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    基于ddPCR檢測荷斯坦牛自由馬丁現(xiàn)象的研究

    2022-07-06 15:51:26王玉嬌李彥芹張汝美蔡高占趙秀新顧祥國李俊婷姚文龍李建斌仲躋峰
    黑龍江動物繁殖 2022年3期
    關鍵詞:微滴嵌合體拷貝數(shù)

    王玉嬌,李彥芹,張汝美,蔡高占,趙秀新,顧祥國,李俊婷,姚文龍,李建斌*,仲躋峰*

    (1.山東省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所,濟南 250100;2.山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司,濟南 250108;3.寧波市牛奶集團有限公司,浙江 寧波 315033;4.寧波市鄞州瞻岐鷹山牛場,浙江 寧波 315145)

    自由馬丁(freemartinism)綜合征是異性雙胎牛性器官發(fā)育紊亂疾病,主要表現(xiàn)為母牛生殖器官發(fā)育不全、雄性化或不育等特征,其主要機制是雙胎胚胎早期的尿膜絨毛膜血管之間有吻合支,雄性胎兒分泌的雄性激素會通過吻合支進入雌性胎兒體內(nèi),抑制雌性生殖器官的發(fā)育。異性雙胎對公牛生殖能力的影響尚不確定,然而確有造成生殖能力下降的報道。牛雙胎時多達97%胎兒會發(fā)生尿膜絨毛膜血管吻合。荷斯坦牛雙胎率大約為5%,個別牛群可達10%甚至更高。而且牛的雙胎率可能會越來越高,自然會造成自由馬丁發(fā)生率的增加。

    自由馬丁初步診斷一般是基于小母牛生殖道的臨床檢查,以及是否來自雙胎或多胎等信息。而確診需要進行遺傳學檢查,即確定細胞中是否存在XX/XY嵌合體。細胞遺傳學和分子技術可以應用于自由馬丁診斷,一般染色體分析是最常見的方法。細胞遺傳學鑒定常用的方法包括吉姆薩染色法、染色體分帶或性染色體探針熒光原位雜交法等。分子技術主要包括PCR、qPCR或性染色體連鎖微衛(wèi)星標記分型法等。細胞遺傳學分析可以精準確定XX和XY細胞比例,但費時費力,而且整個程序涉及無菌采集血液樣本、迅速(約24 h內(nèi))運到實驗室、白細胞培養(yǎng)(48 h或72 h內(nèi))、專業(yè)人員進行分析等。Y連鎖基因的PCR方法比較容易,但不能檢測細胞中XX比例較小的XX/XY嵌合體;而且需要增加輔助研究,如其他組織(毛囊、唾液)中微衛(wèi)星標記的分析等。

    微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是第三代PCR,為檢測XX/XY嵌合體提供了新的可能性。該方法利用有限稀釋和泊松分布可以實現(xiàn)樣品中目標核酸的精確定量。ddPCR是一種終點測量方法,可克服傳統(tǒng)PCR不能檢測低豐度核酸的局限性,并且不需要標準曲線實現(xiàn)目標核心的直接精確絕對定量,法醫(yī)上已經(jīng)應用于對混合遺傳特征和人類臨床嵌合現(xiàn)象的研究,在動物上已用于檢測豬白細胞嵌合體。建立快速準確的自由馬丁綜合征診斷方法對牛的繁育生產(chǎn)有著非常重要的意義。試驗對中國荷斯坦母牛的異性孿生母犢進行ddPCR檢測,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 樣本的采集

    13~15月齡中國荷斯坦母牛7頭,來源于山東省某牛場。母牛個體發(fā)育與同群其他個體沒有明顯差異,因為配種5次以上未孕,進行了直腸檢查,發(fā)現(xiàn)存在子宮小、單子宮角等子宮發(fā)育不全特征。經(jīng)與技術人員溝通,這些母??赡苁钱愋噪p胎中的母犢。為鑒定是否為自由馬丁綜合征,每頭牛尾靜脈采集外周血10 mL于抗凝管中,-20℃保存,備用。

    1.2 主要試劑和儀器設備

    血液基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;ddPCRSupermix for Probes、微滴生成油,Bio-Rad公司產(chǎn)品。

    離心機(型號為iCEN-24R),杭州奧盛儀器有限公司;分光光度計(型號為NanoDrop 8000 Micro),賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;QX200數(shù)字PCR儀、PX1熱封儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品。以上試劑和儀器均來源于山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室。

    1.3 DNA的提取

    使用血液基因組DNA提取試劑盒嚴格按照說明書步驟提取DNA,用分光光度計測定提取后的DNA濃度,保證DNA濃度在10 ng/μL以上。

    1.4 引物和探針設計

    哺乳動物中AMEL基因定位于性染色體上,該基因在不同性染色體中存在獨立進化的特征,AMEL基因在X染色體(AMEL-X)和Y染色體(AMELY)以不完全一致的形式存在,AMEL基因這一特性非常適合作為X和Y染色體區(qū)分的靶標基因。通過ddPCR技術鑒定AMEL-X和AMEL-Y基因拷貝數(shù)估算X和Y染色體的拷貝數(shù)。參考相關文獻及NCBI的引物序列,設計ddPCR的靶標基因引物和探針。序列如下:AMEL-X正向引物,5′-CATGCAGCCCTTGCA-3′;AMEL-X 反 向 引 物,5′-ATATCGGAGGCAGAGGT-3′;AMEL-Y正向引物,5′-ACCAACCCCTGCAG-3′;AMEL-Y反向引物,5′-TGCATGGGGAATATTGGAG-3′;AMEL-X 探針 (HEX),HEX -CAGCCCTTGCCGC-BHQ1;AMEL-Y探針(FAM),F(xiàn)AM-CAGCGCTTGCCACCBHQ1。

    1.5 ddPCR反應體系及反應條件

    1)將ddPCRSupermix for Probes(No dUTP)在室溫下融解,上下顛倒混勻,12 000 r/min離心2 min。

    2)配制ddPCR Reaction Mix,反應體系見表1。

    表1 dd PCR反應體系Tab.1 dd PCR reaction system

    3)配好的反應體系振蕩混勻,12 000 r/min離心2 min后,小心地轉移到微滴發(fā)生卡中間一排的樣品孔內(nèi),并在下排孔中加入70μL微滴發(fā)生油,然后在微滴生成儀中生成微滴。

    4)將生成好微滴的樣品40μL從微滴發(fā)生卡的上排孔中轉移到ddPCR專用孔板中,蓋上鋁膜后用PX1熱封儀對孔板進行封膜。

    5)PCR反應條件見表2。

    表2 PCR反應條件Tab.2 PCR reaction conditions

    6)PCR結束后,將孔板取出,在微滴讀取儀上進行微滴讀取。

    7)微滴讀取結束后,在Bio-Rad QuantaSoft軟件上分析數(shù)據(jù)結果。

    1.6 測定項目

    測定AMEL-X的一維液滴分布、AMEL-Y的一維液滴分布及AMEL-X和AMEL-Y基因拷貝數(shù),并計算AMEL-Y/AMEL-X。

    2 結果與分析

    本試驗為單通道試驗,在只加入AMEL-X探針樣本測定時使用通道2(見圖1),只加入AMEL-Y探針樣本時使用通道1(見圖2)。圖1中綠色的是陽性液滴,含有可擴增模板(AMEL-X片段)的液滴;灰色的是陰性液滴,不含有可擴增模板的液滴。陽性液滴為6 876,陰性液滴為107 249,其中A05、C05、D05、E05、F05、B06、C06為只加入AMEL-X探針的樣本1~7。圖2中藍色的是陽性液滴,含有可擴增模板(AMEL-Y片段)的液滴;灰色的為陰性液滴,不含有可擴增模板的液滴。陽性液滴為3 253,陰性液滴為106 866,其中A07、C07、D07、E07、F07、F06、G06為只加入AMEL-Y探針的樣本1~7。圖1和圖2中的陰性液滴和陽性液滴明顯分成兩簇,表明試驗結果良好。根據(jù)陰性液滴和陽性液滴的比例可以得出ddPCR反應中可擴增模板的拷貝數(shù),見圖3。測得樣本1~7的AMEL-X和AMEL-Y的基因拷貝 數(shù) 分 別 為147 copies/μL 和62 copies/μL,99 copies/μL和22.3 copies/μL,60.4 copies/μL和17.8 copies/μL,27.3 copies/μL和24.6 copies/μL,97 copies/μL和71.9 copies/μL,65.2 copies/μL和34.8 copies/μL,36.6 copies/μL和17.9 copies/μL。根據(jù)ddPCR測定的濃度推算出原樣本的基因濃度見表3。計算得出這7個原樣本中AMEL-X拷貝數(shù)濃度范圍為273 ~1 470 copies/μL,AMEL-Y拷貝數(shù)濃度范圍為178 ~719 copies/μL;以此計算,得出AMEL-Y基因濃度與AMEL-X基因濃度的比例范圍為0.23~0.90。這說明試驗檢測的7頭母牛血液樣本中均含有Y染色體,為XX/XY嵌合體,可以判定為異性孿生母犢不孕的個體。該結果與母牛直腸檢查結果一致。

    表3 ddPCR定量結果Tab.3 ddPCR quantitative results

    圖1 AMEL-X的一維液滴分布圖Fig.1 One-dimensional droplet distribution map of AMEL-X

    圖2 AMEL-Y的一維液滴分布圖Fig.2 One-dimensional droplet distribution map of AMEL-Y

    圖3 AMEL-X和AMEL-Y基因拷貝數(shù)Fig.3 AMEL-X and AMEL-Y gene copy numbers

    3 討論

    一般情況下,異性孿生母牛在性成熟前與正常個體發(fā)育相似,但在性成熟后表現(xiàn)與正常母牛不同,體型和公牛相似,頭和角都變得粗大,哞叫聲也像公牛,性情粗暴,乳房極不發(fā)達,子宮和卵巢發(fā)育不全,但如果不仔細觀察很難發(fā)現(xiàn)。尤其在大型規(guī)?;翀龈y發(fā)現(xiàn),只有到配種時發(fā)現(xiàn)屢配不孕,進一步檢查時方能檢查。

    先前有研究者對異性孿生母犢不孕個體中的染色體進行研究,發(fā)現(xiàn)異性孿生母犢的染色體有XX、XXY、XY等組型,正常母犢個體的染色體應該為XX組型,因此在孿生母牛樣本中檢測到Y染色體就可以判定為異性孿生不孕個體。也有研究表明,XX/XY嵌合體的公牛睪丸發(fā)育不全。

    基于時間和成本及檢測準確度、靈敏度方面的考慮,ddPCR技術是一個有效的檢測XX/XY嵌合體的方法。ddPCR檢測嵌合體的方法曾應用于豬等動物。ddPCR是第三代PCR技術,是一種終點測量方法,無需使用標準曲線即可進行定量,通過與X和Y染色體相關聯(lián)的基因可以對染色體拷貝數(shù)進行定量。在哺乳動物中高度保守的AMEL基因恰好滿足這個要求,AMEL基因在X和Y染色體上均表達但并不完全一致,AMEL基因已用于綿羊、水牛等多種哺乳動物的性別鑒定。

    I.Szczerbal等為了評判ddPCR在檢測牛XX/XY染色體嵌合方面的特異性,按比例稀釋雌性(XX)DNA與雄性(XY)DNA混合樣本,利用ddPCR進行檢測,結果表明,ddPCR可以檢測到XX(98%)/XY(2%)到XX(4%)/XY(96%)比例的混合樣本。證明ddPCR技術在檢測牛XX/XY染色體嵌合方面可以達到較高的準確性,并且檢測結果與細胞遺傳學檢測結果相符。本試驗中,基因濃度的比例范圍為0.23~0.90。

    4 結論

    在本試驗中,選擇ddPCR方法對7頭中國荷斯坦異性孿生雙胎的母牛外周血進行鑒定,并根據(jù)異性孿生母犢不孕的個體染色體為XX/XY嵌合、正常母牛染色體為XX來判定是否為嵌合體。結果表明,此7個樣本均存在XX/XY染色體嵌合,均為異性孿生不孕母犢。

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