頂空氣相色譜-質譜法測定茶葉中溴甲烷

羅春連

（福建省工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)許可證審查技術中心,福州 350003）

種茶、制茶和飲茶文化都起源于中國,千百年來,茶葉借由茶馬古道和海陸絲綢之路由中國傳播至世界各地,備受世界人民喜愛[1-2]。中國茶葉流通協(xié)會在《2021年中國茶葉產(chǎn)銷形勢報告》中指出,我國茶樹種植面積為4 896.09 萬畝,干毛茶總產(chǎn)量306.32萬噸,產(chǎn)值2 928.14億元,茶樹種植面積和茶葉市場消費規(guī)模龐大,相比于往年均有所增加[3]。茶葉產(chǎn)銷規(guī)模取決于茶葉品質[4],但茶葉在種植和儲藏過程中易受病蟲害的影響[5-7]。

溴甲烷是一種廣譜性熏蒸劑,對病菌[8]、昆蟲[9]、線蟲[10]、雜草[11]等病害生物的防治效果尤為顯著,也被用于茶葉的消毒[12]。但溴甲烷的使用不僅會破壞土壤微生態(tài)平衡,還會損耗臭氧層,上世紀末《蒙特利爾議定書》哥本哈根修正案就建議各締約國中發(fā)達國家和發(fā)展中國家分別于2005 年和2015 年將其淘汰[13]。然而聯(lián)合國溴甲烷技術選擇委員會（Methyl Bromide Technical Options Committee,MBTOC）在對20 余種溴甲烷替代物進行評估后發(fā)現(xiàn),溴甲烷的廣譜性消毒優(yōu)勢使其難以完全被替代,因此在一些必要用途上仍需申請豁免使用[14-16]。溴甲烷對農(nóng)田或農(nóng)產(chǎn)品的熏蒸可能會形成殘留,而溴甲烷無色無味難以引起警戒[17],對人體的肺、腎、肝等臟器及神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)造成潛在危害[18],因此溴甲烷殘留量的檢測和控制尤為重要。

當前溴甲烷的檢測方法有離子遷移譜法[19]、酸回流-毛細管色譜法[20]、吹掃-捕集-氣相色譜法[21]等,這些檢測方法對于茶葉中溴甲烷的檢測不夠便捷,且未使用質譜等定性確證工具,尚缺茶葉中溴甲烷檢測的國家標準或行業(yè)標準。溴甲烷是茶葉農(nóng)殘中重點關注的物質,英國對茶葉中溴甲烷殘留限量為0.05 mg/kg,我國GB 2763—2021 規(guī)定其臨時殘留限量為0.02 mg/kg,因此建立茶葉中溴甲烷的便捷、準確、靈敏的檢測方法至關重要。氣相色譜-質譜（GC-MS）法能夠對未知樣品中易揮發(fā)的物質進行定性定量檢測,結合溴甲烷不溶于水、熔點低、易揮發(fā)等理化特性,采用頂空GC-MS 法檢測茶葉中溴甲烷殘留量,能夠為茶葉中溴甲烷的檢驗和監(jiān)管提供技術支持,促進茶葉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

分析天平：ME203E 型,美國梅特勒-托利多集團。

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2020 型,日本島津公司。

頂空進樣器：HS-20型,日本島津公司。

多功能粉碎機：WJX-A500型,上海緣沃工貿(mào)有限公司。

溴甲烷：色譜純,天津阿爾塔科技有限公司。

甲醇：色譜純,德國默克集團。

氯化鈉：質量分數(shù)為99.8%,國藥集團化學試劑有限公司。

飽和氯化鈉溶液：準確稱取36.00 g 氯化鈉于250 mL燒杯中,加入100 mL去離子水,于磁力攪拌器中常溫攪拌至溶解。

溴甲烷標準貯備液：100 μg/mL,準確稱取0.010 0 g溴甲烷,加入甲醇稀釋至100 mL。

氦氣：體積分數(shù)不小于99.999%,福州新航工業(yè)氣體有限公司。

茶葉樣品：分別為白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶,來自福建寧德、福州、泉州和南平四地茶葉產(chǎn)區(qū)。

實驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 頂空進樣器

轉換閥溫度：50 ℃；傳輸線溫度：65 ℃；平衡時間：30 min。

1.2.2 氣相色譜儀

色譜柱：DB-5MS 石英毛細管柱[30 m×0.25 mm,0.25 μm,安捷倫科技(中國)有限公司]；進樣口溫度：220 ℃；離子源溫度：300 ℃；接口溫度：300 ℃；柱溫：50 ℃,保持3 min；進樣方式：分流進樣,分流比為100∶1；載氣：氦氣,流量為0.80 mL/min；進樣體積：100 μL。

1.2.3 質譜儀

離子源：電噴霧離子源(ESI),正離子模式；掃描方式：選擇反應監(jiān)測（SRM）；溴甲烷SIM監(jiān)測離子：m/z94,96（定量離子為m/z94）。

1.3 實驗步驟

1.3.1 溴甲烷的提取

參照GB/T 8303—2013,將茶葉樣品研磨粉碎,過30 目篩（孔徑600 μm）,制備成茶粉。分別稱取2.50 g 茶粉于20 mL 頂空瓶中,加入5 mL 的飽和氯化鈉溶液,立即旋蓋密封（瓶蓋中心為聚四氟乙烯薄膜,便于扎入進樣針）,置于頂空裝置中,于40 ℃保溫30 min,抽取100 μL上部氣體進行GC-MS檢測。

1.3.2 溴甲烷標準曲線的繪制

取100 μg/mL 溴甲烷標準貯備液適量,用甲醇分別稀釋至0、2.5、5、10、20、40 μg/mL,制備成系列溴甲烷標準溶液。分別在含有5.0 mL 飽和氯化鈉溶液的頂空瓶中加入10 μL不同濃度的溴甲烷標準溶液,于40 ℃保溫30 min,抽取100 μL上部氣體進行GC-MS檢測,以溴甲烷質量為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸,得標準曲線線性方程和相關系數(shù)。

1.3.3 定量方法

采用外標法進行定量。在1.3.2 繪制標準曲線的基礎上,將待測茶葉樣品按照1.3.1的方法研磨成粉并經(jīng)過頂空提取之后進行GC-MS 檢測,以定量離子m/z94 為SIM 監(jiān)測指標,將相同保留時間的目標峰的峰面積帶入標準曲線進行溴甲烷質量換算。每種待測茶葉樣品平行測定6 次,取平均值作為測定值。

2 結果與討論

2.1 色譜分離條件的選擇

氣相色譜柱作為固定相,對同一樣品中的不同物質具有不同的吸附和解離能力,其型號對目標物質的分離度和保留時間影響較大。溴甲烷的極性較弱,不溶于水而易溶于有機溶劑,弱極性的DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）對溴甲烷的分離效果優(yōu)于強極性的DB-WAX 毛細管柱（30 m×0.25 mm,0.5 μm）。氣相色譜柱的初始溫度為50 ℃,高于溴甲烷的沸點4 ℃,在該溫度運行模式下,溴甲烷的保留時間為1.65 min,因此無需設置升溫程序,可按50 ℃恒溫運行。對比不同分流比對溴甲烷分離的影響,分流比200∶1時,溴甲烷的響應信號較低；分流比為100∶1時,溴甲烷的響應信號與分離度均較好；分流比50∶1時,溴甲烷的分離度較差,因此確定最佳分流比為100∶1。

2.2 溴甲烷頂空提取條件優(yōu)化

在進行目標物的頂空提取時,飽和氯化鈉溶液是常用的提取溶劑,其化學惰性能夠避免頂空提取過程中的基質效應[22],還能發(fā)揮鹽析作用改變目標物在頂空瓶內(nèi)的分配系數(shù),從而提高檢測靈敏度[23]。分別在茶葉基質中添加不同濃度的溴甲烷,比較不同飽和氯化鈉溶液體積對溴甲烷提取的影響,當溴甲烷添加質量分數(shù)分別為0.02、0.04、0.20 mg/kg時,分別使用2.5、5.0 mL 飽和氯化鈉溶液進行提取,對應的色譜峰面積如圖1 所示。結果表明,較大體積的飽和氯化鈉溶液有助于提高溴甲烷的檢測靈敏度,當茶葉基質中溴甲烷含量越高時,鹽析作用越明顯,使用5.0 mL的飽和氯化鈉溶液相比于2.5 mL的峰面積差值大,這是由于溴甲烷沸點（4 ℃）低且不溶于水,在頂空瓶體系中易受熱揮發(fā),飽和氯化鈉的鹽析作用降低了溴甲烷在水中的溶解度,當飽和氯化鈉體積增加時,進一步壓縮了頂空瓶中的氣體體積,從而起到濃縮作用,當茶葉基質中溴甲烷濃度越高時,其濃縮效果越明顯,儀器檢測的響應值越大。因此選定飽和氯化鈉溶液的添加體積為5.0 mL。

圖1 不同飽和氯化鈉溶液的體積對應的茶葉基質中不同濃度溴甲烷的色譜峰面積

2.3 線性關系

按照1.3.2繪制標準曲線,得溴甲烷線性方程為y=7.357 3x-18.012,相關系數(shù)為r=0.999 7,表明線性良好,該GC-MS 檢測方法適用于溴甲烷的檢測。由于不同重復批次中目標物質在頂空提取過程中固-液、氣-液的分配比存在微小差異,高濃度樣品的檢測偏差會被放大,因此當樣品中溴甲烷質量大于200 ng時,存在一定的檢測偏差,但這種偏差影響較小,依然可以保證溴甲烷測定值的準確度,故溴甲烷線性范圍確定為0～400 ng。

2.4 方法檢出限和定量限

茶葉樣品基質組分復雜,可能會對溴甲烷的檢測造成干擾,樣品背景干擾越小,溴甲烷的檢出限和定量限越低。在頂空提取的條件下,茶葉空白基質中主要干擾物質為揮發(fā)性風味物質[24],這些揮發(fā)性風味物質有數(shù)十種乃至上百種[25-26],容易對目標物造成檢測干擾,而GC-MS 的SIM 監(jiān)測模式可對目標質荷比（m/z）的離子進行監(jiān)測掃描,從而排除其它離子的干擾。分別在2.50 g不同茶葉空白基質中添加10 μL 的5 μg/mL 溴甲烷標準溶液,再加入5.0 mL飽和氯化鈉溶液進行頂空提取和GC-MS檢測,由白茶（圖2）、綠茶（圖3）、烏龍茶（圖4）和紅茶（圖5）的空白基質及其加標樣品的SIM色譜圖可知,不同茶葉空白基質對溴甲烷目標峰干擾較小,表明該法可用于白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶中溴甲烷的分離檢測。

圖2 白茶空白基質（A）與其加標樣品（B）的SIM色譜圖

圖3 綠茶空白基質（A）與其加標樣品（B）的SIM色譜圖

圖4 烏龍茶空白基質（A）與其加標樣品（B）的SIM色譜圖

圖5 紅茶空白基質（A）與其加標樣品（B）的SIM色譜圖

分別在2.50 g 不同茶葉空白基質中添加10 μL的5 μg/mL 溴甲烷標準溶液,再加入5.0 mL 飽和氯化鈉溶液進行頂空提取和GC-MS 檢測,以溴甲烷目標峰的信噪比（S/N）≥3 為檢出限,信噪比（S/N）≥10為定量限。計算得上述4種茶葉基質存在的條件下溴甲烷目標峰的信噪比（S/N）分別為13.2、15.2、12.1、15.3,確定該方法的定量限（S/N≥10）為0.02 mg/kg,換算得方法檢出限（S/N≥3）為0.006 mg/kg。GB 2763—2021規(guī)定茶葉中溴甲烷的臨時殘留限量為0.02 mg/kg,該方法的檢測靈敏度能夠滿足國標限量檢測需求。

2.5 方法精密度和準確度

分別在2.50 g 不同茶葉空白基質中添加1.0、2.0、10.0倍定量限（0.02 mg/kg）的溴甲烷標準溶液,測定體系中溴甲烷的含量并計算加標回收率及變異系數(shù)（CV）,每種樣品每個加標水平平行測定6 次,取平均值作為測定值,結果見表1。由表1 可知,不同茶葉樣品中溴甲烷的加標回收率為91.97%～105.33%,變異系數(shù)不大于10.77%。國標GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求目標物質量分數(shù)在0.01～0.1 mg/kg時,回收率應為60%～120%,變異系數(shù)要小于21%；目標物濃度在0.1～1 mg/kg 時,回收率為80%～110%,變異系數(shù)要小于15%。結果表明,該方法的回收率和精密度均符合國標要求,方法具有可行性。

表1 不同茶葉空白基質中溴甲烷加標回收試驗結果（n=6）

3 結語

在優(yōu)化提取方法的基礎上建立了不同茶葉中溴甲烷的頂空GC-MS 檢測法,該法滿足GB/T 27404—2008相關要求,靈敏度和準確度高,重現(xiàn)性好,可為茶葉中溴甲烷殘留的檢測和監(jiān)管提供技術支持,有利于茶葉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。