甘草苷對大鼠心梗后心室重構的保護作用及潛在機制

莫佳佳 趙炎 周鵬 儲昭興 邵莉 王翔

【摘要】目的：探討甘草苷對大鼠心梗后心室重構的保護作用及機制。方法：采用左冠脈結扎術制備大鼠心梗模型，造模24h后將成模的大鼠隨機分為模型組、甘草苷（25、50、100 mg/kg）組、卡托普利（2.5 mg/kg）組，另設假手術組，連續(xù)灌胃給藥28 d。末次給藥后，采用PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)檢測血流動力學指標及測量心臟重量指數(shù)（HWI），HE及天狼星紅染色觀察大鼠心肌組織病理學變化，TUNEL染色觀察大鼠心肌組織中細胞凋亡情況，免疫熒光法檢測大鼠心肌組織 CXCR2的表達，Western blot法檢測大鼠心肌組織 CXCR2、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表達，ELISA法檢測心肌組織中IL-1β、IL-17水平。結果：甘草苷較模型組能夠顯著提高模型大鼠左心室收縮壓（LVSP）、左心室壓力最大收縮率（+dp/dtmax）、左心室壓力最大舒張率（-dp/dtmax），降低左心室舒張末期壓（LVEDP）和大鼠心臟HWI（P<0.05，P<0.01），且作用呈現(xiàn)劑量依賴性。LIQ最佳劑量100mg/kg下進一步研究，結果可見LIQ能夠明顯改善心肌病理改變，減輕心肌間質膠原的過度沉積，抑制心肌細胞凋亡（P<0.01），減少CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表達（P<0.01），以及下調炎癥因子IL-1β、IL-17含量（P<0.01）。結論：甘草苷對大鼠心梗后心室重構具有明顯的保護作用，其機制可能與調控CXCR2/NF-κB信號軸，減少炎性因子釋放，發(fā)揮抗炎作用有關。

【關鍵詞】甘草苷;大鼠;后心室重構;保護作用;潛在機制

【中圖分類號】S567.7+1【文獻標識碼】A【文章編號】2026-5328（2022）04--02

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）簡稱心梗，是當前全球范圍內心衰發(fā)生最常見及最重要的病因之一[1]。心梗后，心臟的結構與功能常被“心室重構（ventricular remodeling，VR）”這一病理生理過程調控，表現(xiàn)為心肌細胞、非心肌細胞的凋亡、肥大與表型改變以及細胞外基質平衡的破壞。VR的病理機制受多種因素的影響，在這些因素中，炎癥反應起著關鍵作用。當心梗后病灶部位能夠不斷的產生免疫細胞趨化因子，招募循環(huán)系統(tǒng)的免疫細胞進入梗塞心肌區(qū)域，產生致炎因子不斷損傷心肌組織，甚至周圍組織，加劇炎癥破壞[2]。CXC受體2（CXCR）為多種免疫細胞的趨化因子受體，與包括心力衰竭在內眾多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，通過CXCR2敲除或使用選擇性CXCR2抑制劑能夠減弱Ang II 誘導的小鼠心臟重塑和炎癥反應，而NF-κB為多向調節(jié)的轉錄因子，可受CXCR2的調控，在炎癥反應的調控中處于核心地位，參與心衰的發(fā)生發(fā)展過程。甘草苷（Liquiritin，LIQ）為甘草的活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等藥理作用，研究表明，LIQ可以通過抑制炎癥細胞遷移，減輕心肌纖維化，減輕心肌損傷等發(fā)揮心臟保護作用。然而LIQ是否能抑制大鼠心梗后心室重構，其抑制心室重構的作用是否與減輕炎癥反應有關尚未明確。因此，本研究旨在探討LIQ對大鼠心梗后心室重構的作用及在心室重構過程中對CXCR2參與的炎癥軸的影響，以期為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1.實驗材料

1.1試驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質量200-250 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（動物許可證號為SCXK（魯）2019-003）。

1.2藥物及試劑

甘草苷（上海源葉生物科技有限公司，批號CAS#551-15-5）;卡托普利片（中孚藥業(yè)股份有限公司，批號1012016080156）;天狼星紅染色液購自北京索萊寶科技有限公司;HE染色試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天科技有限公司;CXCR2單抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，p-NF-κB抗體購自美國Abcam公司;IL-1β、IL-17試劑盒購自武漢酶免生物科技有限公司。

1.3主要儀器

HX-300S型小型動物呼吸機，成都泰盟科技有限公司;PowerLab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，澳大利亞AD Instruments;ATOM全自動酶聯(lián)免疫工作站，意大利MAROCHE;PowerPac電泳儀，美國Bio-Rad公司;Tanon 6600發(fā)光成像工作站，上海Tanon公司;Zeiss LSM激光共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司;H-7500型透射電鏡，日本日立公司。

2.方法

2.1模型制備

采用前述方法行冠狀動脈左前降支結扎術造模。SD大鼠適應性飼養(yǎng)5天后，采用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，在胸口剃毛暴露出皮膚，在備皮處打開胸腔，擠出心臟，選用6-0 眼科縫合線結扎冠狀動脈左前降支，結扎后若觀察到大鼠心臟左室壁顏色變淺變白，心電圖S-T段抬高伴肢體導聯(lián)R波高尖，即為造模成功。之后快速將心臟放回胸腔，擠壓胸壁排除胸腔氣體后逐層縫合關胸。假手術組大鼠只穿線不結扎。造模過程中采用小動物呼吸機輔助呼吸，術后給予每只大鼠每天腹腔注射8萬單位的青霉素溶液，連續(xù)3d，防止感染。

2.2 分組與給藥

造模24 h后，除假手術組外（8只大鼠），其余造模成功的大鼠隨機分為模型組、LIQ（25、50、100 mg/kg）組、卡托普利（2.5 mg/kg）組，每組8只。各給藥組每天按照10 ml/kg的體積予以灌胃，每天1 次，連續(xù)28 天，假手術組與模型組給予等體積純凈水灌胃。

2.3 指標檢測

（1）心臟血流動力學檢測。末次給藥后30min，稱量并記錄各大鼠體重，隨后用1% 戊巴比妥鈉以50 mg/kg劑量經腹腔注射麻醉各組大鼠，并通過右勁動脈向左心室插管，采用PowerLab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)檢測左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末期壓（LVEDP）、左心室壓力最大收縮率（+dp/dtmax）和左心室壓力最大舒張率（-dp/dtmax）。（2）心臟重量指數(shù)HWI 檢測。心臟血流動力學檢測結束后，腹主動脈取血，迅速摘取心臟，分離脂肪組織、主動脈和心房，稱量心臟重量（mg），計算心臟重量指數(shù)HWI（心臟重量mg/體重g）。（3）HE染色。將心肌組織放入4% 的多聚甲醛中固定24 h以上，取出組織剪修平整之后，放入脫水盒里進行梯度酒精脫水、二甲苯透明和浸蠟，隨后進行包埋，制備4 μM厚心肌組織切片，采用蘇木素和伊紅進行HE染色，電子顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理變化情況。（4）天狼星紅染色。如2.3.3步驟，制備6μm厚心肌組織切片，采用Weigert鐵蘇木素染色液染色10 min，自來水沖洗5 min后天狼星紅染色1 h，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，隨機選取一個視野運用顯微鏡（400×）拍照，觀察大鼠心肌組織膠原纖維變化情況。（5）TUNEL染色。將固定好的心臟組織切成4μm厚的切片，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書操作，用常規(guī)的二甲苯溶液脫蠟，不同濃度梯度的乙醇溶液依次水化，滴加20 μg/ml濃度的蛋白酶K（無DNase）于37 ℃孵育15 min，PBS洗滌3次，加50 μl TUNEL測定溶液于切片中，37 ℃避光溫育60 min。置于PBS中用搖床震搖漂洗3次，每次5 min，加入DAPI溶液顯色5 min，之后再進行PBS漂洗，隨后加滴加適量防熒光淬滅劑，甩干后，滴加樹脂封片劑進行封片，進行熒光定量分析，使用熒光顯微鏡顯微鏡630×倍視野下拍照計數(shù)陽性凋亡細胞數(shù)，評價大鼠心肌組織細胞凋亡情況。（6）Western Blot 檢測心肌組織CXCR2、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表達。稱取50 mg心肌組織，加入RIPA細胞裂解液，提取總蛋白，經SDS-PAGE電泳上樣， 80 V電泳30 min，觀察樣品進入分離膠后將電壓調至120 V，待目的條帶到達合適位置的時候（依據(jù)Maker的位置）結束電泳，經轉膜、封閉、洗滌后，加入一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育1h，曝光，使用Image Pro Plus 6.0軟件分析，實驗重復3次，計算CXCR2、p-NF-κB p65蛋白相對表達量。（7）免疫熒光檢測CXCR2表達。將組織切片放入含有檸檬酸抗原修復液的修復盒中進行抗原修復，洗滌后進行BSA封閉，4℃下加入一抗（1：500）過夜，在室溫下滴加二抗（1：1000）孵育60 min，PBS洗滌后，滴加DAPI染色液進行染色。使用熒光顯微鏡在630× 倍視野下隨機選擇視野進行拍照。（8）ELISA法檢測心肌組織IL-1β、IL-17水平。取心肌組織，勻漿后3500×g離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，于酶標儀檢測組織中IL-1β、IL-17水平含量。EF1E75D4-20DC-4ED4-A497-2DE08B31D4E8

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，GraphPad Prism 8.0進行數(shù)據(jù)分析圖的繪制。計量資料采用均數(shù)±標準差（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，Tukey多組間兩兩比較，統(tǒng)計結果以P<0.05表示兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義。

3.實驗結果

3.1 LIQ對心梗后心室重構大鼠血流動力學的影響

如圖1（注：##P<0.01 vs Sham，** P<0.05，P<0.01 vs Model）所示，與假手術組比較，模型組大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax顯著降低（P<0.01），LVEDP顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，LIQ 各劑量組及卡托普利組LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均有顯著升高（P<0.05，P<0.01），LVEDP顯著降低（P<0.05，P<0.01），且LIQ對模型大鼠的血流動力學指標影響具有劑量依賴性。提示LIQ可改善心梗后心室重構大鼠各項心臟功能指標。

3.2 LIQ對心梗后心室重構大鼠心臟重量指數(shù)（HWI）的影響

如圖2（注：##P<0.01 vs Sham，** P<0.05，P<0.01 vs Model）所示，與假手術組比較，模型組大鼠心臟HWI顯著升高（P<0.01），提示經造模后大鼠心臟出現(xiàn)了擴張;與模型組比較，LIQ 各劑量組及卡托普利組均能顯著降低HWI指數(shù)（P<0.05，P<0.01），且LIQ對模型大鼠的HWI指數(shù)的降低具有劑量依賴性。LIQ 100 mg/kg劑量組對心梗后心室重構大鼠的心臟功能及心肌擴張的改善作用最為明顯，故取100 mg/kg劑量組動物組織進行進一步的作用機制研究。

3.3 LIQ對心梗后心室重構大鼠心肌組織病理形態(tài)學的影響

顯微鏡下觀察每組大鼠心肌組織的HE染色切片，結果圖3所示，假手術組心肌組織排列整齊，細胞結構完整，細胞核形態(tài)正常，心肌間質無炎性細胞浸潤及心肌纖維變性壞死等病理性改變;模型組大鼠心肌組織邊限不清，核固縮或碎裂，胞漿破裂，心肌纖維排列雜亂或斷裂，紋理不清，心肌間質炎性細胞浸潤;經LIQ或卡托普利組治療后，上述情況得到改善，大多數(shù)心肌纖維排列整齊，結構清晰。提示LIQ可以減輕模型中炎性細胞的浸潤及心肌結構的破壞。

3.4 LIQ對心梗后心室重構大鼠心肌組織膠原纖維變化的影響

膠原蛋白作為細胞外基質的主要成分，其變化能夠反應心室重構的病理改變程度。顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織天狼星紅染色切片，結果圖4所示，假手術組大鼠心肌組織可見少量紅染絲狀纖維，無明顯的紅色膠原沉積，肌絲排列有序;模型組大鼠心肌組織可看到有大量的紅色膠原纖維沉積，呈束狀浸潤性分布，肌絲排列紊亂;LIQ或卡托普利的治療改善了上述病理改變，膠原沉積明顯減少。表明LIQ可以減輕心肌間質膠原的過度沉積。

3.5 LIQ對心梗后心室重構大鼠心肌組織細胞凋亡的影響

假手術組有極少數(shù)的陽性凋亡細胞（紅色熒光）;與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織陽性凋亡細胞（紅色熒光）明顯增加，心肌細胞凋亡率顯著上升（P<0.01）;與模型組相比，LIQ或卡托普利組大鼠心肌組織凋亡細胞明顯減少，心肌細胞的凋亡率降低（P<0.01），表明LIQ可在一定程度上減輕細胞的凋亡。

3.6 LIQ對心肌組織CXCR2、p-NF-κB p65表達的影響

Western blot檢測結果表明，在心室重構模型大鼠心肌組織中CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表達顯著升高，與假手術組比較具有顯著性差異（P<0.01）;與模型組相比，LIQ組及卡托普利組大鼠心肌組織CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表達顯著降低（P<0.01），提示LIQ對心室重構模型大鼠心肌損傷保護與調控CXCR2/NF-κB軸有關。

3.7 免疫熒光檢測LIQ對心肌組織CXCR2表達的影響

免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)，假手術組中的CXCR2（綠色熒光標記）熒光強度較低，表達量較少;與假手術組相比，模型組綠色熒光強度增強，CXCR2表達量顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，LIQ和卡托普利組熒光強度降低，CXCR2表達量顯著下降（P<0.01）。表明LIQ可以調控CXCR2的表達。

3.8 LIQ對心肌組織炎癥因子IL-1β、IL-17含量的影響

模型組大鼠心肌組織中炎癥因子IL-1β、IL-17含量顯著升高，與假手術比較具有顯著差異（P<0.01）;與模型組比較，LIQ和卡托普利組的IL-1β、IL-17含量顯著降低（P<0.01）。表明LIQ能夠有效的抑制心肌組織炎癥因子的水平。

4.討論

急性心肌梗死是嚴重危害人類健康的重大疾病，是導致心衰的最重要病因，在我國心梗發(fā)作7天內出現(xiàn)心衰的概率為19.3%，年齡超過65歲的患者心梗后5年內的心衰發(fā)病率更是高達75.9%。而心室重構作為心梗后心衰形成的必經病理過程，能使心臟發(fā)生進行性擴張和外形改變，引起血流動力學該改變、心肌組織肥大、炎癥浸潤、過度纖維化、心肌細胞壞死等，最終導致心衰。因此，抑制心室重構的病理過程已成為防治心衰的重要策略和研究熱點。

研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死會導致復雜的炎癥反應，伴隨著細胞因子的分泌和炎癥細胞向梗塞心肌區(qū)域的趨化募集，加速心室重構的發(fā)生。而抑制心肌組織炎癥反應是改善心室重構，抑制心衰發(fā)生的重要手段。趨化因子是一大家族的趨化蛋白，具有控制免疫細胞向受損組織募集的作用。在人類中，已發(fā)現(xiàn)50多種區(qū)劃因子和19種受體，這些趨化因子根據(jù)N端半胱氨酸殘基的排列分為四個亞家族：CXC、CC、XC和CX3C，通過與跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族的特定細胞表面受體結合發(fā)揮生物學效應，調節(jié)免疫細胞的遷移、粘附等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子介導的單核細胞浸潤受損心臟是心室重構過程中炎癥反應第一步，而CXCR2作為單核細胞募集的核心驅化因子，在心室重構發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。如血管緊張素 II誘導的心臟單核細胞浸潤主要由 CXCL1-CXCR2 信號介導，并啟動和加重心臟重構;CXCR2可通過調控多種細胞信號通路如NF-κB、AKT/mTOR、ERK1/2、TGF-β/Smad2/3等引起自發(fā)性高血壓大鼠單核細胞、巨噬細胞向心肌募集，產生促炎因子及活性氧，導致心臟心室重構與收縮功能障礙等。NF-κB是一種重要的核轉錄因子，在調節(jié)各種炎性細胞因子的表達方面起著關鍵作用。EF1E75D4-20DC-4ED4-A497-2DE08B31D4E8

甘草是我國傳統(tǒng)中藥之一，現(xiàn)代藥理學研究表明其具有抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)、抗癌等多種活性，常作為佐使藥在中藥復方中應用，在慢性心力衰竭的中醫(yī)藥治療中，甘草使用頻率排前5位。而甘草苷是甘草的主要有效成分之一，能夠調控TLR4/MyD88/NF-κB通路、SIRT3/ROS/NF-κB通路，降低UVB照射導致的動物皮膚炎癥反應，抑制骨癌痛大鼠CXCL1/CXCR2信號通路的激活抑制IL-1β、IL-17的產生，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用;能夠調節(jié)AMPKa2依賴性信號通路，下調TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達，減輕脂多糖誘導的心肌細胞損傷等，發(fā)揮著抗炎及心臟保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠經左冠脈結扎后出現(xiàn)LVSP、+dp/dtmax、–dp/dtmax降低， LVEDP升高，心臟形態(tài)變大，HWI升高，心肌組織可見明顯的細胞排列紊亂、炎性細胞浸潤、心肌間質膠原過度沉積、心肌細胞凋亡等經典的心梗后心室重構的血流動力學、形態(tài)學及病理學改變。另模型大鼠心肌組織CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高，炎癥因子IL-1β、IL-17含量明顯增加。心梗后CXCR2上調使炎性細胞向受損心肌組織浸潤，從而激活NF-κB通路，促進炎癥因子IL-1β、IL-17的釋放，介導受損心肌組織的炎癥效應，表明CXCR2/NF-κB軸參與了心梗后心室重構進程。給予模型動物LIQ灌胃治療，發(fā)現(xiàn)LIQ可劑量依賴性的改善左冠脈結扎后模型大鼠心室重構相關的血流動力學、心臟形態(tài)的改變，選擇最佳劑量組進行進一步研究，結果顯示LIQ能夠改善模型大鼠的病理學改變，下調心肌組織CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表達，抑制炎癥因子IL-1β、IL-17的釋放。本研究證明了甘草苷對心梗后心室重構模型大鼠具有明顯的保護作用，且其作用機制可能與調控CXCR2/NF-κB信號軸介導的炎癥因子釋放有關。

參考文獻：

[1]中國醫(yī)師協(xié)會心血管內科醫(yī)師分會，等.2020心肌梗死后心力衰竭防治專家共識[J].中國循環(huán)雜志，2020，13（12）：1166-1180.

[2]梅曉苑.中醫(yī)藥治療慢性心力衰竭的用藥規(guī)律探討[D].遼寧中醫(yī)藥大學，2020.6.

【作者簡介】莫佳佳（1987.04-），男，侗族，廣西柳州市人，碩士研究生學歷，合肥醫(yī)工醫(yī)藥股份有限公司研究員，主要研究方向：心腦血管藥物開發(fā)及產業(yè)化。

【通訊作者】王翔（1988.02-），女，安徽阜陽市人，博士學位，安徽中醫(yī)藥大學副教授，主要研究方向：中藥藥理學基礎。

【基金項目】國家自然科學青年基金（No 82004180）;安徽省高校自然科學研究重點項目（No KJ2020A0393）;安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃項目（No Gxyq2020020）。EF1E75D4-20DC-4ED4-A497-2DE08B31D4E8