腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞免疫治療的研究進(jìn)展

楊涵 陳超 王沖

摘 要 腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes， TILs）免疫治療通過體外分離、擴(kuò)增和回輸患者自己的能特異性識(shí)別腫瘤組織的腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞來治療腫瘤，是目前主要的過繼性細(xì)胞免疫治療類型之一。TILs已在用于實(shí)體瘤治療的臨床試驗(yàn)，尤其是在用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者治療時(shí)顯現(xiàn)有令人鼓舞的臨床效果。然而，TILs治療也面臨一些挑戰(zhàn)，如腫瘤相關(guān)抗原反應(yīng)性T細(xì)胞難以分離及其在體內(nèi)的持久性和安全性等。本文概要介紹TILs治療的產(chǎn)品生產(chǎn)過程、臨床應(yīng)用的可行性、臨床研究進(jìn)展，以及TILs治療面臨的挑戰(zhàn)和解決措施，供TILs治療的研究與開發(fā)者參考。

關(guān)鍵詞 腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞 實(shí)體瘤 臨床研究

中圖分類號(hào)：R979.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2022）11-0017-05

引用本文 楊涵， 陳超， 王沖. 腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞免疫治療的研究進(jìn)展[J]. 上海醫(yī)藥， 2022， 43（11）： 17-21.

Research progress in tumor-infiltrating lymphocytes immunotherapy

YANG Han， CHEN Chao， WANG Chong

（Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection， Shanghai 201210， China）

ABSTRACT Tumor-infiltrating lymphocytes （TILs） therapy is one of the main types of adoptive cellular immunotherapy by harvesting infiltrated lymphocytes from tumors followed by ex vivo expansion and then infusing them back to patients themselves. TILs therapy has shown encouraging clinical effects in clinical trials against solid tumors， especially in treating metastatic melanoma. Nevertheless， various barriers restrict the efficacy and prevent the widespread use of TILs therapy， such as the difficulty of isolating tumor-associated antigen-reactive T cells and their persistence and clinical safety in vivo. Herein， we summarize the manufacturing process of TILs and the feasibility analysis of the clinical application and discuss the advances in clinical trials and the current obstacles with some strategies to be overcome， shedding light of the development of the next generation of TILs therapy.

KEY WORDS tumor-infiltrating lymphocytes； solid tumors； clinical trials

細(xì)胞免疫治療，又稱過繼性細(xì)胞免疫治療，是一種基于細(xì)胞的治療方法，其使用患者自身或供體的經(jīng)過基因工程改造和/或離體擴(kuò)增的免疫細(xì)胞來改善患者的免疫功能，以對(duì)抗腫瘤。在實(shí)體瘤治療領(lǐng)域，腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes， TILs）治療被認(rèn)為是最有潛力的細(xì)胞治療類型之一[1]。

TILs治療始見于20世紀(jì)80年代后期。當(dāng)時(shí)，美國國家癌癥研究所的Rosenberg團(tuán)隊(duì)在多種腫瘤模型小鼠中成功分離出TILs，經(jīng)對(duì)環(huán)磷酰胺處理后的腫瘤小鼠給予TILs和白介素-2聯(lián)合治療，發(fā)現(xiàn)100%消除了MC38結(jié)腸腺癌肝轉(zhuǎn)移模型小鼠的腫瘤細(xì)胞[2]。1988年，TILs首次用于臨床，與白介素-2聯(lián)合治療經(jīng)環(huán)磷酰胺處理的15例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)客觀緩解率高達(dá)60%[3]。本文概要介紹TILs治療的研究進(jìn)展，供相關(guān)研究與開發(fā)者參考。

1 TILs治療產(chǎn)品的生產(chǎn)過程

盡管用于不同腫瘤患者的TILs來源不同，但最終回輸?shù)交颊唧w內(nèi)的TILs治療產(chǎn)品的生產(chǎn)過程都是相似的，主要包括前快速擴(kuò)增（對(duì)自腫瘤組織中分離出來的TILs進(jìn)行初步擴(kuò)增）、快速擴(kuò)增（分選出能殺傷腫瘤組織的高活性TILs且對(duì)其進(jìn)行快速擴(kuò)增）和回輸?shù)交颊唧w內(nèi)3個(gè)階段。整個(gè)生產(chǎn)過程均應(yīng)符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的要求，包括生產(chǎn)設(shè)施、工藝和質(zhì)量管理體系等。

目前，TILs治療產(chǎn)品的基本生產(chǎn)過程[4]為：先通過外科手術(shù)切下患者腫瘤，將腫瘤切成多個(gè)小段或用膠原酶消化為單細(xì)胞懸液，然后置于富含白介素-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨著時(shí)間推移，培養(yǎng)基中的腫瘤細(xì)胞被全部殺死。整個(gè)前快速擴(kuò)增通常需持續(xù)3 ～ 5周。當(dāng)TILs被培養(yǎng)至一定的細(xì)胞密度后，通過檢測(cè)能否分泌干擾素-γ來確定具有高抗腫瘤活性的TILs，并通過快速擴(kuò)增技術(shù)將其擴(kuò)增至所需數(shù)目?？焖贁U(kuò)增階段中，不同類別的T淋巴細(xì)胞均得到擴(kuò)增。使用患者的腫瘤細(xì)胞與擴(kuò)增后的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)測(cè)試，將分選出的具有腫瘤殺滅效力的T淋巴細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增。擴(kuò)增時(shí)需要使用經(jīng)過輻照的健康個(gè)體來源的外周血單核細(xì)胞充當(dāng)飼養(yǎng)層細(xì)胞、抗CD3單克隆抗體和高劑量的白介素-2來促進(jìn)TILs的快速增殖。整個(gè)TILs治療產(chǎn)品的生產(chǎn)周期通常為5 ～ 7周。038C597C-F774-40C1-9DC1-F6FE2E5B0876

2 TILs治療產(chǎn)品臨床應(yīng)用的可行性

2.1 多靶點(diǎn)

腫瘤具有異質(zhì)性，其在發(fā)生發(fā)展過程中并不是一成不變的，往往能通過抗原表位突變或表達(dá)喪失來逃避免疫檢查點(diǎn)抑制劑、T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor， TCR）T細(xì)胞和嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells， CAR-T）等免疫治療的攻擊。而TILs治療產(chǎn)品則由于其T淋巴細(xì)胞群表面TCR的多樣性，能識(shí)別一系列腫瘤抗原，故可很大程度地避免此類事件的發(fā)生[5]，很好地應(yīng)對(duì)腫瘤的異質(zhì)性。因此，對(duì)于具有高突變負(fù)荷的黑色素瘤等實(shí)體瘤，TILs的治療效果優(yōu)于CAR-T[6]。

2.2 優(yōu)越的腫瘤歸巢能力

高劑量白介素-2治療會(huì)增加腫瘤微環(huán)境中趨化因子受體CCR5和CXCR3的配體（CCL3、CCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11等）的表達(dá)[7]。而TILs傾向于主要由效應(yīng)記憶T細(xì)胞組成，它們的表面表達(dá)著趨化因子受體，如CCR5和CXCR3等。因此，當(dāng)被回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，TILs可很容易地浸潤腫瘤組織[8]。

2.3 較低的脫靶毒性

由于TILs治療產(chǎn)品所含T淋巴細(xì)胞中已排除了容易攻擊自身細(xì)胞的T細(xì)胞，故其治療的脫靶毒性通常較低。作為比較，CAR-T表面的嵌合抗原受體中的單鏈可變片段或TCR T細(xì)胞表面的工程化TCR若與正常組織的抗原有交叉反應(yīng)性，則往往會(huì)產(chǎn)生脫靶毒性[9]。

2.4 可用于高度耐藥患者治療

TILs治療有使高度耐藥的腫瘤患者受益的潛力。有研究顯示，在經(jīng)抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4和抗程序性死亡受體-1 （programmed cell death-1， PD-1）藥物治療后復(fù)發(fā)的黑色素瘤患者中，TILs治療仍可能具有誘導(dǎo)患者產(chǎn)生腫瘤特異性免疫反應(yīng)的效力，使12例免疫治療失敗患者中的2例達(dá)到了部分緩解[10]。

2.5 能提高其他免疫治療的效果

TILs聯(lián)合抗PD-1藥物治療的效果優(yōu)于單用抗PD-1藥物。由于TILs治療產(chǎn)品中含有大量的CD8+ T細(xì)胞，后者能介導(dǎo)干擾素-γ的表達(dá)和分泌，而干擾素-γ分泌增多又會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的程序性死亡受體配體-1的表達(dá)和上膜[11]，故可提高抗PD-1藥物的治療效果。

3 TILs治療的臨床研究進(jìn)展

近年來，人們開展了大量的TILs治療臨床研究，以觀察和評(píng)估TILs治療對(duì)黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和肉瘤等的效果。其中，TILs治療實(shí)際用于黑色素瘤患者已有20多年歷史。腫瘤特異性T細(xì)胞雖能很大程度浸潤到黑色素瘤，但卻似乎不會(huì)發(fā)生反應(yīng)。而當(dāng)這些T細(xì)胞被從腫瘤微環(huán)境中取出并用白介素-2在體外培養(yǎng)、激活和擴(kuò)增，再回輸至患者體內(nèi)后，卻有了很好的腫瘤殺傷效力，使黑色素瘤達(dá)到持久的完全緩解[3， 12-13]。目前研究顯示，TILs治療黑色素瘤和宮頸癌的效果較為突出，代表性的產(chǎn)品是Iovance生物治療有限公司的LN-144（lifileucel）[14]和LN-145。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌[15]、骨肉瘤[16]和卵巢癌，TILs治療也被證實(shí)有一定的效果。截至今日，全球尚無TILs治療產(chǎn)品獲準(zhǔn)上市。不過，lifileucel已在美國提出了生物制劑許可申請(qǐng)，可能于2022年內(nèi)獲得批準(zhǔn)。該產(chǎn)品于2019年獲得了美國FDA的突破性治療藥物認(rèn)證。

4 TILs治療臨床應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)與解決策略

4.1 具有抗腫瘤活性的TILs分離困難

盡管TILs治療已被證實(shí)對(duì)實(shí)體瘤有效，但不是所有的腫瘤組織中都存在比較多的免疫浸潤淋巴細(xì)胞。而且，TILs治療產(chǎn)品的生產(chǎn)須通過外科手術(shù)獲取的腫瘤組織作為初始物料，這對(duì)絕大多數(shù)晚期腫瘤患者來說是不現(xiàn)實(shí)的。此外，就算腫瘤組織中存在免疫浸潤的淋巴細(xì)胞，也很難從中分離出真正具有抗腫瘤活性且增殖能力強(qiáng)的TILs。事實(shí)上，TILs是一個(gè)異質(zhì)性群體，不僅包含腫瘤相關(guān)抗原反應(yīng)性T細(xì)胞（tumor-associated antigenreactive T cells， TAA-T），還包含識(shí)別非腫瘤（主要是病毒）表位的旁觀者T細(xì)胞，只有約30%的TILs是能與腫瘤細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的[17]。然而，目前還無有效的標(biāo)記方法來特異性地識(shí)別、分離TAA-T和旁觀者T細(xì)胞。盡管通過檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物（如PD-1）可在一定程度上富集腫瘤反應(yīng)性TILs[18]，但腫瘤微環(huán)境中也存在表達(dá)這些標(biāo)志物的旁觀者T細(xì)胞[19]。

目前，TAA-T的分離主要是利用反向免疫學(xué)[20]找到同源肽-主要組織相容性復(fù)合體（homologous peptidemajor histocompatibility complex， pMHC），再通過pMHC與TCR的相互作用來實(shí)現(xiàn)的[21]。即先對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行全外顯子測(cè)序找到非同義突變[22]，結(jié)合找到的多肽序列生成候選肽，再利用質(zhì)譜[23]或算法（如特定位置的評(píng)分矩陣、機(jī)器學(xué)習(xí)算法）[24]來預(yù)測(cè)能結(jié)合人主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá)產(chǎn)物人白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen， HLA）的候選肽，最后用熒光候選肽-HLA多聚體來找到TAA-T。盡管已取得一些成功，但大部分算法確定的候選肽并不具有免疫原性，不能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，因?yàn)楝F(xiàn)有的計(jì)算工具不能完全準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)T細(xì)胞的反應(yīng)性[25]。此外，這類方法往往需要較長的周轉(zhuǎn)時(shí)間。近期，有研究者開發(fā)了一種基于細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的新鄰近標(biāo)記方法，通過化學(xué)合成的供體底物GDP-FucBiotin將TILs中的TAA-T與旁觀者T細(xì)胞區(qū)分開來[26]，從而獲得具有更強(qiáng)抗腫瘤活性的TILs治療產(chǎn)品。不過，該方法所用供體底物的特殊性和高成本可能會(huì)限制其在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用。

4.2 TILs在體內(nèi)的持久性不高

在將TILs治療產(chǎn)品回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi)前，須先使TILs的數(shù)目擴(kuò)增至109 ～ 1011數(shù)量級(jí)。擴(kuò)增過程中不但會(huì)擴(kuò)增TILs的數(shù)目，而且會(huì)促使T細(xì)胞分化及其表型發(fā)生變化。這些都會(huì)影響TILs回輸后在體內(nèi)的增殖能力和持久性。038C597C-F774-40C1-9DC1-F6FE2E5B0876

Rosenberg等[27]通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到TILs中來進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)在TILs回輸后的前21 d內(nèi)，僅有1/10 000 ～ 1/300的基因修飾TILs持續(xù)存在于循環(huán)中。Robbins等[28]通過對(duì)25例先后接受非清髓性化療和TILs治療的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的外周血樣本進(jìn)行序列分析來檢測(cè)T細(xì)胞受體β可變區(qū)基因的相對(duì)表達(dá)率，從而評(píng)估T細(xì)胞多克隆群中存在的單個(gè)克隆型的相對(duì)頻率，發(fā)現(xiàn)腫瘤消退與過繼性T細(xì)胞的持久性顯著相關(guān)，表明T細(xì)胞持久性不高可能是限制過繼性T細(xì)胞治療效果的主要因素。

Rosenberg等[29]發(fā)現(xiàn)，在對(duì)腫瘤患者回輸TILs前先進(jìn)行非骨髓性淋巴細(xì)胞清除可顯著增強(qiáng)TILs在體內(nèi)的增殖能力和持久性。他們對(duì)93例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者進(jìn)行持續(xù)2 d的環(huán)磷酰胺60 mg/kg和持續(xù)5 d的氟達(dá)拉濱25 mg/m2治療以清除非骨髓性淋巴細(xì)胞，然后回輸TILs治療。結(jié)果顯示，52例（56%）患者有客觀應(yīng)答。共有20例（22%）患者達(dá)到完全緩解，其中19例患者的完全緩解期>3年。Tran等[30]提出了在不篩選TAA-T的情況下分選“年輕的TILs”以簡化TILs治療產(chǎn)品生產(chǎn)的設(shè)想。他們?cè)趯?duì)34份腫瘤樣本進(jìn)行測(cè)試后發(fā)現(xiàn)，年輕的TILs盡管具有顯著不同的T淋巴細(xì)胞組成，但卻都能表現(xiàn)出與常規(guī)TILs相當(dāng)?shù)奶禺愋钥鼓[瘤效力，與臨床需求的匹配度更高。

4.3 TILs治療的不良反應(yīng)

TILs治療產(chǎn)品本身的毒性較低，但要維持回輸?shù)交颊唧w內(nèi)的TILs的增殖和存活還須同時(shí)給予高劑量的白介素-2，后者常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴、毛細(xì)血管泄漏綜合征[31]、免疫抑制等不良事件的發(fā)生[32]。白介素-2的毒性呈劑量依賴性，劑量過高會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加，使得體液外滲到器官中而引起器官損傷，同時(shí)有發(fā)熱、寒戰(zhàn)、呼吸困難、腹瀉等不良反應(yīng)。

由于大多數(shù)白介素-2相關(guān)的毒性都會(huì)在白介素-2給藥后2 ～ 5 d內(nèi)顯著降低，故對(duì)白介素-2毒性管理的關(guān)鍵在于何時(shí)開始下一劑給藥。白介素-2的毒性通常在其給藥后4 ～ 6 h達(dá)到峰值，一般會(huì)在預(yù)定的下一劑給藥前消退[33]。此外，Yao等[34]對(duì)多項(xiàng)TILs治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，白介素-2可通過介導(dǎo)CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞重建來抑制TILs的抗腫瘤免疫反應(yīng)，其給藥次數(shù)與TILs治療效果呈負(fù)相關(guān)性。

5 下一代TILs治療產(chǎn)品

常規(guī)TILs治療產(chǎn)品因有體外擴(kuò)增過程，使得大部分TILs成為耗竭性T細(xì)胞，腫瘤殺傷效力和持久性都難令人滿意。為克服這些缺陷，研究者們正在嘗試對(duì)TILs進(jìn)行基因改造。據(jù)悉，國內(nèi)已借助“增強(qiáng)受體”和“擴(kuò)增因子”等專利技術(shù)對(duì)TILs進(jìn)行基因改造，制備出了“超級(jí)TILs”，旨在解決實(shí)體瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境等對(duì)TILs治療的影響。嵌合抗原受體TILs用于實(shí)體瘤治療的臨床試驗(yàn)也在計(jì)劃中。目前，新一代或稱下一代TILs治療產(chǎn)品的發(fā)展方向主要聚焦在如下4個(gè)方面：增強(qiáng)TILs靶向和識(shí)別腫瘤的能力；增強(qiáng)TILs在體內(nèi)的持久性；增強(qiáng)TILs的腫瘤浸潤能力；增強(qiáng)TILs的腫瘤殺傷效力。

在增強(qiáng)TILs靶向和識(shí)別腫瘤的能力方面，Mills等[35]構(gòu)建了由CD3ζ、CD28共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域和腫瘤相關(guān)抗原人表皮生長因子受體-2的人源單鏈抗體融合組成的嵌合抗原受體，然后通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至自黑色素瘤組織中分離出的TILs中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)導(dǎo)TILs相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)TILs在用于黑色素瘤治療時(shí)的細(xì)胞因子分泌量有小幅增加，但腫瘤殺傷效力沒有明顯增強(qiáng)。這可能與轉(zhuǎn)導(dǎo)TILs的體外培養(yǎng)時(shí)間過長、體內(nèi)增殖率低，以及轉(zhuǎn)導(dǎo)本身的效率不高等因素有關(guān)。

在增強(qiáng)TILs在體內(nèi)的持久性方面，Heemskerk等[36]通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將人白介素-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至TILs中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此可提高TILs在體外停用白介素-2后的存活能力，但未能增強(qiáng)TILs在體內(nèi)的持久性和反應(yīng)性。他們的研究發(fā)現(xiàn)，將轉(zhuǎn)導(dǎo)了白介素-2基因的TILs擴(kuò)增到足夠數(shù)目往往需要更長的時(shí)間，而這可能對(duì)TILs的體內(nèi)增殖能力產(chǎn)生負(fù)面影響，致使轉(zhuǎn)導(dǎo)了白介素-2基因的TILs的體內(nèi)反應(yīng)性低。

在增強(qiáng)TILs的腫瘤浸潤能力方面，Idorn等[37]通過慢病毒將趨化因子受體CXCR2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至TILs中，發(fā)現(xiàn)此可顯著提高TILs在小鼠黑色素瘤模型中的腫瘤浸潤水平。不過，腫瘤歸巢能力的提高能否增強(qiáng)TILs的治療效果，目前還不清楚。

在增強(qiáng)TILs的腫瘤殺傷效力方面，Zhang等[38]通過將白介素-12基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至TILs中來促使腫瘤微環(huán)境中骨髓來源的細(xì)胞從免疫抑制重編碼為免疫激活狀態(tài)，從而介導(dǎo)浸潤性腫瘤破壞。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)TILs雖治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的客觀反應(yīng)率達(dá)63%，但其在體內(nèi)不能長期持續(xù)存在，且有嚴(yán)重的劑量限制性毒性。

6 結(jié)語

目前，TILs治療漸趨成熟，并已在治療黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和肉瘤等多種實(shí)體瘤方面顯現(xiàn)有較好的效果。但TILs治療現(xiàn)仍面臨一些挑戰(zhàn)，包括TAA-T難以分離及其在體內(nèi)的持久性和安全性等。相信隨著相關(guān)研究的深入，TILs治療將得到不斷發(fā)展，從而真正走上臨床，造福眾多腫瘤患者。

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