吳池瑩,張潤(rùn)何,鄧曉軍,盛永剛,蔡文瑄,謝 敏,陳仲兵,楊曉君,趙超敏,樊 祥
(上海海關(guān),上海 200135)
櫻桃是國(guó)內(nèi)最受歡迎的進(jìn)口水果之一,在國(guó)內(nèi)占有極大的市場(chǎng)份額。櫻桃在種植過(guò)程中易受到實(shí)蠅、蛾類、真菌等病蟲(chóng)害的影響,為防止地中海實(shí)蠅、歐洲櫻桃實(shí)蠅等檢疫性有害生物的危害,我國(guó)與土耳其、澳大利亞、阿根廷等多個(gè)國(guó)家簽訂的輸華植物檢疫要求議定書(shū)均規(guī)定,輸華櫻桃須在出口前或運(yùn)輸途中經(jīng)過(guò)冷處理、熏蒸處理等預(yù)防性檢疫處理后方可入境。冷處理耗時(shí)較長(zhǎng),并需要先進(jìn)的制冷設(shè)備,處理后易造成凍傷,櫻桃由于貨值高、時(shí)效性強(qiáng),一般采用空運(yùn)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)口,檢疫處理方式會(huì)選擇耗時(shí)更短的熏蒸處理。目前熏蒸普遍使用的藥劑為溴甲烷,它有廣譜、高效等特點(diǎn),熏蒸后殘留氣體迅速揮發(fā),具有極高的經(jīng)濟(jì)性。由于對(duì)環(huán)境與人體的危害性,歐盟從2010年3月18日起在其成員國(guó)內(nèi)部禁止所有用途溴甲烷的使用,我國(guó)農(nóng)業(yè)部2552號(hào)公告也禁止了溴甲烷在農(nóng)業(yè)用途使用,國(guó)內(nèi)外現(xiàn)已有不少新型熏蒸劑的研究,但溴甲烷仍無(wú)法徹底被替代。溴甲烷易揮發(fā),在熏蒸過(guò)程追溯上有一定困難,溴離子是溴甲烷的代謝產(chǎn)物,國(guó)際上參考聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織給出的人體每日溴攝入量1 mg/kg制定了溴離子限量。我國(guó)GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中現(xiàn)暫無(wú)櫻桃中溴甲烷和溴離子限量要求,歐盟、日本和美國(guó)櫻桃中溴離子都設(shè)有限量為20 mg/kg,隨著溴甲烷熏蒸的使用,溴殘留的研究將會(huì)起到重要的作用。
目前,對(duì)溴元素的研究大多集中在水質(zhì)和面粉制品上,對(duì)果蔬中溴形態(tài)的分析技術(shù)研究相對(duì)較少。食品中溴化合物的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、離子色譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等,前處理方法主要有微波萃取法、超聲提取法、堿法消解等。近年來(lái)隨著儀器聯(lián)用技術(shù)的快速發(fā)展,高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)法以儀器普及率高、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于砷、汞、鉻、硒及鹵素等元素的形態(tài)分析中。
本研究參考各類檢測(cè)方法,通過(guò)優(yōu)化條件參數(shù),建立一種HPLC-ICP-MS法分析熏蒸后櫻桃中溴殘留的形態(tài),并使用ICP-MS測(cè)定櫻桃中總溴含量,頂空進(jìn)樣-氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(gas chromatography-electron capture detector,GC-ECD)法測(cè)定櫻桃中溴甲烷殘留量,用于對(duì)比和確證。本方法前處理操作簡(jiǎn)便、分析迅速、靈敏度高,適用于櫻桃中溴形態(tài)的分析,以及溴甲烷和總溴含量的快速檢測(cè)。通過(guò)研究熏蒸前后櫻桃中溴甲烷殘留量和無(wú)機(jī)溴含量的變化情況,驗(yàn)證溴甲烷熏蒸與溴殘留的關(guān)系,對(duì)櫻桃的熏蒸過(guò)程進(jìn)行追溯,旨在為水果的進(jìn)出口風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控和質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。
進(jìn)口新鮮櫻桃共6 批次各3 kg。
溴酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L) 美國(guó)Inorganic Ventures公司;溴離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)、溴甲烷標(biāo)準(zhǔn)品(2 000 mg/L) 美國(guó)O2si公司;銠標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L) 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;硝酸(優(yōu)級(jí)純)、氨水(分析純)、氯化鈉(分析純) 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;25%四甲基氫氧化銨溶液上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。
8800 ICP-MS儀、1260 HPLC儀、7890 GC-ECD儀安捷倫科技有限公司。
1.3.1 樣品制備
獲取6 批次進(jìn)口櫻桃各3 kg,選擇中等大小、較為飽滿的果實(shí),各分為2 份,一份作為未熏蒸比對(duì),一份按照土耳其櫻桃3 h熏蒸法再次進(jìn)行熏蒸。熏蒸條件:20~22 ℃,溴甲烷投藥量145 g/m,常壓處理3 h。熏蒸完畢后,放置于0 ℃左右冷藏保存。制樣時(shí),每次取100 g左右櫻桃,去核勻漿,現(xiàn)制現(xiàn)用。
1.3.2 溴形態(tài)的分析
1.3.2.1 樣品前處理
稱取試樣1.0 g(精確至0.001 g)于50 mL離心管中,加入25 mL去離子水,振蕩2 min,超聲提取30 min,每隔5 min振搖一次,8 000 r/min離心5 min,吸取上層清液,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后,用HPLC-ICP-MS測(cè)定。
1.3.2.2 ICP-MS儀器條件
射頻功率1 550 W;等離子氣流速16.0 L/min;霧化氣流速1.05 L/min;霧化室溫度2 ℃;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.3 r/s;檢測(cè)模式:氧反應(yīng)模式;檢測(cè)質(zhì)量數(shù)79。
1.3.2.3 HPLC條件
色譜柱:Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm,10 μm);流動(dòng)相:36 mmol/L硝酸+67 mmol/L氨水,pH 9.0;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量50 μL。
1.3.2.4 測(cè)定步驟
用去離子水配制2.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L溴離子和溴酸根混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)行HPLC分析,以保留時(shí)間定性,色譜峰面積定量,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)樣品溶液進(jìn)行分析,根據(jù)回歸方程獲得試樣中溴形態(tài)的質(zhì)量濃度。
1.3.3 總溴含量的測(cè)定
1.3.3.1 樣品前處理
稱取試樣1.0 g(精確至0.001 g)于50 mL離心管中,加入0.5%四甲基氫氧化銨溶液25 mL,振蕩2 min,超聲提取20 min,放入烘箱中(90±5)℃恒溫消解30 min,待冷卻至室溫,經(jīng)塞脫脂棉的漏斗過(guò)濾后,用ICP-MS測(cè)定。
1.3.3.2 ICP-MS儀器條件
射頻功率1 600 W;等離子氣流速16.0 L/min;霧化氣流速1.0 L/min;霧化室溫度2 ℃;掃描次數(shù)30 次;重復(fù)次數(shù)3 次;積分時(shí)間1 s;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.3 r/s;掃描方式:跳峰;檢測(cè)模式:氧反應(yīng)模式。
1.3.3.3 測(cè)定步驟
用0.5%四甲基氫氧化銨溶液配制0、2.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L溴標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用0.3 mol/L的硝酸溶液配制銠內(nèi)標(biāo)溶液20.0 μg/L。選擇溴Br為待測(cè)元素,銠Rh為內(nèi)標(biāo)元素,在線加入內(nèi)標(biāo),測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液,根據(jù)回歸方程獲得試樣中總溴的質(zhì)量濃度。
1.3.4 溴甲烷殘留量的測(cè)定
1.3.4.1 樣品前處理
稱取試樣10.0 g(精確至0.001 g)于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中,加入5 mL飽和氯化鈉溶液,密封,40 ℃恒溫30 min,用GC-ECD測(cè)定。
1.3.4.2 GC條件
色譜柱:Agilent DB-5(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量200 μL;分流比20∶1;柱溫70 ℃;進(jìn)樣口溫度100 ℃;檢測(cè)器溫度300 ℃。
1.3.4.3 測(cè)定步驟
根據(jù)試樣中溴甲烷含量,吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用飽和氯化鈉溶液配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與試樣同時(shí)進(jìn)行GC分析,計(jì)算試樣中溴甲烷的殘留量。
溴元素電離能較高,在ICP-MS上響應(yīng)較低,選擇較高的射頻功率增強(qiáng)儀器靈敏度。溴有79和81兩種同位素,選擇79作為檢測(cè)質(zhì)量數(shù),避免ArAr H對(duì)Br的干擾。由于水果中含有較高的鉀元素,標(biāo)準(zhǔn)模式下KAr對(duì)Br會(huì)產(chǎn)生影響,選擇氧反應(yīng)模式消除多原子離子干擾。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),氧氣流量較高時(shí),儀器響應(yīng)值會(huì)大幅度降低。兼顧儀器靈敏度和去干擾效果,最終控制氧氣流量在5%,并通過(guò)調(diào)諧將儀器調(diào)整到最佳狀態(tài)。
對(duì)溴形態(tài)分析方法的HPLC條件進(jìn)行優(yōu)化,提高形態(tài)分析效率。參考文獻(xiàn)[16]方法配制硝酸銨緩沖溶液作為流動(dòng)相,配制方便,分離效果較好。酸性條件下溴離子易被氧化,形態(tài)易發(fā)生改變,影響正常離子計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相同濃度的流動(dòng)相pH值低于7時(shí),溴信號(hào)強(qiáng)度較低,色譜峰高較低,峰寬較大;pH值高于7時(shí),溴元素以離子形態(tài)存在,較為穩(wěn)定,溴信號(hào)較強(qiáng),色譜峰形尖銳。兼顧色譜峰的分離效果和色譜柱耐受程度,最終流動(dòng)相pH 9。
圖1 18 mmol/L硝酸+34 mmol/L氨水(A)和56 mmol/L硝酸+67 mmol/L氨水(B)下溴形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig. 1 Chromatograms of 18 mmol/L HNO3 + 34 mmol/L NH4OH (A) and 56 mmol/L HNO3 + 67 mmol/L NH4OH (B)
表1 不同流動(dòng)相下的色譜峰出峰情況Table 1 Chromatographic peaks with different mobile phases
從圖1可見(jiàn),溴酸根出峰時(shí)間早,溴離子出峰時(shí)間晚,流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)越高,待測(cè)物出峰越快,出峰間隔時(shí)間越短,信號(hào)越強(qiáng)。選擇4種硝酸和氨水配比作為流動(dòng)相,調(diào)節(jié)pH 9,對(duì)相同質(zhì)量濃度的溴形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見(jiàn)表1。18 mmol/L硝酸+34 mmol/L氨水的流動(dòng)相分離效果最佳,但分析時(shí)間較長(zhǎng);56 mmol/L硝酸+67 mmol/L氨水的流動(dòng)相,分析用時(shí)最少,信號(hào)最強(qiáng),但兩峰的出峰間隔時(shí)間過(guò)短,分離效果不佳。兼顧分析時(shí)間和分離效果,最終選擇36 mmol/L硝酸+67 mmol/L氨水作為流動(dòng)相、pH 9,8 min可以出峰完畢,在效率和效果上都滿足快速精準(zhǔn)分析的需求。
采用超聲提取結(jié)合HPLC-ICP-MS法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和6 批次溴甲烷熏蒸后櫻桃中的溴形態(tài)進(jìn)行液相色譜分析,獲得色譜圖,見(jiàn)圖2。同時(shí)采用ICP-MS法檢測(cè)櫻桃中的總溴含量進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見(jiàn)表2。
圖2 溴形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和溴甲烷熏蒸后櫻桃中溴形態(tài)(B)色譜圖Fig. 2 Chromatograms of bromine standard solution (A) and bromine in cherries fumigated with methyl bromide (B)
表2 溴甲烷熏蒸后櫻桃中溴酸根、溴離子與總溴的含量與色譜峰出峰時(shí)間(n=2)Table 2 Contents of bromate, bromide ion and total bromine and time of chromatographic peaks in cherries fumigated with methyl bromide (n = 2)
實(shí)驗(yàn)表明,溴酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰時(shí)間為5.656 min,溴離子標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰時(shí)間為6.924 min,熏蒸后櫻桃中溴形態(tài)色譜圖為單峰,出峰時(shí)間如表2所示,以出峰時(shí)間定性,判斷為溴離子色譜峰,說(shuō)明溴甲烷熏蒸后櫻桃中的溴元素皆為溴離子,沒(méi)有溴酸根及其他溴化物存在。水果的基質(zhì)較為簡(jiǎn)單,經(jīng)過(guò)溴甲烷熏蒸后殘留的溴離子基本停留在水果表面,用水超聲即可提取,測(cè)得的溴離子含量與總溴含量相符,可認(rèn)為熏蒸后櫻桃中的總溴殘留即為溴離子殘留。各批次之間溴離子和總溴含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差可見(jiàn),不同批次櫻桃溴殘留差異較大,這與櫻桃熏蒸位置、品質(zhì)差異等因素有關(guān)。
據(jù)報(bào)道,臭氧也可用于果蔬的殺菌和儲(chǔ)存,臭氧的處理會(huì)促使溴酸根形成,但此方法一般用于消除農(nóng)藥殘留和保鮮消毒,并未在進(jìn)出口果蔬的蟲(chóng)害防治上使用。其他文獻(xiàn)調(diào)查也表明,溴酸根多殘留在水樣和米面制品中,沒(méi)有在果蔬中發(fā)現(xiàn)。溴形態(tài)分析方法在溴殘留研究中的應(yīng)用,為水果進(jìn)出口的快速通關(guān)和熏蒸過(guò)程追溯提供了便利。
在本實(shí)驗(yàn)方法下,溴酸根、溴離子以及總溴含量在2.0~100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍中皆呈良好的線性關(guān)系,獲得溴酸根回歸方程=1 651.4,=0.999 8,溴離子回歸方程=2 376.6,=0.999 8,總溴回歸方程=0.009 1+0.010 4,=0.999 9。
表3 櫻桃中溴酸根、溴離子、總溴和溴甲烷的添加回收和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precision of bromate, bromide ion, total bromine and methyl bromide spiked in cherries (n = 6)
將空白本底的櫻桃樣品作為基質(zhì),參考果蔬中常見(jiàn)限量范圍,做添加回收實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證方法的可靠性,結(jié)果見(jiàn)表3。在0.10、5.00、30.00 mg/kg三水平進(jìn)行添加,HPLC-ICP-MS法測(cè)定溴酸根和溴離子含量,獲得溴酸根回收率為89.7%~101.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為2.1%~3.5%,溴離子回收率為85.5%~107.3%,RSD為4.4%~7.0%,定量限為0.10 mg/kg。在0.05、5.00、30.00 mg/kg三水平進(jìn)行添加,ICP-MS法測(cè)定總溴含量,獲得回收率為92.5%~108.3%,RSD為3.1%~7.0%,定量限為0.05 mg/kg。在0.01、5.00、30.00 mg/kg三水平進(jìn)行添加,GC-ECD法測(cè)定溴甲烷含量,獲得回收率為91.3%~97.0%,RSD為6.4%~8.9%,定量限為0.01 mg/kg。這3種方法回收率好、精密度高,適用于果蔬中溴殘留含量的測(cè)定,以滿足水果進(jìn)出口風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)要求及在熏蒸過(guò)程追溯中的應(yīng)用。
將同批次未熏蒸和熏蒸后的櫻桃同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)櫻桃采摘熏蒸到運(yùn)輸入境,以及櫻桃貨架期時(shí)長(zhǎng),分別在熏蒸后3、5、7、10、14、21、28 d進(jìn)行測(cè)定,觀察溴甲烷殘留量和溴離子含量的變化,結(jié)果見(jiàn)表4和表5。
表4 櫻桃中溴甲烷殘留量(n=2)Table 4 Contents of methyl bromide in cherries (n = 2)
從表4可見(jiàn),未熏蒸的6 批次櫻桃皆未檢出溴甲烷,熏蒸后有2 批次櫻桃檢出了少量溴甲烷。經(jīng)查詢,水果的溴甲烷熏蒸投藥量通常為32~64 g/m,土耳其櫻桃熏蒸法的投藥量高達(dá)145 g/m,如保存良好,溴甲烷熏蒸后3 d能測(cè)得少量溴甲烷,1 周后即揮發(fā)完畢無(wú)法檢出,表現(xiàn)了溴甲烷極強(qiáng)的揮發(fā)性。由此可見(jiàn),以櫻桃在當(dāng)?shù)匮艉笕刖车臅r(shí)長(zhǎng),無(wú)法僅憑借溴甲烷殘留量判斷熏蒸情況,為熏蒸過(guò)程追溯帶來(lái)了極大的困難。
從表5可見(jiàn),未熏蒸的6 批次櫻桃中溴離子含量較低,為0~0.177 mg/kg,熏蒸后櫻桃中溴離子含量明顯高于未熏蒸,為3.545~9.190 mg/kg,且未受時(shí)間影響呈明顯降低趨勢(shì)。此結(jié)果與國(guó)外研究報(bào)道相符,果蔬經(jīng)溴甲烷熏蒸會(huì)殘留大量溴離子,其含量會(huì)由于熏蒸位置、包裝方式、個(gè)體差異等因素有所不同,但是否經(jīng)過(guò)了有效熏蒸能直觀體現(xiàn)。溴甲烷熏蒸要求的投藥量較大,這6 批次熏蒸后的櫻桃溴離子含量皆未超過(guò)國(guó)際上溴離子限量20 mg/kg,說(shuō)明145 g/m依然是較為安全的熏蒸劑量。
表5 櫻桃中溴離子含量(n=2)Table 5 Contents of bromide ion in cherries (n = 2)
此次獲得的6 批次進(jìn)口櫻桃品質(zhì)參差不齊,個(gè)別批次發(fā)現(xiàn)害蟲(chóng),測(cè)得櫻桃中溴離子含量較低。作為對(duì)照,另外獲得了4 批次國(guó)內(nèi)確定未經(jīng)過(guò)溴甲烷熏蒸的新鮮櫻桃樣品,對(duì)其溴離子含量進(jìn)行檢測(cè),測(cè)得含量為0~0.082 mg/kg,與6 批次進(jìn)口櫻桃測(cè)得結(jié)果接近。因此,可以判斷這6 批次櫻桃入境前未經(jīng)過(guò)充分的溴甲烷熏蒸。
選取3 批次熏蒸后的櫻桃,在制樣后分別進(jìn)行冷藏保存和常溫保存,保存3 d和7 d后測(cè)定溴離子含量,與當(dāng)天制樣進(jìn)行對(duì)比,觀察櫻桃中溴離子含量是否會(huì)由于制樣時(shí)間和保存條件不同而有所變化,結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 不同保存條件下櫻桃中溴離子含量(n=2)Table 6 Contents of bromide ions in cherries under different storage conditions (n = 2)
由表6可見(jiàn),櫻桃制樣后保存條件和保存時(shí)間對(duì)溴離子含量影響較小,溴離子含量沒(méi)有因保存溫度升高而明顯降低。將櫻桃樣品在-18 ℃冰箱內(nèi)冷凍,數(shù)月后取出再次檢測(cè),熏蒸后櫻桃中的溴離子含量仍未降低,說(shuō)明了溴元素在水果內(nèi)部的穩(wěn)定性,也證明櫻桃熏蒸后的存儲(chǔ)條件不會(huì)使溴離子含量產(chǎn)生顯著變化。
建立了一種純水超聲快速提取、HPLC-ICP-MS檢測(cè)櫻桃中溴元素殘留形態(tài)的分析方法,并通過(guò)ICP-MS法確證其總溴含量,頂空進(jìn)樣-GC法測(cè)定溴甲烷殘留量,對(duì)溴甲烷熏蒸后櫻桃中的溴殘留進(jìn)行了研究。
參照土耳其櫻桃入境檢疫要求將櫻桃進(jìn)行溴甲烷熏蒸處理,研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)溴甲烷熏蒸后的櫻桃中含有的溴元素皆轉(zhuǎn)化為溴離子,沒(méi)有溴酸根形成,測(cè)得的溴離子含量與總溴含量相符。通過(guò)溴甲烷熏蒸后28 d內(nèi)未熏蒸與熏蒸后櫻桃中溴甲烷殘留量和溴離子含量的對(duì)比,發(fā)現(xiàn)溴甲烷揮發(fā)性極強(qiáng),在櫻桃中殘留1 周后即無(wú)法檢出,這使得海關(guān)口岸在進(jìn)出口水果的蟲(chóng)害控制和熏蒸過(guò)程追溯上有一定難度,無(wú)法通過(guò)溴甲烷殘留量判定水果入境前的熏蒸情況。而熏蒸前后櫻桃中的溴離子含量有明顯的差異,熏蒸后櫻桃中的溴離子殘留量遠(yuǎn)高于未熏蒸,并且在櫻桃內(nèi)部穩(wěn)定存在。對(duì)櫻桃中溴離子殘留量的監(jiān)控,是甄別櫻桃入境前是否進(jìn)行了溴甲烷熏蒸的有效手段,也是衡量熏蒸后的溴殘留是否在安全范圍的可靠方式。
本方法快速、簡(jiǎn)便、精密度高,在水果熏蒸過(guò)程追溯的應(yīng)用上可取代溴甲烷殘留量的分析,在水果進(jìn)出口風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控篩查中發(fā)揮作用,促進(jìn)口岸監(jiān)管方式的轉(zhuǎn)型升級(jí)。