RNF180基因甲基化是胰腺癌的潛在診斷標志物

李 昕， 段一夢， 張美英， 郭明洲

1．鄭州大學基礎醫(yī)學院，河南 鄭州 450001； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心消化內(nèi)科醫(yī)學部

胰腺癌是最致命的癌癥之一，死亡率極高。盡管其他腫瘤患者的存活率有了一定的提高，但自20世紀60年代以來，胰腺癌患者的存活率一直保持相對不變[1-2]。目前手術切除是其唯一的治愈機會。不幸的是，80%～85%的患者發(fā)現(xiàn)時已失去手術切除機會。此外，胰腺癌對大多數(shù)化療及分子靶向治療反應不佳[3]。隨著人口的老齡化，胰腺癌的發(fā)病呈快速增長趨勢，50歲以后發(fā)病率開始增加，70歲達到高峰。5%～10%的患者具有遺傳傾向，一些具有遺傳綜合征的特征性基因突變是胰腺癌的危險因素，如BRCA1/2(乳腺和卵巢癌綜合征)、ATM(共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥)、STK11(Peutz-Jeghers綜合征)、PRSS1(遺傳性胰腺炎)、MLH1和MSH2/6(Lynch綜合征)[4]。另外，飲酒和吸煙也是胰腺癌的危險因素[5]。胰腺癌主要分為兩型：胰腺腺癌占95%，胰腺內(nèi)分泌腫瘤約占5%(<5%)[6]。由于胰腺癌早期缺乏典型的癥狀，其早期診斷仍是一個挑戰(zhàn)。對進展期胰腺癌FOLFIRINOX方案[5-fluorouracil、Folinic acid (Leucovorin)、Irinotecan、Oxaliplatin]和吉西他濱(Gemcitabine)結合白蛋白紫杉醇(Nab-paclitaxel)是目前的主要治療手段[7]。盡管免疫治療在其他腫瘤中獲得了一定的效果，但在胰腺癌中的療效非常有限[8]。由于許多信號通路參與細胞命運的調(diào)控，且這些通路之間存在復雜的交叉互通現(xiàn)象(crosstalking)，針對單一異常通路的靶向治療常常效果不佳。另外，由于胰腺癌的高度異質性也決定了針對單一通路的治療效果有限[4，9-11]，因此，需要深入研究胰腺癌的分子調(diào)控網(wǎng)絡，從而獲得高效、特異的“協(xié)同致死”治療靶標。近年來，隨著人們對表觀遺傳認識的深入，以表觀遺傳為基礎的“協(xié)同致死”取得了一些新的進展[11-17]。在胰腺癌中分離和鑒定新的表觀遺傳異常的標志物將會提供更多新的治療策略。

環(huán)指蛋白180(ring finger protein 180,RNF180)是一種新發(fā)現(xiàn)的環(huán)指蛋白家族的成員，該基因位于人類染色體5q12.3，該區(qū)域在許多腫瘤中均發(fā)生缺失[18-19]。在胃癌和肝癌中頻繁發(fā)生甲基化，RNF180甲基化與幽門螺桿菌感染和胃癌的預后差相關[20-23]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，RNF180具有E3泛素連接酶活性，其通過下調(diào)RAD51增加三陰性乳腺癌對吉非替尼的敏感性[24]。RNF180在胰腺癌中的表達及其調(diào)控機制目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌細胞系及組織標本本實驗涉及9個胰腺癌細胞系(CFPAC1、Panc5.04、PANC1、T3M4、MIAPaCa2、SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1)均是已建立的原發(fā)性胰腺癌患者的細胞系。細胞培養(yǎng)基為RPMI 1640包含1%青霉素-鏈霉素，10%胎牛血清。細胞均在體積分數(shù)為5% CO2和溫度為37 ℃條件下進行培養(yǎng)。1∶3進行細胞傳代培養(yǎng)12 h后，向培養(yǎng)基中加入5-aza-dc使其終濃度為2 μmol/L，每24 h更換新的含有2 μmol/L 5-aza-dc的RPMI 1640培養(yǎng)基，藥物處理96 h后，提取細胞總RNA。本實驗采用的112例胰腺癌組織和8例非癌患者的正常胰腺組織均來自中國人民解放軍總醫(yī)院。取材的所有患者術前均未接受任何放化療等治療，術后病理檢查均證實為原發(fā)性胰腺癌。本研究獲得中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(批號：20090701-015)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞總RNA提取與半定量RT-PCR檢測：取對數(shù)生長期細胞，提取總RNA后，經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和質量。取5 μg總RNA用Thermo Scientific RevertAid RT逆轉錄試劑盒合成cDNA溶液，作為后續(xù)PCR反應的模版cDNA，用去離子水稀釋至100 μl，取2.5 μl的cDNA模板在25 μl反應體系中進行PCR擴增。RNF180 RT-PCR引物序列為：5′-CTCCGGGACGTGGATACAGAT-3′(上游引物)，5′-GGGCTTTTTGGATTAGGCAGC-3′(下游引物)，擴增產(chǎn)物長度為254 bp。RNF180 RT-PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(3個循環(huán))；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(3個循環(huán))；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(3個循環(huán))；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(26個循環(huán))；72 ℃ 7 min。GAPDH RT-PCR引物序列為：5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(上游引物)，5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(下游引物)，擴增產(chǎn)物長度為454 bp。GAPDH RT-PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(25個循環(huán))；72 ℃ 7 min。取10 μl PCR擴增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 DNA的提取、甲基化特異性PCR(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)：將對數(shù)生長期細胞采用酚/氯仿法抽提DNA，最后溶于ddH2O。取2 μg DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉硫化后，采用DNA純化試劑盒純化，最后溶于20 μl的ddH2O，-20 ℃冰箱保存[25-26]。RNF180啟動子區(qū)特異性甲基化PCR引物序列為：5′-TCGGGGTTGTTAGGTATAGTTCGAGC-3′(甲基化上游引物)，5′-AACTCTAAAAACTCGCTACGACTCCG-3′(甲基化下游引物)，擴增產(chǎn)物長度為111 bp。RNF180啟動子區(qū)特異性非甲基化PCR引物序列為：5′-GGTTGGGGTTGTAGGTATAGTTTGAGT-3′(非甲基化上游引物)，5′-CAAACTCTAAAAACTCACTACAACTCCA-3′(非甲基化下游引物)，擴增產(chǎn)物長度為115 bp。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35個循環(huán))；72 ℃ 7 min。取10 μl PCR擴增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。使用χ2檢驗分析RNF180甲基化率與胰腺癌患病相關因素的相關性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RNF180在胰腺癌中的表達受啟動子區(qū)域甲基化的調(diào)控在胰腺癌細胞CFPAC1、Panc5.04和PANC1細胞中RNF180基因高表達，在MIAPaCa2和T3M4細胞中表達降低，而在SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1細胞中表達缺失。MSP結果顯示，RNF180基因啟動子區(qū)在CFPAC1、Panc5.04和PANC1細胞中呈非甲基化狀態(tài)，在MIAPaCa2和T3M4細胞中部分甲基化，在SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1細胞中完全甲基化。這些結果表明，RNF180基因啟動子區(qū)域甲基化與其表達水平密切相關。然后，應用去甲基化藥物5-aza-dc處理胰腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)RNF180在非甲基化的細胞(CFPAC1、Panc5.04和PANC1)中表達水平無明顯改變，部分甲基化細胞(MIAPaCa2和T3M4)其表達水平增加，完全甲基化細胞(SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1)恢復其表達(見圖1)。以上結果表明，RNF180基因的表達受啟動子區(qū)甲基化調(diào)控。

注：ddH2O：體系陰性對照；GAPDH：內(nèi)參對照；(-)：5-aza-dc處理前；(+)：5-aza-dc處理后。NL：正常淋巴細胞DNA，非甲基化對照組；IVD：體外甲基化DNA，甲基化對照組；H2O：體系陰性對照；U：非甲基化；M：甲基化。

2.2 RNF180在胰腺癌組織中頻繁發(fā)生甲基化為探討RNF180基因在原發(fā)性胰腺癌中的甲基化情況，應用MSP方法檢測了112例原發(fā)性胰腺癌及8例非癌患者正常胰腺組織。RNF180基因在非癌患者正常胰腺標本中未發(fā)現(xiàn)甲基化，排除了組織特異性甲基化的可能性。在112例原發(fā)性胰腺癌組織中，35例發(fā)生甲基化，77例未發(fā)生甲基化，甲基化率為31.25%(35/112，見圖2)。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，RNF180甲基化與胰腺癌的TNM分期有相關性(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤分化、淋巴結轉移、神經(jīng)侵犯、吸煙、飲酒等因素無相關性(P均>0.05，見表1)。

注：M：甲基化，U：非甲基化，PN：正常胰腺組織，PC：胰腺癌組織。

表1 RNF180甲基化與原發(fā)性胰腺癌臨床因素的關系Tab 1 The association of RNF180 methylation with clinical factor in primary pancreatic cancer

3 討論

RNF180在胃癌和肝癌頻繁發(fā)生甲基化，且在結腸癌、胃癌和乳腺癌中影響腫瘤的生長和轉移[21，23-24，27-28]。RNF180在胃癌中通過E3泛素化酶的作用發(fā)揮翻譯后調(diào)控，從而影響腫瘤的發(fā)生和進展，是胃癌預后不良的獨立預后因素[28]。在三陰性乳腺癌中，RNF180通過下調(diào)RAD51降低對吉非替尼的敏感性[24]。我們在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)，RNF180頻繁發(fā)生甲基化，且其表達受啟動子區(qū)甲基化調(diào)控。RNF180甲基化與腫瘤的分期相關，而與其他臨床因素之間的關系差異無統(tǒng)計學意義，這些結果表明RNF180甲基化可能是食管癌預后不良的因素。樣本量相對較小是本研究的局限性。我們擬在未來的研究中擴大樣本量并增加癌前病變病例進一步分析。因為RNF180參與RAD51的調(diào)控，我們擬在未來的研究中探討RNF180是否參與DNA損傷修復機制。最終明確RNF180能否成為胰腺癌早期診斷的標志物和治療靶標。

RNF180基因在人類胰腺癌頻繁發(fā)生甲基化，其表達受啟動子區(qū)域甲基化調(diào)控。RNF180甲基化是胰腺癌潛在的診斷和預后標志物。