亞致死劑量三唑錫對(duì)二斑葉螨Tetranychus urticus解毒酶系的影響

葉調(diào)琴，楊順義，李文平

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

二斑葉螨(Tetranychusurticae)是一種世界性的農(nóng)牧業(yè)害螨，為害多種作物，如苜蓿、三葉草等。二斑葉螨的成、若螨群集于植物葉背刺吸汁液，受害葉片呈白色失綠斑點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)枯死。二斑葉螨有體型小，繁殖快，世代短，分布廣和突變率高等特點(diǎn)，加之不合理的使用化學(xué)農(nóng)藥，使其對(duì)多種藥劑產(chǎn)生了抗藥性，給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失[1-2]。

在甘肅地區(qū)二斑葉螨主要危害果樹(shù)、蔬菜、農(nóng)作物及牧草，且危害范圍有擴(kuò)大的趨勢(shì)。梁旭東[3]研究發(fā)現(xiàn)蘭州市二斑葉螨中度為害。張廷偉等[4]研究發(fā)現(xiàn)二斑葉螨3個(gè)不同蟲口密度下白三葉體內(nèi)葉綠素含量、POD、PPO活性差異顯著(P<0.05)。

三唑錫，化學(xué)名稱為1-(三環(huán)已基甲錫烷基)-1氫-1,2,4-三氮雜茂，是一種廣譜的有機(jī)錫類殺螨劑，廣泛用于防治果樹(shù)、蔬菜和花卉上發(fā)生的害螨，對(duì)柑橘紅蜘蛛(Panonychuscitri)、蘋果全爪螨(P.ulmi)二斑葉螨的防治效果顯著，對(duì)抗有機(jī)磷農(nóng)藥的螨類有較好的防治效果，可殺滅若螨及成螨，對(duì)夏卵也有一定殺滅效果[5-6]。劉敏等[7]研究發(fā)現(xiàn)三唑錫亞致死濃度與土耳其斯坦葉螨(T.turkestani)運(yùn)動(dòng)速率成反比。安曉寧等[8]研究發(fā)現(xiàn)20%三唑錫懸浮劑對(duì)蘋果紅蜘蛛防效好且對(duì)蘋果樹(shù)安全。于士將等[9]研究發(fā)現(xiàn)20%四螨嗪·三唑錫懸浮劑對(duì)柑桔全爪螨(P.citri)防效較好且對(duì)柑桔和天敵安全。

螨類抗藥性的形成與其代謝作用及靶標(biāo)部位的敏感性密切相關(guān)。螨類主要通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)和多功能氧化酶(MFOs)等解毒酶表達(dá)量或活性的增加，來(lái)提高對(duì)藥劑的解毒能力[10]。目前，已有大量研究表明葉螨對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生抗性，包括神經(jīng)毒素類(如有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類)、線粒體電子傳遞鏈抑制劑類(噠螨靈)等[11-12]。但三唑錫對(duì)葉螨的抗藥性研究報(bào)道較少。本文研究了三唑錫亞致死劑量LC10和LC30處理下二斑葉螨體內(nèi)3種解毒酶(CarEs、GSTs和MFOs)酶比活性的變化情況，旨在為深入研究二斑葉螨的抗藥性機(jī)制及三唑錫的合理使用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 二斑葉螨敏感品系由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，在室溫(25±1)℃，相對(duì)濕度(70±5)%條件下，用新鮮、干凈的豇豆葉片飼養(yǎng)，期間不接觸任何藥劑，連續(xù)繁殖，取雌成螨作供試蟲源。

1.1.2 供試藥劑 20%三唑錫懸浮劑(陜西標(biāo)正作物科學(xué)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 室內(nèi)毒力測(cè)定及亞致死劑量確立 毒力測(cè)定：室內(nèi)毒力測(cè)定參照FAO(1980)推薦的玻片浸漬法[16](slide-dip method)并加以改進(jìn)。取1 cm寬的雙面膠帶剪成1.5 cm長(zhǎng)，貼在載玻片的一端，用鑷子揭去雙面膠上的紙片，再用零號(hào)毛筆挑取行動(dòng)活潑的雌成螨，將其背部粘在雙面膠帶上(不能粘住螨足、螨須和口器)，每片粘35頭，分成3行。在溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度為(70±5)%的智能人工氣候箱中放置1 h后，用雙目鏡觀察，去除死亡和不活潑個(gè)體，保留30頭。移取1 mL 20%三唑錫懸浮劑，分別加水稀釋為1、0.66、0.5、0.4、0.33 mg/L等5個(gè)濃度，將帶螨載玻片一端浸入藥液中，輕輕搖動(dòng)5 s后取出，用濾紙吸干螨體周圍多余的藥液，放入鋪有海綿的托盤中，置于溫度(25±1)℃、光周期L∶D=16 h∶8 h、相對(duì)濕度為(70±5)%的智能人工氣候箱，24 h后檢查結(jié)果，用筆尖輕觸螨體，以螨足不動(dòng)者為死亡；試驗(yàn)重復(fù)3次，以無(wú)菌室作為對(duì)照，計(jì)算出毒力回歸方程，得出LC10與LC30值。

1.2.2 解毒酶系酶液制備 供試螨處理 根據(jù)室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果，以LC10和LC30濃度，采用葉片噴霧法處理二斑葉螨雌成螨，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以無(wú)菌水作對(duì)照[14]。噴藥后放置于溫度為(25±1)℃，相對(duì)濕度(70±5)%，光周期16 h∶8 h的條件下飼養(yǎng)。將噴藥后的雌成螨分別于3、6、12、24、48 h，每個(gè)時(shí)間段各挑取100頭活螨置于干凈的1.5 mL離心管中，放置4 ℃冰箱下保存待用。

解毒酶系酶液制備 用零號(hào)毛筆分別挑取三唑錫藥劑處理和無(wú)菌水處理后的二斑葉螨雌成螨100頭，置于3個(gè)1.5 mL離心管中，于4 ℃冰箱冰凍24 h，再分別加入0.04 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液、66 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液和0.1 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液1.5 mL，用研磨棒于冰水浴中研磨，在10 000 r/min，4 ℃下離心15 min，取上清液備用。

酶源蛋白含量及解毒酶系酶比活性測(cè)定：牛血清蛋白、α-萘酚和對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：參照何恒果[15]的方法。酶源蛋白含量測(cè)定：參考Bradford[16]的方法。羧酸酯酶(CarEs)活性測(cè)定參考Van Asperen[17]方法；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性測(cè)定參考Clark等[18]方法；多功能氧化酶(MFOs)活性測(cè)定參考Hansen和Hodgson[19]方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用新復(fù)極差法(Duncan’s)分析各處理間酶比活力差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 三唑錫毒力測(cè)定結(jié)果

三唑錫毒力回歸方程為y=3.959x+1.882，卡方值x2=4.589，相關(guān)系數(shù)R=0.928，LC50值為0.335 mg/L，LC10值為0.159 mg/L，LC30值為0.247 mg/L。

2.2 亞致死劑量三唑錫對(duì)二斑葉螨解毒酶比活性的影響

2.2.1 亞致死劑量三唑錫對(duì)GSTs酶比活性的影響 三唑錫亞致死劑量LC10處理二斑葉螨后，其體內(nèi)的GSTs在3～6 h和12～24 h酶比活性逐漸升高，6 h達(dá)到最高，其余時(shí)間段酶比活性下降，整體明顯高于對(duì)照；LC30劑量處理后，變化規(guī)律與LC10相似，除24 h酶比活性低于LC10外，其余時(shí)間段GSTs活力緩慢升高，在6 h和48 h時(shí)達(dá)到最大，處理6～12 h酶比活性下降，12 h時(shí)達(dá)到最低，但酶比活性整體高于對(duì)照和LC10(圖1)。

圖1 三唑錫亞致死劑量處理下二斑葉螨體內(nèi)GSTs酶比活性的變化

2.2.2 三唑錫亞致死劑量對(duì)CarEs酶比活性的影響 二斑葉螨CarEs酶比活性在LC10劑量下，總體呈上升趨勢(shì)，6～12 h酶比活性降低，其余時(shí)間段內(nèi)均逐漸增加，至48 h時(shí)達(dá)到最大，除3 h時(shí)低于對(duì)照外，其余均高于對(duì)照。LC30劑量下整體呈上升趨勢(shì)，12～24 h酶比活性降低，其余時(shí)間段內(nèi)均逐漸增加，至48 h時(shí)達(dá)到最大，明顯高于對(duì)照和LC10(圖2)。

圖2 亞致死劑量三唑錫處理下二斑葉螨體內(nèi)CarEs酶比活性

2.2.3 三唑錫亞致死劑量對(duì)MFOs比活力的影響 二斑葉螨MFOs活力在LC10劑量下總體呈緩慢上升趨勢(shì)，在6～12 h和24～48 h升高，至48 h時(shí)達(dá)最大，除3和24 h時(shí)低于對(duì)照外，其余時(shí)間段內(nèi)均高于對(duì)照；在LC30劑量下整體呈下降趨勢(shì)，其中在3～6 h時(shí)上升較快，而后下降，在6 h時(shí)達(dá)到最大，除48 h時(shí)外，其余時(shí)間酶活均高于LC10，且各時(shí)間點(diǎn)間差異不顯著。

3 討論

化學(xué)藥劑殺蟲是防治害蟲的最普遍的措施。殺蟲劑除了直接殺滅害蟲外，殘存于環(huán)境中的有效成分也會(huì)隨著時(shí)間的推移降解至亞致死濃度，引起亞致死效應(yīng)[20]。亞致死劑量殺蟲劑不僅對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖力及抗性等有影響，也會(huì)對(duì)其體內(nèi)多種解毒代謝酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用[24-25]。而亞致死效應(yīng)作為預(yù)測(cè)害蟲種群發(fā)生動(dòng)態(tài)和害蟲抗藥性監(jiān)測(cè)的重要手段，其研究主要為體內(nèi)的解毒酶(主要是GSTs、CarEs和MFOs)的比活力變化。

圖3 亞致死劑量三唑錫處理下二斑葉螨體內(nèi)MFOs比活性

本試驗(yàn)研究了三唑錫亞致死劑量處理二斑葉螨后，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶的酶比活性在不同時(shí)間點(diǎn)的變化。用LC30和LC10處理二斑葉螨后，其體內(nèi)3種解毒酶LC30處理均高于LC10處理且明顯高于對(duì)照組，表明隨著時(shí)間的變化藥劑濃度越高酶比活性越高，說(shuō)明三唑錫對(duì)3種解毒酶有抑制作用且濃度越高抑制作用越明顯。這與前人報(bào)道的研究結(jié)果一致，如常蕓等[23]通過(guò)二斑葉螨經(jīng)乙唑螨腈和聯(lián)苯肼酯亞致死劑量(LC10、LC30)處理后，其體內(nèi)GSTs的酶比活性除乙唑螨腈LC10處理在12 h和24 h、聯(lián)苯肼酯LC10處理在24 h時(shí)表現(xiàn)為抑制作用外，其余時(shí)間段均較對(duì)照高，表現(xiàn)為激活作用。金晶等[24]研究在亞致死劑量苦參堿處理后，二斑葉螨體內(nèi)解毒酶比活性會(huì)隨時(shí)間發(fā)生改變，但整體上，3大解毒酶的比活性較對(duì)照都有所增加。李瑞娟等[25]研究梅嶺霉素和溴蟲腈對(duì)二斑葉螨的抗性機(jī)理的影響發(fā)現(xiàn)在處理6 h后溴蟲腈對(duì)MFO酶活力誘導(dǎo)顯著，并且隨時(shí)間的增長(zhǎng)酶活力增強(qiáng)，但在處理24～48 h處理組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。由此得出二斑葉螨對(duì)溴蟲腈的代謝與MFO有關(guān)。楊娟生等[26]研究發(fā)現(xiàn)致死劑量溴蟲腈和毒死蜱亞處理等鉗蠊螨(Blattisociusdentriticus)24 h后、GST細(xì)胞色素P450、CarE的酶比活性較對(duì)照高且P450的酶比活性明顯高于對(duì)照。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果可為研究二斑葉螨的抗藥性機(jī)制及三唑錫的合理使用提供前期理論依據(jù)。但試驗(yàn)僅測(cè)定了解毒酶比活性，繼續(xù)探討二斑葉螨對(duì)三唑錫的抗性需進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)三唑錫處理二斑葉螨后，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)GSTs酶比活性在LC30劑量下均高于LC10(除24 h外)和對(duì)照。CarEs酶比活性在LC30劑量下均高于LC10和對(duì)照。MFOs酶比活性在LC30劑量均高于LC10和對(duì)照；LC10劑量處理與LC30劑量處理相一致，均高于對(duì)照。說(shuō)明3種解毒酶的酶比活性的變化與三唑錫的抗性有關(guān)。