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    人乙醛脫氫酶2與NusA的融合表達(dá)

    2022-07-07 03:05:00繆士濤宮興文
    食品科學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:緩沖液質(zhì)粒活力

    繆士濤,胡 敏,宮興文

    (浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310018)

    我國(guó)的酒文化歷史悠久,源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。乙醇在人體內(nèi)主要經(jīng)乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)的催化作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰儆梢胰┟摎涿福╝ldehyde dehydrogenase,ALDH)轉(zhuǎn)化為乙酸,進(jìn)入三羧酸循環(huán),代謝為水和二氧化碳,排出體外。乙醛的積累會(huì)刺激大腦神經(jīng),加速血液循環(huán),引起嘔吐、頭痛等不適癥狀。ADH無(wú)論在東亞人群還是歐美人群中,數(shù)量和酶活性均相當(dāng),而ALDH則是一個(gè)龐大的蛋白質(zhì)家族,包括ALDH1、ALDH2、ALDH3和ALDH4等,其中,參與酒精代謝的主要是位于肝臟線粒體的ALDH2。但是,在中國(guó)和其他亞洲國(guó)家中,約有35%~40%的個(gè)體缺乏正常的ALDH2,主要是該蛋白的第487位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸(E487K),突變比例顯著高于歐美人群。突變型ALDH2(E487K)活性基本喪失,攜帶ALDH2突變基因()的東亞人群對(duì)乙醇非常敏感,少量飲酒就會(huì)臉紅和頭暈,極易引起酒精中毒。此外,國(guó)內(nèi)嗜酒或酒精依賴(lài)性人群高達(dá)2億左右,酒精相關(guān)疾病的發(fā)病率居高不下,首當(dāng)其沖的是酒精性肝病,包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化、纖維化乃至肝功能衰竭等。過(guò)量飲酒也是多種癌癥如肝癌、食管癌、賁門(mén)癌、胃癌、口腔癌、上喉癌等的引發(fā)因素,還會(huì)引起酒精性相關(guān)出生缺陷病等疾病,嚴(yán)重危害人體健康。

    當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的解酒產(chǎn)品主要有中草藥提取物(如葛根、人參)、肽類(lèi)(如玉米肽、花生蛋白肽)以及蛋白類(lèi)(如乳制品)等,解酒機(jī)理分別為調(diào)理酒后的不適癥狀、提升ALDH2輔酶NAD含量以及蛋白質(zhì)凝固在胃黏膜上形成保護(hù)膜等。這些產(chǎn)品雖然有一定的解酒作用,但是并不能解決基因突變所造成的酶活性下降這個(gè)本質(zhì)問(wèn)題,僅僅停留在“治標(biāo)”層面上。而直接從動(dòng)植物、微生物中提取ALDH2,或者利用微生物發(fā)酵方法獲得ALDH2,可以更加有效地將乙醛轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?,促進(jìn)酒精的代謝,是一個(gè)“治本”的方法。

    目前,已有一些基于ALDH2解酒產(chǎn)品的研究報(bào)道,例如,從動(dòng)物組織和微生物菌體中提取,或者通過(guò)畢赤酵母等基因工程菌株進(jìn)行發(fā)酵制備。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、細(xì)胞增殖快速、蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn),在基因工程研究中被廣泛使用,并且已有一些通過(guò)大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行ALDH2重組蛋白制備的研究報(bào)道。但是,這些研究表明ALDH2重組蛋白在大腸桿菌中通常表達(dá)為溶解性很差且沒(méi)有活性的包涵體。為了解決這一問(wèn)題,本研究擬將目的基因插入到載體pET44b(+)上-tag下游的特定位點(diǎn),使ALDH2與NusA-tag融合表達(dá),以便得到能在大腸桿菌中可溶表達(dá)且具有較高活性的ALDH2。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21(DE3)菌株、pET44b(+)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存;T載體pMD19-T-simple、Competent Cell Preparation Kit、限制性?xún)?nèi)切酶(RI、I) 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;DNA聚合酶、dNTP、T4-DNA連接酶、Diaspin柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、50×TAE、4S Green核酸染色劑、DNA Marker生工生物工程(上海)股份有限公司;其他主要化學(xué)試劑(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    LB液體培養(yǎng)基:稱(chēng)量1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、1 g NaCl,用蒸餾水定容至100 mL。用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

    LB固體培養(yǎng)基:稱(chēng)量1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、1 g NaCl、2 g瓊脂粉,用蒸餾水定容至100 mL。用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。待溶液冷卻至50 ℃,加入100 μL氨芐青霉素并在超凈臺(tái)上倒平板,凝固后備用。

    1.2 儀器與設(shè)備

    恒溫振蕩培養(yǎng)箱 華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;IMS-30制冰機(jī) 常熟市雪科電器有限公司;DK-8D恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司;CHB-100恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司;SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;JJ-CJ-1FD超凈臺(tái)蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限司;TC-220聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR) 美國(guó)MJ Research公司;LDZX-50KBS滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;瓊脂糖電泳平板裝置、垂直型轉(zhuǎn)膜電泳槽、垂直蛋白電泳裝置 北京君意電泳設(shè)備有限公司;JS-680B凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司;超微量紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 鼎昊源科技公司;JY92-IID超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1-融合表達(dá)載體的構(gòu)建

    依據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的人(GenBank編號(hào)為JF432260)的基因序列和-tag在pET44b(+)的位置設(shè)計(jì)引物,分別引入限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)RI和I在上游引物和下游引物的5’端,并在下游引物加入終止密碼子TAA。上游引物:5’-TAATgaattcTGCC GTGCCTGCCCCCAACCA-3’;下游引物:5’-GCG GGctcgagTTATGAGTTCTTCTGAGGCACTTT-3’。

    以基因?yàn)槟0?,PCR設(shè)定條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min;65 ℃退火2 min;72 ℃延伸2 min;72 ℃最后一步延伸10 min;變性、退火、延伸步驟總共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中,挑選陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序。用RI和I酶切測(cè)序正確的質(zhì)粒,提取酶切片段并與同樣酶切的pET44b(+)質(zhì)粒連接,得到重組載體pET44b(+)-并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)。從轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中挑單菌落,提取質(zhì)粒,用RI和I雙酶切驗(yàn)證插入片段的大小,并再次測(cè)序以確認(rèn)核苷酸序列的一致性。

    1.3.2 重組蛋白NusA-ALDH2的表達(dá)

    將攜帶重組載體pET44b(+)--的大腸桿菌BL21(DE3)菌株接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的2 mL LB培養(yǎng)基中,于15 mL離心管中培養(yǎng)。在37 ℃、240 r/min的振蕩搖床上培養(yǎng)過(guò)夜。取0.5 mL細(xì)胞,接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的15 mL LB培養(yǎng)基中。37 ℃振蕩孵育3 h,加入異丙基---硫代半乳糖苷(isopropyl---thiogalactopyranoside,IPTG)至終濃度為1 mmol/L,誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)5 h后,10 000 r/min離心收集細(xì)胞,重懸于25 mmol/L Tris-HCl緩沖液,超聲裂解細(xì)胞。再次離心,得到上清液和沉淀。為了提高蛋白的表達(dá),通過(guò)改變發(fā)酵溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,分別在25、30 ℃和37 ℃條件下誘導(dǎo)不同的時(shí)間,IPTG濃度范圍為0.25~1.5 mmol/L。

    1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)

    用SDS-PAGE(10%聚丙烯酰胺)檢測(cè)重組蛋白的分子質(zhì)量、表達(dá)量和純度。每道凝膠中加入20 μL的樣品。電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色,用醋酸-甲醇-水混合物(10∶30∶60,/)脫色。

    1.3.4 NusA融合蛋白的切除及純化

    在重組載體pET44b(+)--中,與目的基因之間有腸激酶的酶切位點(diǎn),以便目的蛋白的酶切釋放,同時(shí),在NusA上游具有His-tag,以便通過(guò)金屬離子螯合層析進(jìn)行親和純化。參照楊銀萍的方法進(jìn)行親和層析,將Ni-NTA層析柱預(yù)先用含有低濃度咪唑的緩沖液平衡,然后將菌體破碎離心得到的上清液用0.45 μm濾膜處理,上樣到層析柱中,用平衡緩沖液洗去雜蛋白,然后加入腸激酶進(jìn)行酶切,再用平衡緩沖液洗下ALDH2,最后用含有0.5 mol/L咪唑的洗脫液洗下NusA。

    1.3.5 重組蛋白的酶活力測(cè)定

    參考OKIBE反應(yīng)體系進(jìn)行酶活力測(cè)定,反應(yīng)體系為:0.3 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)、0.05 mL 20 mmol/L-NAD、0.05 mL 100 mmol/L乙醛、0.1 mL 3 mol/L KCl、0.03 mL 1 mol/L-巰基乙醇、2.37 mL HO、0.10 mL重組蛋白。在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度的變化情況,定義每分鐘消耗 1 μmol乙醛為1個(gè)酶活力單位(U)。

    1.3.6 最適反應(yīng)溫度和pH值測(cè)定

    最適反應(yīng)溫度的測(cè)定:分別在10、20、30、37、40、50、60 ℃的反應(yīng)體系中測(cè)定重組蛋白酶活力,將37 ℃測(cè)得的酶活力定為100%,其他溫度下的酶活力與之相比較得出相對(duì)酶活力,從而確定不同溫度下ALDH2的活性。

    最適反應(yīng)pH值測(cè)定:配制pH 4~6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH 7.0和pH 8.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、pH 8.5和pH 9.0的Tris-HCl緩沖液,以及pH 10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(濃度均為0.1 mol/L)。調(diào)節(jié)酶活力反應(yīng)體系至不同pH值,分別測(cè)定重組蛋白在不同pH值反應(yīng)體系中的催化效率。以pH 8時(shí)的酶活力為100%,測(cè)定不同pH值環(huán)境中的酶活力,計(jì)算相對(duì)酶活力。

    1.3.7 金屬離子對(duì)重組蛋白活性的影響

    在酶活測(cè)定體系中,分別加入Ca、K、Na、Mg、Mn等金屬離子至終濃度為5 mmol/L,在適當(dāng)溫度和pH值下測(cè)定不同金屬離子對(duì)重組蛋白的激活作用,以加入K的反應(yīng)體系測(cè)得的酶活力為100%,計(jì)算重組蛋白的相對(duì)酶活力。

    1.3.8 野生型ALDH2的表達(dá)制備

    本實(shí)驗(yàn)室已有野生型ALDH2的基因工程菌株,參照楊銀萍的方法進(jìn)行表達(dá)、純化和復(fù)性。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖表繪制

    用Origin對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合、繪圖,并用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)的顯著性進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 NusA-Aldh2的分子克隆

    根據(jù)NCBI網(wǎng)站上人基因序列(GenBank編號(hào)為JF432260)設(shè)計(jì)引物,分別引入限制性?xún)?nèi)切酶RI和I位點(diǎn)。根據(jù)引物值及盡量減少雜帶的原則設(shè)計(jì)PCR的退火溫度為65 ℃,模板為本實(shí)驗(yàn)室保存的含有序列的質(zhì)粒,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。之后,將目的片段切膠回收,與pMD19-T-simple載體于16 ℃的金屬浴中連接過(guò)夜,然后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α菌株。

    挑選轉(zhuǎn)化成功的單菌落,在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12~16 h,提質(zhì)粒,凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩S肦I和I進(jìn)行雙酶切處理,酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖1所示,質(zhì)粒被切割成兩部分,長(zhǎng)度分別為2 700 bp和1 500 bp左右,與T載體和基因片段的長(zhǎng)度吻合,表明基因成功與T載體連接,基因測(cè)序結(jié)果也表明序列正確。

    圖1 EcoRI和XhoI 雙酶切處理質(zhì)粒pMD19-T-Aldh2Fig. 1 Digestion of pMD19-T-Aldh2 with EcoRI and XhoI

    提取表達(dá)載體pET44b(+)質(zhì)粒,用RI和I雙酶切。然后,切膠回收基因片段和pET44b(+)載體片段進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株。之后,提取質(zhì)粒,用RI和I雙酶切鑒定。如圖2所示,雙酶切后得到2個(gè)條帶,長(zhǎng)度分別約1 500 bp和7 000 bp,與基因片段和pET44b(+)載體片段長(zhǎng)度吻合,同時(shí),基因測(cè)序結(jié)果也正確,表明重組表達(dá)載體pET44b(+)--構(gòu)建成功。

    圖2 EcoRI和XhoI雙酶切處理pET44b(+)-NusA-Aldh2Fig. 2 Digestion of pET44b(+)-NusA-Aldh2 with EcoRI and XhoI

    重組表達(dá)質(zhì)粒的組成如圖3所示,位于的下游,中間具有腸激酶的酶切位點(diǎn),以便將重組蛋白切開(kāi)。同時(shí),NusA的上游具有6個(gè)His-tag,以便重組蛋白的親和純化。

    圖3 重組表達(dá)載體pET44b(+)-NusA-Aldh2的質(zhì)粒圖譜Fig. 3 Construction of plasmid pET44b(+)-NusA-Aldh2

    2.2 NusA-ALDH2融合蛋白的表達(dá)

    將構(gòu)建好的工程菌培養(yǎng)過(guò)夜,用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),結(jié)果如圖4所示,誘導(dǎo)后,在分子質(zhì)量約120 kDa位置處出現(xiàn)了新的蛋白條帶,該蛋白與NusAALDH2融合蛋白的理論分子質(zhì)量一致。將誘導(dǎo)后的菌體破碎離心后,在上清液中出現(xiàn)了明顯的條帶,并且與NusA-ALDH2融合蛋白的理論分子質(zhì)量一致。這些結(jié)果說(shuō)明ALDH2與NusA蛋白融合后能夠表達(dá),并且融合蛋白的溶解性也得到了很大提高,不再是以沉淀形式存在的包涵體。

    圖4 融合蛋白的表達(dá)情況Fig. 4 Expression of fusion protein

    為了提高重組蛋白的表達(dá)量,通過(guò)改變發(fā)酵溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度等方法對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終得到的最佳表達(dá)條件為在37 ℃用0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h。

    2.3 融合蛋白NusA-tag的切除及純化

    在表達(dá)載體pET44b(+)上,目的基因的插入位置與-tag之間有一個(gè)腸激酶的酶切位點(diǎn),即天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴(lài)氨酸(DDDDK)序列,因此,可以用腸激酶將融合蛋白切開(kāi),釋放出ALDH2。由于腸激酶的活性會(huì)被磷酸鹽抑制,所以在破碎菌體時(shí)選擇25 mmol/L Tris-HCl作為緩沖液。

    收集NusA-ALDH2工程菌破碎離心后得到的上清液,即可溶表達(dá)的融合蛋白,用腸激酶酶切處理,通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)酶切情況。如圖5所示,分子質(zhì)量120 kDa左右的融合蛋白在酶作用下逐漸裂解,條帶消失,同時(shí),在55 kDa位置處的條帶濃度有所增加,有ALDH2產(chǎn)生,說(shuō)明融合蛋白可以被腸激酶切開(kāi)。但是,釋放出的ALDH2含量較低,這可能和融合蛋白的分子質(zhì)量過(guò)大,表達(dá)量較低有關(guān)。

    圖5 腸激酶處理NusA-ALDH2Fig. 5 SDS-PAGE analysis of NusA-ALDH2 digested with enterokinase

    NusA-ALDH2融合蛋白的純化,首先是將重組蛋白結(jié)合在Ni-NTA柱上,用含有20 mmol/L咪唑的平衡緩沖液除去雜蛋白,然后加入腸激酶,切開(kāi)融合蛋白,釋放出ALDH2,最后將帶His-tag的NusA洗脫。如圖6所示,經(jīng)親和純化可以得到較高純度的ALDH2重組蛋白,分子質(zhì)量約55 kDa。

    圖6 NusA-ALDH2的親和純化Fig. 6 SDS-PAGE analysis of affinity-purified NusA-ALDH2

    2.4 重組蛋白的活性測(cè)定結(jié)果

    ALDH2的輔酶是氧化型輔酶I(NAD),在催化反應(yīng)中,NAD接受氫后變?yōu)檫€原型輔酶I(NADH)。NADH在波長(zhǎng)340 nm處有特定的紫外吸收,因此可以通過(guò)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)波長(zhǎng)340 nm處吸光度的變化計(jì)算NADH生成量,從而得出單位時(shí)間內(nèi)底物乙醛消耗量。根據(jù)文獻(xiàn)[20]方法測(cè)定重組蛋白在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中的酶活性,吸光度變化如圖7所示,經(jīng)過(guò)換算,重組蛋白的酶活力為1.64 U/mL。

    圖7 重組蛋白酶促反應(yīng)吸光度變化Fig. 7 hanges in absorbance during reaction catalyzed by recombinant protease

    2.5 最適反應(yīng)溫度和pH值測(cè)定結(jié)果

    酶的催化效率易受到溫度的影響,不同的酶具有不同的最適反應(yīng)溫度。以37 ℃時(shí)酶活力為100%,對(duì)重組蛋白的相對(duì)酶活力進(jìn)行研究,如圖8所示,隨著溫度的升高,酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),在37 ℃時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)達(dá)到60 ℃時(shí),相對(duì)酶活力不足原來(lái)的30%,酶活力損失嚴(yán)重。重組蛋白在40 ℃能保持一定的酶活性,對(duì)于人體的溫度范圍有一定的適應(yīng)性,為今后解酒藥物的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    圖8 重組蛋白的最適催化溫度Fig. 8 Optimum temperature of recombinant protein

    酶促反應(yīng)體系的pH值影響酶活力,不同酶只能在各自適合的pH值范圍內(nèi)才能表現(xiàn)較好的催化活性,其中,酶催化活力最大時(shí)的pH值被稱(chēng)為酶的最適pH值。重組ALDH2在不同pH值下的相對(duì)酶活力如圖9所示,重組蛋白的最適pH值為7.0,在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件下的活性損失較大。

    圖9 重組蛋白的最適pH值Fig. 9 Optimum pH for recombinant protein

    2.6 金屬離子對(duì)重組蛋白活性的影響

    Ca、K、Na、Mg和Mn均有不同程度的激活作用。在本研究的標(biāo)準(zhǔn)酶活力測(cè)定體系中采用K,但從圖10可以看出Mg的激活作用高于K,可能是Mg和氨基酸殘基之間形成的配位鍵更適合穩(wěn)定重組蛋白的空間構(gòu)象,從而表現(xiàn)出更好的活性。

    圖10 不同金屬離子對(duì)重組蛋白活性的影響Fig. 10 Effects of metal ions on the activity of recombinant protein

    2.7 野生型ALDH2的制備

    本實(shí)驗(yàn)室曾進(jìn)行了野生型ALDH2的基因工程制備,目的基因克隆在pET44b(+)質(zhì)粒的I和RI位點(diǎn)之間,上游引入了8個(gè)His-tag用于親和純化,下游引入了終止密碼TAA。制備的重組ALDH2以無(wú)活性包涵體形式存在于沉淀中,分子質(zhì)量約為55 kDa,上清液中幾乎看不到ALDH2重組蛋白(圖11)。

    圖11 野生型ALDH2的表達(dá)情況Fig. 11 SDS-PAGE analysis of expression of wild-type ALDH2

    野生型ALDH2經(jīng)過(guò)純化和復(fù)性,最終得到的重組蛋白活性為1.43 U/mL,低于以融合表達(dá)方法制備的重組蛋白。

    3 討 論

    ALDH2是非常具有市場(chǎng)前景的解酒用蛋白酶,主要以同型亞基四聚體的形式存在,每個(gè)亞基含有518個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為55 kDa。關(guān)于其催化機(jī)理,相關(guān)研究表明ALDH2的催化殘基包括Asn169、Glu268和Cys302,其中,Asn169的側(cè)鏈酰胺基、Cys302的主鏈亞胺基與底物醛基的氧原子形成相互作用,Cys302的側(cè)鏈巰基負(fù)責(zé)親核攻擊底物醛基的碳原子從而形成過(guò)渡態(tài)中間體,而Glu268負(fù)責(zé)活化水分子,使之能與過(guò)渡態(tài)中間體反應(yīng),形成最終的產(chǎn)物,輔酶NAD在整個(gè)催化反應(yīng)中起著接受質(zhì)子的作用,最后轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADH。

    由于ALDH2在解酒方面的應(yīng)用潛力,許多科研工作者進(jìn)行了相關(guān)的研究。在ALDH2的基因工程制備方面,畢赤酵母和大腸桿菌是應(yīng)用最多的兩種宿主細(xì)胞,但是畢赤酵母的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、基因工程操作比較復(fù)雜。黃錕等利用畢赤酵母分泌表達(dá)ALDH2,得到的重組蛋白活性?xún)H為0.115 U/mL,趙錦等通過(guò)畢赤酵母制備的ALDH2活性為0.315 U/mL,活性較低。而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn),因此被廣泛使用。但是,以大腸桿菌為宿主細(xì)胞,采用常規(guī)基因工程方法制備的ALDH2通常會(huì)形成無(wú)活性的包涵體,雖然可以通過(guò)復(fù)性恢復(fù)部分活性,但是,增加了生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性。

    以往研究表明,在大腸桿菌中外源蛋白與NusA融合表達(dá)時(shí)能表現(xiàn)出較好的可溶性,部分重組蛋白在保留NusA-tag時(shí)仍具備生物活性,多數(shù)重組蛋白在切除NusA-tag后活性得到了不同程度的提高。因此,本研究將NusA-tag與ALDH2融合表達(dá),以消除ALDH2包涵體,結(jié)果表明這種方法的確可以提高重組蛋白的可溶性。劉向宇等將內(nèi)含肽標(biāo)簽與ALDH2融合表達(dá),但融合蛋白仍以包涵體形式存在,還需要經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性過(guò)程來(lái)恢復(fù)活性。所以,融合標(biāo)簽的選擇也是一個(gè)重要的因素。

    在本研究中,通過(guò)融合表達(dá)制備的重組蛋白酶活力為1.64 U/mL,略高于文獻(xiàn)報(bào)道的ALDH2包涵體復(fù)性后的活性,例如,黃娟制備的野生型ALDH2包涵體經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性,最終的活性為1.449 U/mL,而本實(shí)驗(yàn)室制備的野生型ALDH2包涵體復(fù)性后的活性為1.43 U/mL。因此,將增溶標(biāo)簽NusA與ALDH2融合表達(dá)既可以實(shí)現(xiàn)重組蛋白的可溶表達(dá),簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝,還可以使重組蛋白具有更好的活性。

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