利于藥效的發(fā)揮及臨床應用。目前有研究者將其制成磷脂復合物[6]及固體分散體等[8]，但存在穩(wěn)定性差的問題，生物利用度提高幅度有限。鞣花酸多聚物納米粒[9]及納米結構脂質載體[10]等納米制劑存在制備工藝復雜、載藥量較低等問題。Wang等[11]對鞣花酸納米微乳進行了研究，但處方中用到大量的表面活性劑，具有溶血風險，存在一定的安全隱患。因此，有必要開發(fā)一種制備工藝簡單、載藥量高的鞣花酸制劑。

納米混懸劑（nanosuspensions，NPs）是難溶性藥物與穩(wěn)定劑［如磷脂、聚乙烯吡咯烷酮（PVP） K30、泊洛沙姆188等］通過某種制劑技術而得到的一種膠體分散體系[12-15]。該納米制劑具有制備工藝簡單、載藥量高等優(yōu)勢。有效解決了藥物溶解度及溶出度問題，可用于口服、靜注、肺部、經皮和眼部等多種給藥途徑[16]，因此，NPs技術備受國內外學者的廣泛關注。美國FDA已批準的雅培制藥的非諾貝特片、強生公司的棕櫚酸帕利哌酮注射液等均采用了NPs技術，并成功實現(xiàn)上市。本研究采用反溶劑法聯(lián)合高壓均質法制備鞣花酸納米混懸劑（ellagic acid nanosuspensions，EA-NPs），在單因素考察的基礎上，采用Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化處方工藝，并進行表征。進一步考察口服藥動學情況，為鞣花酸制劑新技術研究提供參考，也為后續(xù)研究奠定基礎。

1 儀器、試劑及動物

FA1004B型電子天平，上海精密儀器儀表有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Master-sizer型粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；SJIA-S型實驗型凍干機，寧波市雙嘉儀器有限公司；CL-200系列加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器公司；Talos F200X S/TEM型透射電子顯微鏡（TEM），北京歐波同光學技術有限公司；AH22高壓均質機，杭州納均儀器有限公司；TMX-22R型高速離心機，Beckman公司；MD200-1/2型氮吹儀，上海葉拓科技有限公司。

鞣花酸對照品，批號P191020，質量分數(shù)為99.2%，上海源葉生物科技公司；鞣花酸原料藥，批號20190428，質量分數(shù)為97%，湖北弘景化工有限公司；大豆磷脂，批號201208，上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司；HMPC E50，批號20211015，山東特耐斯化工有限公司；PVP K30，批號E251529，東營市鴻亞化工有限公司；乳糖，批號20190522，江蘇道寧藥業(yè)有限公司；甘露醇，批號20200715，嘉興南箭生物材料有限責任公司。

SD大鼠購自河南省動物實驗中心，許可證號SCXK（豫）2016-0001，級別為清潔級，雌雄兼用，實驗室飼養(yǎng)至體質量為（240±20）g進行藥動學研究。所有動物實驗遵循鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 EA-NPs的制備[13]

采用反溶劑法聯(lián)合高壓均質法制備EA-NPs。稱取50 mg的鞣花酸原料藥，加入5 mL無水乙醇，超聲2 min使溶解。取一定量的穩(wěn)定劑加入到50 mL蒸餾水中溶解，在一定溫度下，磁力攪拌溶解（轉速為1000 r/min），構成水相。將含有鞣花酸的乙醇溶液緩慢滴加到水相中，滴畢后減壓旋蒸除去有機溶劑。在一定均質壓力下循環(huán)數(shù)次，并補加蒸餾水至原體積，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得EA-NPs混懸液。

2.2 鞣花酸的含量測定

2.2.1 EA-NPs供試品溶液的配制 取1 mL的EA- NPs置于50 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，放置20 min后定容。取適量0.45 μm微孔濾膜濾過，精密吸取濾液2 mL置于10 mL量瓶中，流動相定容，搖勻即得EA-NPs供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取10 mg鞣花酸對照品，置于10 mL量瓶中，加入一定量的甲醇超聲溶解，并定容至刻度，即得1.0 mg/mL的鞣花酸對照品儲備液，密封備用。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為WondaSil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液（40∶60）；檢測波長254 nm；體積流量為1.0 mL/min；理論塔板數(shù)按鞣花酸峰計不低于8500。取空白樣品溶液（空白輔料配制，比例同EA-NPs）、鞣花酸對照品溶液和供試品溶液進樣，色譜圖見圖1，可見該色譜條件下專屬性較高，可用于鞣花酸含量測定。

圖1 空白溶劑(A)、鞣花酸對照品(B)和EA-NPs樣品(C)的HPLC圖

Fig. 1 HPLC spectrum of blank (A), EA reference substance (B) and EA-NPs (C)

2.2.4 線性關系考察 取鞣花酸對照品溶液適量，流動相依次稀釋至質量濃度為10.00、5.00、1.00、0.50、0.10、0.05 μg/mL。在“2.2.3”項下色譜條件下進樣測定，以鞣花酸峰面積為縱坐標（），鞣花酸質量濃度為橫坐標（）進行回歸，得線性回歸方程＝23.155 9－0.759 2，＝0.999 6，結果表明鞣花酸在0.05～10.00 μg/mL線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 取高、中、低（10.00、1.00、0.05 μg/mL）3個質量濃度的鞣花酸對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件下分別連續(xù)進樣6次。測定結果顯示，高、中、低質量濃度下鞣花酸峰面積RSD分別為0.21%、0.73%、0.50%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按照“2.2.3”項下色譜條件進樣，測得鞣花酸峰面積RSD為1.56%，表明EA-NPs的供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗 按照“2.2.1”項下方法平行制備6份EA-NPs供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件下分別進樣。測定結果顯示，鞣花酸質量濃度的RSD為1.72%，因此該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取供試品溶液9份，每份均為0.5 mL，分別加入鞣花酸對照品儲備液（質量濃度為100 μg/mL）3、5、7 mL，制備供試品溶液。在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定鞣花酸含量并計算回收率。結果顯示，鞣花酸的低、中、高組平均加樣回收率為100.72%，RSD平均值為1.17%，表明回收率較高。

2.3 EA-NPs粒徑、PDI與ζ電位的測定

取適量EA-NPs混懸液適量，用蒸餾水按照1∶10比例稀釋，混勻后于粒徑分析儀上測定EA-NPs的平均粒徑、PDI及ζ電位。

2.4 單因素實驗

2.4.1 穩(wěn)定劑種類的篩選 首先對穩(wěn)定劑進行篩選，固定藥物用量50 mg，穩(wěn)定劑與藥物用量比例為4∶1，制備溫度35 ℃，均質壓力70 MPa，均質次數(shù)10次，分別考察磷脂、PVP K30、HMPC E50、磷脂-PVP K30（1∶1）作為穩(wěn)定劑時對EA-NPs的平均粒徑、PDI、ζ電位的影響，結果見表1。單獨以HMPC E50為穩(wěn)定劑時，所制備的EA-NPs的平均粒徑及PDI均較大，ζ電位絕對值較小。單獨以磷脂為穩(wěn)定劑時制得EA-NPs的PDI稍大，平均粒徑有所下降。單獨以PVP K30為穩(wěn)定劑時，雖粒徑稍大，但PDI小于0.3。而將磷脂與PVP K30聯(lián)用后（用量比1∶1）平均粒徑及PDI均最小，且ζ電位絕對值最大，故選擇將兩者聯(lián)用作為制備EA-NPs穩(wěn)定劑。

表1 穩(wěn)定劑種類的影響(, n= 3)

Table 1 Effects of stabilizer types (, n= 3)

穩(wěn)定劑種類粒徑/nmPDIζ電位/mV 磷脂279.15±13.210.302±0.017?19.74±1.58 PVP K30356.27±22.670.256±0.025?21.43±1.79 HMPC E50613.86±68.040.479±0.037?15.93±1.06 磷脂-PVP K30（1∶1）258.94±17.620.184±0.015?27.26±1.94

2.4.2 混合穩(wěn)定劑磷脂/PVP K30比例的篩選 固定藥物用量50 mg，穩(wěn)定劑與藥物用量比例為4∶1，制備溫度35 ℃，均質壓力70 MPa，均質次數(shù)10次，分別考察混合穩(wěn)定劑磷脂/PVP K30比例分別為3∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶3時對EA-NPs的平均粒徑、PDI、ζ電位的影響，結果見表2。由此可知，隨著PVP K30用量比例的增加，EA-NPs的平均粒徑及PDI值呈先減小后增大趨勢，但ζ電位絕對值無顯著性差異。綜合考慮EA-NPs的平均粒徑、PDI值及ζ電位，最終選擇混合穩(wěn)定劑磷脂/PVP K30用量為2∶3作為制備EA-NPs穩(wěn)定劑。

表2 穩(wěn)定劑磷脂/PVP K30比例的影響(, n= 3)

Table 2 Effects of phospholipids to PVP K30 ratio (, n= 3)

磷脂與PVP K30比例平均粒徑/nmPDIζ電位/mV 3∶1272.61±14.080.267±0.031?26.94±1.67 3∶2249.84±16.110.251±0.028?28.43±1.69 1∶1263.14±13.940.193±0.024?27.31±1.44 2∶3252.37±15.980.174±0.027?26.08±1.58 1∶3312.08±17.170.291±0.021?27.44±1.39

2.4.3 穩(wěn)定劑與藥物用量比例的篩選 固定藥物用量50 mg，穩(wěn)定劑磷脂/PVP K30（比例為2∶3），制備溫度35 ℃，均質壓力70 MPa，均質次數(shù)10次，分別考察穩(wěn)定劑與藥物用量比例分別為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1時，對EA-NPs的平均粒徑、PDI及ζ電位的影響，結果見表3。當穩(wěn)定劑用量不足時，穩(wěn)定效果差，導致EA-NPs平均粒徑和PDI值均較大，且ζ電位值較低。隨著穩(wěn)定劑用量的增加，EA-NPs的平均粒徑及PDI值均呈先減小后增大趨勢，可能是由于穩(wěn)定劑用量過多時附著在納米粒表面，從而使粒徑增加，且分布不均勻，導致PDI值增加?？梢姺€(wěn)定劑與藥物用量比例對EA-NPs影響較大，后續(xù)需要進一步優(yōu)化。

表3 穩(wěn)定劑與藥物用量比例的影響(, n= 3)

Table 3 Effects ofstabilizer to drugratio (, n= 3)

穩(wěn)定劑與藥物用量比例平均粒徑/nmPDIζ電位/mV 3∶1378.67±23.100.349±0.033?19.38±1.46 4∶1249.18±18.630.187±0.019?28.17±1.91 5∶1272.08±15.240.241±0.015?25.43±1.82 6∶1345.62±17.910.318±0.022?29.54±2.07

2.4.4 制備溫度的篩選 固定藥物用量50 mg，穩(wěn)定劑與藥物用量比例為4∶1，穩(wěn)定劑磷脂/PVP K30（比例為2∶3），均質壓力70 MPa，均質次數(shù)10次，分別考察制備溫度為15、25、35、45、55 ℃時對EA-NPs的平均粒徑、PDI和ζ電位的影響，結果見表4。隨著制備溫度的升高，制備的EA-NPs的平均粒徑和PDI均呈增大趨勢，可能是由于溫度越高，納米粒之間的相互碰撞并發(fā)生融合幾率越大，進而對平均粒徑和PDI值產生影響。由于15 ℃和25 ℃條件下制備的EA-NPs的平均粒徑和PDI差別不大，且溫度為25 ℃時ζ電位絕對值相對較高，考慮到制備的便利性，故選取制備溫度為25 ℃。

表4 制備溫度的影響(, n= 3)

Table 4 Effect of preparation temperature (, n= 3)

制備溫度/℃平均粒徑/nmPDIζ電位/mV 15187.08±11.270.169±0.012?28.36±1.99 25193.34±14.620.153±0.017?31.40±2.06 35258.54±18.170.185±0.015?24.91±1.43 45354.19±20.080.259±0.020?27.22±1.70 55431.81±31.650.387±0.026?25.74±1.67

2.4.5 均質壓力的篩選 固定藥物用量50 mg，穩(wěn)定劑與藥物用量比例為4∶1，穩(wěn)定劑磷脂/PVP K30（比例為2∶3），制備溫度25 ℃，均質次數(shù)10次，分別考察均質壓力為40、70、100、130 MPa時對EA-NPs的平均粒徑、PDI及ζ電位的影響，結果見表5。隨著均質壓力的逐漸增加EA-NPs的平均粒徑和PDI值均呈先減小后增大趨勢，可能是均質壓力過高時體系溫度急劇上升，此時的EA-NPs在高溫下可能具有一定的可變性，納米粒子相互碰撞后容易發(fā)生融合、聚集，從而影響了平均粒徑及PDI值。但均質壓力不足時，EA-NPs的平均粒徑和PDI值相對較大，且ζ電位絕對值相對較低，穩(wěn)定性差。因此，均質壓力對EA-NPs各個指標影響較大，后續(xù)有必要進一步優(yōu)化。

2.4.6 均質次數(shù)的篩選 固定藥物用量50 mg，穩(wěn)定劑與藥物用量比例為4∶1，穩(wěn)定劑磷脂/PVP K30（比例為2∶3），制備溫度25 ℃，均質壓力70 MPa，分別考察均質次數(shù)為5、10、15、20時對EA-NPs的平均粒徑、PDI及ζ電位的影響，結果見表6。適當增加均質次數(shù)有利于EA-NPs的平均粒徑及PDI減小，但均質次數(shù)達到15次時，平均粒徑及PDI反而稍有增大，這可能是由于頻繁的均質導致EA-NPs之間融合、聚集所致?？梢娋|次數(shù)過少或過大均會對EA-NPs產生影響，后續(xù)需要進一步優(yōu)化。

表5 均質壓力的影響(, n= 3)

Table 5 Effect of homogenization pressure (, n= 3)

均質壓力/MPa平均粒徑/nmPDIζ電位/mV 40313.53±23.150.382±0.034?21.39±1.59 70175.42±15.070.168±0.013?28.17±1.26 100197.92±16.280.191±0.019?25.08±2.01 130267.17±20.190.253±0.015?27.64±1.93

表6 均質次數(shù)的影響(, n= 3)

Table 6 Effect of homogenization times (, n= 3)

均質次數(shù)粒徑/nmPDIζ電位/mV 5231.88±26.140.204±0.21?25.36±2.14 10169.64±20.060.161±0.17?29.61±1.96 15221.18±18.250.189±0.19?26.27±1.56 20354.94±28.070.241±0.23?28.84±1.80

2.5 Box-Behnken效應面法優(yōu)化制備工藝

2.5.1 Box-Behnken試驗設計 對NPs來講，粒徑大小對藥物的生物利用度、藥效等影響較大[12]，并且期望獲得的納米制劑粒徑分布較為集中，因此選擇EA-NPs的平均粒徑（1）和PDI值（2）作為評價指標。根據EA-NPs的單因素試驗結果，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定劑與藥物用量比（1）、均質壓力（2）和均質次數(shù)（3）對EA-NPs的平均粒徑和PDI值影響較大，故作為主要影響因素，并參考單因素考察結果確定各因素繼續(xù)優(yōu)化的水平見表7。按照Box- Behnken效應面法給出的實驗方案，分別制備不同處方工藝下的EA-NPs混懸液，并記錄粒徑和PDI值，結果見表7。

2.5.2 二次多元回歸模型的建立及顯著性分析 利用Box-Behnken軟件（版本為Design Expert V8.0.6）對17組的試驗結果進行擬合，得到粒徑1的2次多元回歸方程為1＝152.72＋6.801＋14.822＋11.863－2.9612－2.7213－1.8123＋5.8712＋13.5622＋14.6932，2＝0.994 5，模型＜0.000 1；2＝0.110＋0.0191＋0.0282＋0.0233＋2.813×10?312＋4.938×10?313＋2.5×10?323＋0.01112＋0.1122＋0.2032，2＝0.993 5，模型＜0.000 1。從2種數(shù)學模型的值和2可以看出，建立的模型均具有極顯著性水平，擬合度良好，試驗誤差小，失擬度均＞0.05，說明未知因素干擾可忽略不計，因此可用該模型對EA-NPs的處方工藝進行優(yōu)化和預測。方差分析結果見表8，對于1模型來說1、2、3、12、13、23、12、22、32是顯著或極顯著項。對于2模型來說1、2、3、12、13、23、12、22、32是顯著或極顯著項。

表7 Box-Behnken試驗設計結果

Table 7 Experiments results of Box-Behnken

試驗號X1X2/MPaX3/次Y1/nmY2 13.0 (?1)70 (0)15 (+1)210.60.172 24.5 (0)70 (0)10 (0)150.60.093 33.0 (?1)100 (+1)10 (0)220.30.196 43.0 (?1)40 (?1)10 (0)230.90.216 54.5 (0)70 (0)10 (0)147.20.082 64.5 (0)100 (+1)15 (+1)210.20.173 74.5 (0)40 (?1)15 (+1)250.70.144 84.5 (0)70 (0)10 (0)140.90.091 93.0 (?1)70 (0)5 (?1)235.90.297 104.5 (0)40 (?1)5 (?1)293.10.272 114.5 (0)100 (+1)5 (?1)281.50.261 126.0 (+1)70 (0)5 (?1)267.40.218 134.5 (0)70 (0)10 (0)144.40.091 146.0 (+1)70 (0)15 (+1)198.60.172 156.0 (+1)100 (+1)10 (0)192.70.164 164.5 (0)70 (0)10 (0)146.30.094 176.0 (+1)40 (?1)10 (0)250.60.139

2.5.3 響應面分析、優(yōu)化與預測 分別固定穩(wěn)定劑與藥物用量比例（1）、均質壓力（2）、均質次數(shù)（2）中因素之一，繪制其他2個因素對粒徑（1）及PDI值（2）的三維曲面圖，結果見圖2，可見兩兩因素對EA-NPs評價指標影響較為復雜，說明采用Box-Behnken效應面法優(yōu)化EA-NPs處方工藝的必要性。

設置粒徑最小值為50 nm，最大值為300 nm，PDI最小值為0.05，最大值為0.3，得到EA-NPs的最佳處方為穩(wěn)定劑與藥物比例為4.06∶1，均質壓力72.76 MPa、均質次數(shù)為11.21次，在此條件下平均粒徑及PDI值的預測值分別為142.71 nm和0.082?？紤]到實際操作的便捷性，調整穩(wěn)定劑與藥物比例為4∶1，均質壓力73 MPa，均質次數(shù)為11次。

2.6 處方驗證

根據EA-NPs最佳處方工藝平行制備3份EA- NPs，分別測定平均粒徑及PDI值，并分別與預測值進行比較，計算偏差［偏差＝(模型預測值－實際值)/模型預測值］。結果見表9，測得EA-NPs的平均粒徑為（148.16±7.61）nm（＝3），粒徑分布見圖3；平均PDI值為0.089±0.014（＝3），實際值與模型預測值的相對偏差均小于±5%，說明采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化EA-NPs處方工藝時具有良好的預測性和重現(xiàn)性。另測得EA-NPs最佳處方下的ζ電位為（?29.64±1.82）mV（＝3），ζ電位見圖4。

表8 Y1和Y2方差分析結果

Table 8 Variance analysis for Y1and Y2

項目自由度Y1Y2 平方和均方F值P值平方和均方F值P值 模型940 642.004 515.78139.45＜0.000 10.0738.116×10?3118.96＜0.000 1 X11379.27379.2711.710.011 12.869×10?32.869×10?342.060.000 3 X211 803.021 803.0255.680.000 16.583×10?36.583×10?396.49＜0.000 1 X311 154.371 154.3735.650.000 64.275×10?34.275×10?362.66＜0.000 1 X1X21559.32559.3217.270.004 35.062×10?45.062×10?47.420.029 6 X1X31473.06473.0614.610.006 51.560×10?31.560×10?322.870.002 0 X2X31208.80208.806.450.038 74.000×10?44.000×10?45.860.046 0 X1212 324.772 324.7771.79＜0.000 18.679×10?38.679×10?3127.21＜0.000 1 X22112 390.7012 390.70382.64＜0.000 17.840×10?37.840×10?3114.92＜0.000 1 X32114 531.6614 531.66448.76＜0.000 10.0260.026386.65＜0.000 1 殘差7226.6732.38 4.776×10?46.822×10?5 失擬項3175.4858.494.570.08813.868×10?41.289×10?45.680.063 3 絕對誤差451.1912.80 9.080×10?52.270×10?5 總和1640 868.68 0.074

圖2 自變量與響應值的三維圖

表9 實際值與模型預測值的比較(, n= 3)

Table 9 Comparison of predicted values and measured values (, n= 3)

評價指標粒徑/nmPDI值 實際值148.16±7.610.086±0.014 模型預測值142.710.082 偏差/%?3.82?4.88

圖3 EA-NPs的粒徑分布圖

圖4 EA-NPs的ζ電位

2.7 EA-NPs載藥量測定及形態(tài)觀察

2.7.1 載藥量的測定 精密取5 mL制備好的EA- NPs混懸液，不添加保護劑進行直接凍干，精密稱取凍干粉質量（1）。向凍干粉中加入50 mL甲醇，超聲10 min使其完全溶解，經0.45 μm微孔濾膜過濾，精密量取5 mL置于100 mL量瓶中，流動相定容，進樣測定鞣花酸含量（2），計算EA-NPs的載藥量（載藥量＝2/1）。結果顯示，3批EA-NPs平均載藥量為（20.53±1.17）%。

2.7.2 形態(tài)觀察 取0.1 mL的EA-NPs混懸液樣品，用蒸餾水按照1∶30比例稀釋，混勻后滴在銅網上，采用1.5%磷鎢酸鈉進行染色，自然晾干，濾紙吸掉多余水分，置于TEM下觀察EA-NPs外貌形態(tài)，結果見圖5。所得EA-NPs大體呈類球形或球形，粒子之間無粘連。

圖5 EA-NPs的TEM圖

2.8 EA-NPS凍干粉的制備

取EA-NPs混懸液分成若干份，每份3 mL，加入一定量的凍干保護劑（乳糖、甘露醇及兩者等量混合物），混勻，置于?45 ℃超低溫冰箱中2 d。迅速置于?30 ℃冷凍干燥機中凍干1 d，即得EA-NPs凍干粉。以凍干粉外觀飽滿度及復溶時間進行評價，選出合適種類及用量的凍干保護劑。結果見表10，當EA-NPs凍干粉外觀達飽滿狀態(tài)時，由于乳糖-甘露醇（等量混合物）用量為6%時所需復溶時間最短，故選之作為EA-NPs的凍干保護劑。EA-NPs凍干前后的外觀見圖6。取適量EA-NPs凍干粉，蒸餾水復溶后粒徑為（173.93±10.17）nm（＝3），ζ電位為（?26.69±1.71）mV（＝3）。

表10 凍干保護劑種類及用量的考察(n = 3)

Table 10 Effect of types and dose for freeze-drying protestants (n = 3)

編號凍干保護劑種類及用量考察項 乳糖/%甘露醇/%乳糖-甘露醇（等量混合物）/%外觀復溶時間/s 14 塌陷60～75 26 塌陷75～85 38 飽滿＞120 4 4 輕微塌陷40～45 5 6 飽滿60～70 6 8 飽滿85～95 7 4輕微塌陷35～40 8 6飽滿45～50 9 8飽滿70～80

圖6 EA-NPs混懸液及凍干粉外觀

2.9 EA-NPs凍干粉晶型研究

采用X粉末射線衍射儀（XRPD）進行晶型分析。分別取鞣花酸原料藥、空白輔料（磷脂＋PVP K30）、物理混合物（鞣花酸原料藥＋空白輔料，比例同后者）和EA-NPs凍干粉樣品適量，置于玻璃槽中，玻璃片輕輕壓制平整，刮去多余樣品，置于XRPD下進行掃描。掃描條件：管壓40kV，銅靶，掃描范圍3°～45°，速度為8°/min。結果見圖7，鞣花酸原料藥呈結晶狀態(tài)，與空白輔料簡單混合后仍可觀察到鞣花酸在9.8°、12.1°、17.3°、27.6°等處的衍射峰。而在EA-NPs凍干粉樣品僅可觀察到空白輔料的衍射峰，說明鞣花酸在EA-NPs凍干粉存在狀態(tài)發(fā)生了改變，轉變成無定型物質。

圖7 XRPD結果

2.10 體外釋放及模型擬合

采用透析袋法進行考察。取鞣花酸原料藥及EA-NPs凍干粉樣品（以鞣花酸計含量均為20 mg），加入空白釋藥介質制成混懸液，分別轉入活化透析袋中（截留相對分子質量8000～12 000）中，兩端扎緊，并固定于攪拌槳上。溶出介質為1000 mL 1.0% SDS水溶液，介質溫度為（37.0±0.5）℃，轉速為100 r/min，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、18.0、36.0 h取樣2 mL，同時補足等溫等量的空白釋藥介質。樣品經0.45 μm微孔濾膜濾過，HPLC測定鞣花酸質量濃度，計算各取樣點的累積釋放率[17]，繪制釋放度曲線，見圖8。鞣花酸原料藥在36 h內累積釋放率僅為36.43%，可能是由于鞣花酸原料藥顆粒較大，疏水性強等原因，導致藥物溶出困難；而EA-NPs凍干粉在6 h累積釋放度高達96.24%，基本釋放完全，說明將鞣花酸制成EA-NPs能顯著提高藥物溶出速率及累積釋放率，為提高生物利用度奠定基礎。

2.11 體內藥動學研究

2.11.1 給藥方案及樣品采集 取SD大鼠18只，隨機分成鞣花酸組、物理混合物組和EA-NPs組，每組6只，給藥前空腹12 h，自由飲水。采用0.5% CMC-Na配制ig用樣品，各組SD大鼠ig劑量均為80 mg/kg（以鞣花酸含量計）。鞣花酸組和物理混合物組給藥后分別在0、0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、8 h經眼眶后靜脈取血0.2～0.3 mL，置肝素化的離心管中。EA-NPs組增加10、12 h取血點。血漿樣品均經3000 r/min離心2 min（防止溶血現(xiàn)象），取上層血漿至空白離心管中，密封置冰箱冷凍層中。

圖8 EA-NPs和鞣花酸的體外藥物釋放曲線(, n= 3)

2.11.2 血漿樣品處理 血漿樣品于室溫中解凍，精密移取100 μL，加入1 mL有機溶劑（甲醇-乙腈1∶1），渦旋5 min，6000 r/min離心（離心半徑9.6 cm）5 min，沉淀蛋白。取上層澄清有機溶劑，采用40 ℃的氮氣緩慢吹干，得殘渣。再加入100 μL甲醇復溶，繼續(xù)6000 r/min離心（離心半徑9.6 cm）3 min，進HPLC測定。

2.11.3 血漿對照品的配制及線性關系考察 采用甲醇配制濃度為800 ng/mL的芍藥苷對照品溶液，作為內標溶液。采用甲醇配制質量濃度為1500、1000、500、100、50、20 ng/mL的鞣花酸對照品溶液，各個質量濃度精密量取100 μL，并加入50 μL內標溶液，采用40℃的氮氣緩慢吹干，得殘渣，分別加入100 μL空白血漿，按“2.11.2”項下處理血漿樣品。參考“2.2.3”項下色譜條件，將流動相調整為甲醇-0.1%甲酸溶液（38∶62），其他條件不變，進樣測定血漿樣品，記錄鞣花酸及內標的峰面積。以鞣花酸和內標峰面積比（）對鞣花酸質量濃度（）進行線性回歸，得血漿標準曲線方程＝0.191 8＋0.114 2，＝0.993 5，因此鞣花酸在20～1500 ng/mL線性關系良好。

2.11.4 方法學考察 空白血漿、血漿樣品溶液（鞣花酸混懸液給藥8 h）和鞣花酸＋空白血漿（質量濃度為20 ng/mL），按照“2.11.2”項下方法處理，進樣，結果見圖9，血漿內源性物質不干擾鞣花酸血漿樣品測定，專屬性高。

取高、中、低（1500、500、20 ng/mL）3個質量濃度的血漿對照品溶液，同1 d連續(xù)進樣6次，測定鞣花酸與內標峰面積，兩者比值的RSD依次為4.56%、3.89%、6.27%，說明日內精密度良好；每天測定1次，連續(xù)測定6 d，測定鞣花酸與內標峰面積，兩者比值的RSD依次為7.15%、5.35%、6.18%，說明日間精密度良好。取給藥后鞣花酸原料藥給藥1 h血漿樣品，25 ℃下解凍后分別于0、1、2、4、8、12、24 h進樣測定，測定鞣花酸與內標峰面積，兩者比值的RSD為6.92%，表明血漿樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。取空白血漿，分別配制高、中、低（1500、500、20 ng/mL）3個質量濃度的樣品溶液，按“2.11.2”項下處理血漿樣品，進樣測定，并與實際質量濃度進行比較，計算回收率。結果顯示，高、中、低3個質量濃度下鞣花酸的回收率分別為（95.16±0.79）%、（92.71±0.93）%、（93.29±0.77）%，RSD值依次為3.14%、4.62%、3.97%，說明該方法回收率較高。

圖9 空白血漿(A)、血漿樣品(B) 和鞣花酸＋空白血漿(C) 的HPLC圖

2.11.5 藥動學結果 取鞣花酸原料藥、EA-NPs凍干粉樣品及物理混合物（藥物與輔料比例同EA-NPs凍干粉）的血漿樣品，按照“2.11.2”項方法處理后進樣測定，繪制血藥濃度-時間曲線，結果見圖10。DAS 2.0軟件包擬合數(shù)據，主要藥動學參數(shù)見表11。由此可知，鞣花酸原料藥的max、1/2、max、AUC0～t分別為（1.14±0.29）h、（2.16±0.42）h、（337.16±67.28）ng/mL和（693.02±92.45）ng·h/mL，物理混合物僅max有顯著性變化，可能是輔料有一定的促吸收作用所致。而EA-NPs組的max、1/2、max、AUC0～t與鞣花酸原料藥或物理混合物相比均具有極顯著性差異（＜0.01），max提前至（0.56±0.18）h，1/2延長至（3.17±0.64）h，相對生物利用度提高至5.61倍。物理混合物雖有一定程度提高，但無顯著性差異。

圖10 藥-時曲線(, n= 6)

表11 主要藥動學參數(shù)(, n= 6)

Table 11 Main pharmacokinetic parameters (, n= 6)

參數(shù)單位鞣花酸物理混合物EA-NPs tmaxh1.14±0.291.01±0.320.56±0.18**## t1/2h2.16±0.422.29±0.463.17±0.64**## Cmaxng?mL?1337.16±67.28424.89±78.16*1 172.04±182.51**## AUC0～tng?h?mL?1693.02±92.45842.81±104.713 889.43±697.05**## AUC0～∞ng?h?mL?1731.84±112.37893.07±112.234 149.23±787.16**##

與鞣花酸比較：*＜0.05**＜0.01；與物理混合物比較：##＜0.01

*< 0.05**< 0.01EA;*< 0.05##< 0.01physical mixture

3 討論

將鞣花酸制備成EA-NPs，制備工藝簡單，輔料種類少，載藥量達到（20.53±1.17）%。前期分別對磷脂、PVP K30、HMPC E50等進行了考察，發(fā)現(xiàn)單獨采用HMPC E50穩(wěn)定劑時制備的EA-NPs的粒徑及PDI值均較大，這可能是因為HMPC E50不能穩(wěn)定地吸附于納米粒子表面，無法提供足夠的空間阻力或電荷排斥作用，從而導致EA-NPs容易發(fā)生聚集。采用磷脂和PVP K30聯(lián)合作為穩(wěn)定劑時效果較好，這可能是由于磷脂作為一種兩親性離子表面活性劑，可有效降低表面張力，有利于形成較小粒徑的EA-NPs，而且易于吸附在納米混懸劑表面，提供一定量的電荷，從而使納米粒子之間由于電荷斥力而有利于維持穩(wěn)定狀態(tài)。PVP K30相對分子質量較大，遇水溶解后可形成網狀結構，進而為EA-NPs提供了巨大的空間阻力，發(fā)揮穩(wěn)定劑作用。由于磷脂與PVP K30發(fā)揮穩(wěn)定作用的機理不同，因而將兩者聯(lián)用后有利于形成較小粒徑且穩(wěn)定的EA-NPs。

由于EA-NPs后續(xù)會進一步制備成凍干粉，故Box-Behnken效應面法優(yōu)化制備工藝時未將ζ電位納入優(yōu)化指標，以減少確定EA-NPs最優(yōu)處方的干擾。EA-NPs直接凍干時不利于其結構穩(wěn)定，加入凍干保護劑后可降低預凍及升華等過程對其結構的影響。良好的凍干粉制劑應滿足[18]：①玻璃態(tài)存在，使納米粒子免受冰晶破壞作用；②升華過程中不塌陷，外觀飽滿，致密。經考察發(fā)現(xiàn)，乳糖和甘露醇聯(lián)合作為凍干保護劑時效果最佳。這可能是因為乳糖作為糖類保護劑，本身是一種無定型物質，可誘導玻璃態(tài)的形成，但單獨使用時外觀不佳。甘露醇本身支撐能力較強，容易獲得飽滿的外觀，但甘露醇結晶容易破壞納米粒子。因而將兩者聯(lián)用后可實現(xiàn)優(yōu)勢互補，制得的EA-NPs凍干粉外觀飽滿，復溶后粒徑為（173.93±10.17）nm，復溶時間為45～50 s。

鞣花酸的口服給藥劑量一般在30～200 mg/kg[7,9-10,17]，本研究鞣花酸的口服劑量為80 mg/kg。體內藥動學研究顯示，EA-NPs的max顯著性提前，可能是由于EA-NPs加快了釋藥速率，進而影響了入血速度所致。其相對口服吸收生物利用度均顯著高于鞣花酸及物理混合物，原因可能有以下幾個方面：①藥物納米化后，粒徑顯著減小，比表面積增大，增加了與胃腸道接觸面，利于鞣花酸透膜吸收[19-20]；②納米級別的藥物與腸道黏附性較強[21]，導致EA-NPs的1/2延長，增加了滯留時間，間接促進了藥物吸收；③鞣花酸在EA-NPs中轉變?yōu)闊o定型物質[13,22]，且NPs增強了藥物的透膜滲透性[16]，有利于藥物吸收；④EA-NPs處方中磷脂[23-24]及PVP K30[25]本身具有一定的促吸收作用。目前本研究完成了EA-NPs制劑學及口服藥動學評價，接下來需繼續(xù)進行注射藥動學、藥效學、毒理學評價等研究，為EA-NPs提供更為全面的研究資料，為鞣花酸新制劑研究開發(fā)提供有價值的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation, characterization andpharmacokinetics of ellagic acid nanosuspensions

QIN Fang-fang1, PENG You-mei2, SU Hai-bo3, GAO Shou-jia3

1. Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450007, China 2. Henan Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences, Zhengzhou 450052, China 3. Technical Center, Shanghai Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201401, China

To prepare ellagic acid nanosuspensions (EA-NPs) and study pharmacokinetics characteristics in SD rats.EA-NPs were prepared by high pressure homogenization method. Based on single factor experiments, ratio of stabilizer to drug, homogenization pressure and homogenization frequency were used as influencing factors, average particles size and polydispersion index (PDI) were employed as evaluation indexes, the formulation of EA-NPs was optimized by Box-Behnken design-response surface method. EA-NPs was characterized by transmission electron microscopy (TEM) and X-ray powder diffraction (XRPD). Dialysis bag method was employed to investigate the drug release. SD rats in each group were administered intragastrically with ellagic acid suspension, physical mixture (the proportion of excipients were consistent with EA-NPs) and EA-NPs group, respectively. Ellagic acid concentration in plasma was analyzed by HPLC and the main pharmacokinetic parameters were calculated.The optimal preparation of EA-NPs: phospholipids-PVP K30 (2:3) was employed as stabilizer, the ratio of stabilizer to drug was 4:1, preparation temperature was 25℃, homogenization pressure was 73 MPa and homogenization frequencies was 11 times. The shape of EA-NPs was spherical or elliptical. Particle size distributed between 70 nm and 400 nm. Average particle size, PDI and ζ potential of EA-NPs were (148.16 ± 7.61) nm, 0.089 ± 0.014 and (?29.64 ± 1.82) mV, respectively. Ellagic acid existed in an amorphous state in EA-NPs, and the cumulative dissolution of drug was 96.24% in 6 h. The1/2of EA-NPs was prolonged to (3.17 ± 0.64) h,maxwas increased to (1 172.04 ± 182.51) ng/mL and the oral bioavailability was enhanced to 5.61 times.EA-NPs could enhance cumulative dissolution of EAand improve oral bioavailability.

ellagic acid; nanosuspensions; Box-Behnken design-response surface method; characterization; dissolution; pharmacokinetics; high pressure homogenization method; oral bioavailability

R283.6

A

0253 - 2670(2022)13 - 3980 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.011

2022-01-17

河南省科技公關項目（202102310159）；上海市科委項目（21S21903400）

秦芳芳（1985—），女，碩士，從事醫(yī)院藥學研究。Tel: (0371)68520039 E-mail: qinfangfang2022@126.com

蘇海波（1984—），男，碩士，從事藥物臨床及藥理研發(fā)工作。Tel: (021)37565578 E-mail: suhb @shlys.com

[責任編輯 鄭禮勝]