年齡對小鼠植入前胚胎Dnmts表達量的影響

岳明星，簡偉杰，李 浡，陳 思，危 晴，陳 亮，辛秀蘭

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京 100176）

在胚胎發(fā)育中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）起到了關(guān)鍵作用。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3家族中的Dnmt3a、Dnmt3b在成體組織中表達量很低，在胚胎干細胞中表達豐度較高，胚胎干細胞中Dnmt3a和Dnmt3b失活會干擾DNA從頭甲基化，小鼠Dnmt3b、Dnmt3a基因突變會導(dǎo)致胚胎畸形及死亡率升高。Dnmt3a和Dnmt3b的功能在胚胎發(fā)育早期相似，Dnmt1的甲基化作用發(fā)生在植入期，在胚胎發(fā)育過程中起維持甲基化的作用。無論是DNA從頭甲基化還是DNA甲基化的維持都是胚胎發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，這可能與不同組織細胞中不同基因的表達有關(guān)。另外，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與早期胚胎植入子宮內(nèi)膜也有一定聯(lián)系，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B可以聯(lián)合作用，調(diào)節(jié)E鈣黏素（E-cadherin）的表達，從而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力，這也說明了DNMTs在胚胎發(fā)育中的重要作用，異常的胚胎植入和流產(chǎn)很有可能與DNMTs的異常有關(guān)。

DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基獲得一個甲基基團的化學(xué)修飾過程。它作為一種相對穩(wěn)定的修飾狀態(tài)，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下可隨DNA的復(fù)制過程遺傳給新生的子代DNA。這種傳遞主要通過Dnmt1維持，是一種重要的表觀遺傳機制。在衰老的細胞中會出現(xiàn)“DNA甲基化漂移”，即衰老的組織和細胞中廣泛存在著DNA甲基化程度降低或過甲基化現(xiàn)象。產(chǎn)生這兩種現(xiàn)象的主要原因與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達異常有關(guān)。在人的T淋巴細胞中Dnmt3a表達量處于較低水平，且不隨年齡變化而發(fā)生改變；而Dnmt1和Dnmt3b表達量很高，并呈現(xiàn)出隨年齡增大而降低的趨勢。這證明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達量下降是導(dǎo)致T淋巴細胞甲基化程度下降的原因之一。研究人外周血白細胞5-甲基胞嘧啶含量時發(fā)現(xiàn)，人50歲以上組的5-甲基胞嘧啶含量較50歲以下組低，即隨著年齡的增長甲基胞嘧啶含量呈下降趨勢；但其下降程度很小，下降速度為每年0.014%。以上研究證明，基因組DNA甲基化水平降低的趨勢在衰老中是普遍存在的。但在衰老進程中同時伴隨著某些基因啟動子局部區(qū)域5-甲基胞嘧啶含量的增加，如雄性大鼠的精子和肝細胞中核糖體DNA隨著年齡的增大發(fā)生超甲基化，人類小腸隱窩的干細胞隨年齡增長發(fā)生高甲基化現(xiàn)象。

越來越多的研究證明，DNA甲基化在機體和細胞衰老過程中發(fā)揮重要作用。哺乳動物的生殖細胞和植入前胚胎基因組甲基化經(jīng)歷一個重編程過程，受精后從親代獲得的配子甲基化模式通過去甲基化作用被擦除，在隨后植入過程中，新的甲基化模式通過從頭甲基化作用被建立。胚胎的甲基化重編程過程對胚胎的發(fā)育和細胞全能性的建立具有重要作用。目前，生殖老化對甲基化重編程過程的影響機制仍不清楚。

為了研究老化對小鼠植入前不同時期胚胎Dnmts表達量的影響，本試驗利用Western-blot方法，分別檢測了青、老年小鼠2細胞和4細胞胚胎、8細胞和桑椹胚、囊胚的Dnmts表達量，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

同一批次昆明白小鼠雌性300只、雄性100只，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，隨機分為兩組，一組（100只）為青年組，在青年時期6～8周齡進行相關(guān)試驗；另一組（200只）飼養(yǎng)到老年時期（35～40周齡），為老年組，在35～40周齡重復(fù)青年組所做試驗。

小鼠飼養(yǎng)于控溫（20～25℃）、控光［14 h光照（06：00—20：00）和10 h黑暗（20：00—06：00）］環(huán)境中。所有動物操作均按照北京市實驗動物管理條例相關(guān)規(guī)定執(zhí)行，符合動物福利的要求。

1.2 主要儀器及試劑

搖床（型號為TS-92）、旋渦混合器（型號為QL-901），購自其林貝爾儀器制造有限公司；臺式冷凍離心機（型號為TGL-16），購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；電泳儀（型號為DYCZ-24DH），購自北京六一生物科技有限公司；轉(zhuǎn)膜儀（型號為TY-201-01），購自南京中科通儀科技有限公司；電子天平、冰箱、液氮罐、pH計、注射器、大鑷子、吸水紙、記號筆、槍頭、離心管、剪刀、濾紙、膜、乳膠手套等均為國產(chǎn)，市購；Eppendorf移液器、顯微鏡，市購。以上儀器和用品均由北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院細胞及分子生物學(xué)實驗室提供。

Dnmt1（A-1001）、Dnmt3a（A-1003）、Dnmt3b（A-1004）、Dnmt3L（A-1005）抗體，購自Epigentek公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（20201ES76），購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Loading buffer、配制M2液所需藥品及其他試劑，均購自Sigma公司。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 各時期胚胎的采集 青年組（6～8周齡）挑選自然發(fā)情的小鼠與8～10周齡正常雄性昆明白小鼠合籠。次日清晨觀察小鼠交配情況，有栓小鼠視為交配成功。交配后見栓雌鼠沖取體內(nèi)胚胎，分別于交配后44～48 h、52～56 h、60～64 h、68～72 h、84～96 h收集2細胞、4細胞、8細胞、桑椹胚和囊胚。將胚胎用M2液清洗3～5次，同時期每胚胎置于一個EP管中，-80℃保存，備用；老年組（35～40周齡）挑選自然發(fā)情小鼠，做上述交配及胚胎采集試驗。將5個時期胚胎分為三類：2細胞／4細胞胚胎、8細胞／桑椹胚、囊胚。

1.3.2 樣品的制備 取青年、老年小鼠每組胚胎各200個，放入1.5 mL離心管中并加入100μL蛋白裂解液，用玻璃研磨器于冰上勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 mL EP管中，置于冰上15 min，以充分裂解；4℃、12 000 r／min離心10 min；將離心后的上清液分裝轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。制備電泳樣品，使每個樣品總蛋白為50～100μg。根據(jù)蛋白濃度計算各樣品所需取樣量，并與Loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中快速制冷，備用。上樣前按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明書測定蛋白濃度。

1.3.3 Western-blot 配制12%分離膠，加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即搖勻即可灌膠，并用ddHO封膠；凝固后將膠上層水倒去，并用吸水紙將水吸干；配制4%濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。剩余空間灌滿濃縮膠，將梳子插入濃縮膠中；取1.3.2樣品上樣，電泳。濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為120 V。待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。

恒流轉(zhuǎn)膜約70 min后，將膜取出放入洗滌緩沖液TBST中洗1次，時間5 min；用封閉液（TBST緩沖液中含5%脫脂奶粉）將膜浸入，室溫放置1 h；用封閉液將一抗Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L按1∶200稀釋，將膜與稀釋后一抗在4℃孵育12 h，孵育結(jié)束后用TBST洗3次，每次5 min；用封閉液將辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔和羊抗鼠）按1∶1 000稀釋后與孵育一抗后的膜37℃共孵育2 h，孵育結(jié)束后用TBST洗3次，每次5 min；ECL曝光，顯影、定影后用Image J軟件分析Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L蛋白相對灰度值。相對灰度值越大蛋白表達量越大，反之亦然，即相對灰度與蛋白表達量成正比。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 12.0軟件的獨立樣本檢驗進行分析。＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 2細胞／4細胞胚胎中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L在老化過程中表達量的變化

通過Western-blot方法測定青年、老年小鼠2細胞和4細胞胚胎中4種主要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達量，結(jié)果表明，Dnmt1、Dnmt3b和Dnmt3L表達量均隨年齡增加而顯著下降（＜0.05），Dnmt3a表達量未隨年齡增加發(fā)生顯著變化（＞0.05），見圖1。

圖1 青年、老年鼠2細胞／4細胞胚胎Dnmts表達量Fig.1 Expression level of Dnmts in 2-4cell embryos of young or old mice

2.2 8細胞／桑椹胚中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L在老化過程中表達量的顯變化

通過Western-blot方法測定青、老年小鼠8細胞／桑椹胚中4種主要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達量，結(jié)果表明，Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L表達量均未隨年齡增加發(fā)生顯著變化（＜0.05），見圖2。

圖2 青、老年鼠8細胞／桑椹胚胚胎Dnmts表達量Fig.2 Expression level of Dnmts in 8cell／morula embryos of young or old mice

2.3 囊胚中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L在老化過程中表達量變化

通過Western-blot方法測定青、老年小鼠囊胚中4種主要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達量，結(jié)果表明，Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L表達量均未隨年齡增加發(fā)生顯著變化（＜0.05），見圖3。

圖3 青、老年鼠囊胚Dnmts表達量Fig.3 Expression level of Dnmts in blastocyst of young or old mice

3 討論

DNA甲基化與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X-染色體失活、印記基因轉(zhuǎn)錄靜默及組織特異性基因表達等生物過程有關(guān)。小鼠胚胎DNA甲基化模式是通過Dnmt1蛋白的正確表達和階段特異性的翻譯來維持的。小鼠Dnmt1基因缺失，突變導(dǎo)致胚胎因基因組甲基化水平下降、甲基化模式紊亂，印記基因表達異常，最終導(dǎo)致胚胎異常發(fā)育或死亡，這是由于Dnmt1基因表達的缺失使基因的調(diào)節(jié)功能遭到破壞，進而破壞了胚胎基因表達的時空特性。

胚胎發(fā)育早期，Dnmt3b和Dnmt3a基因特異表達時間不同：Dnmt3b基因特異在胚胎全能干細胞時期表達，以及內(nèi)細胞團的外胚層細胞中；而Dnmt3a基因在胚胎10.5日齡后廣泛表達于各種組織和細胞中。Dnmt3b基因缺失或突變引起的表型異常程度遠高于Dnmt3a基因缺失或突變，這可能與兩者特異性表達時間不同有關(guān)。M.Okano等利用逆轉(zhuǎn)錄病毒分別感染Dnmt3a缺失胚胎干細胞、Dnmt3b缺失胚胎干細胞和兩種酶都缺失的胚胎干細胞，再通過甲基化敏感酶分析前病毒DNA的甲基化水平，從而反映胚胎干細胞的從頭甲基化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有Dnmt3a和Dnmt3b中一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺失時，胚胎干細胞可使前病毒DNA新發(fā)甲基化，而兩種酶均缺失的胚胎干細胞則喪失了使前病毒DNA發(fā)生從頭甲基化的能力。在哺乳動物早期胚胎中也有前述現(xiàn)象發(fā)生，說明胚胎干細胞和早期胚胎的從頭甲基化需要Dnmt3a、Dnmt3b的共同作用。Dnmt3L高度表達于睪丸和胎盤的絨毛膜，協(xié)同Dnmt3家族行使從頭甲基化功能。Y.Arakawa等的研究表明，Dnmt3a、Dnmt3b在保持胚胎干細胞和早期胚胎的印記甲基化模式中可能起一定的作用，但不起主要作用；猜測正常甲基化模式的建立需要Dnmt3家族和Dnmt1的共同作用。Dnmt1是Dnmt3家族啟動的CpG核苷酸從頭甲基化的保證，而Dnmt3家族使甲基化水平提高到正常需要水平。

本試驗中，2細胞和4細胞胚胎除Dnmt3a表達量無差異外，其余3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L）表達量均隨年齡增加呈顯著下降趨勢（＜0.05）；在8細胞／桑椹胚和囊胚中以上4種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達量均無顯著差異（＞0.05）。另外本課題組的前期研究證明，老年鼠8細胞／桑椹胚和囊胚時期胚胎的DNA甲基化水平亦明顯低于青年鼠。說明老年鼠胚胎Dnmts表達量下降，導(dǎo)致DNA甲基化模式紊亂。胚胎從8細胞期開始，相關(guān)印記基因表達從母源性控制轉(zhuǎn)向胎源性自主調(diào)控，老年鼠2細胞和4細胞胚胎Dnmts表達量下降，導(dǎo)致胚胎無法啟動正常的胎源性調(diào)控功能，這可能使Dnmts表達量異常的胚胎大量死亡，進而表現(xiàn)為老年小鼠的妊娠率和平均產(chǎn)仔數(shù)均顯著低于青年小鼠，且老年小鼠產(chǎn)出的死胎和畸胎率明顯高于青年小鼠。

4 結(jié)論

小鼠老化導(dǎo)致2細胞和4細胞胚胎Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L表達量顯著下降。