溫度對不同品種紫花苜蓿種子發(fā)芽特征的影響

向上，汪輝，田莉華，陳有軍，孫萬斌，周青平

(西南民族大學青藏高原研究院，成都 四川 610041)

紫花苜蓿(Medicagosativa)因其適口性好、品質(zhì)優(yōu)良、適應性廣而在世界范圍內(nèi)被廣泛種植。2018年，全球干草出口755萬噸，其中，紫花苜蓿干草出口量最高，占55%[1]。隨著我國振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動、糧改飼和草牧業(yè)政策的實施，紫花苜蓿種植規(guī)模迅速增長，紫花苜蓿在我國現(xiàn)代草地畜牧業(yè)生產(chǎn)和人工草地建植中發(fā)揮著重要作用。為滿足種植需求，我國每年進口大量紫花苜蓿種子，2020年進口量為0.35萬噸，同比增加37%[2]。相比國內(nèi)培育的紫花苜蓿品種，引進的品種存在種植適應性差的風險。我國紫花苜蓿主要的栽培區(qū)域在北方，晚秋或早春播種時，低溫是影響其萌發(fā)和出苗的主要因素之一。因此，了解主要栽培品種在低溫下的發(fā)芽和幼苗生長特性對篩選紫花苜蓿適生品種及其推廣種植具有一定的參考價值。

種子萌發(fā)是植物生命周期的起點，對種植環(huán)境十分敏感[3-4]，植物種子的萌發(fā)特性直接影響幼苗個體適合度和存活能力[5]。適宜的溫度是植物種子萌發(fā)的必要條件，低溫脅迫對種子萌發(fā)具有抑制作用。賈祥等[6]研究表明，在4 ℃低溫脅迫下，紫花苜蓿、天藍苜蓿、白花草木犀和黃花草木犀等4種豆科牧草的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長和胚芽長均低于對照(25 ℃)。高茜等[7]的研究也表明，相比25 ℃，紫花苜蓿種子在10 ℃下的發(fā)芽率顯著降低，發(fā)芽時間延長，幼苗生長緩慢，植株較弱。低溫主要通過影響種子生理活動，使其發(fā)芽率降低、使幼苗生長緩慢[8]。低溫脅迫下，植物種子內(nèi)活性氧(ROS)水平將會升高[9]，ROS的過量產(chǎn)生將會對植物的細胞和代謝功能產(chǎn)生危害，并對蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物和DNA造成損傷，進而導致膜損傷[10]，細胞呼吸減少[9]，從而導致細胞死亡[11]，最終致使種子發(fā)芽率降低，使產(chǎn)量嚴重受損[12]。

本研究以20個紫花苜蓿品種為試驗材料，測定4、8和20 ℃下各品種的發(fā)芽指標，初步分析紫花苜蓿種子萌發(fā)特性對不同溫度條件的響應，以期了解各品種的耐低溫萌發(fā)特性，為篩選低溫下適宜種植的紫花苜蓿品種，促進紫花苜蓿人工草地建植提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括金皇后、SG401、SG402、SG403、巨能418Q、巨能耐濕、巨能耐鹽、4010、巨能CR、WL525、4020MF、亮牧、敖漢、草原3號、中草3號、中苜1號、中苜3號、肇東等20個紫花苜蓿品種(表1)。

表1 供試紫花苜蓿品種種子來源

1.2 試驗設計

將20個紫花苜蓿品種種子分別放到20、8和4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每個品種隨機挑選100粒健康種子擺放到鋪有2層濾紙的直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，加入適量蒸餾水濕潤濾紙，之后將培養(yǎng)皿移至恒溫培養(yǎng)箱中，重復4次，并設置恒溫培養(yǎng)箱的發(fā)芽環(huán)境為每天光照16 h，光照強度為600 mmol/(m2·s)，相對濕度為60%。每天補充水分，胚根突破種皮2 mm視為發(fā)芽。

1.3 指標測定

記錄每天的發(fā)芽種子數(shù)，20和8 ℃于第10天結(jié)束發(fā)芽，4 ℃于第15天結(jié)束發(fā)芽，發(fā)芽結(jié)束時從每個重復中隨機挑選10個種苗，測量苗長。按照以下公式計算相應指標：

(1)發(fā)芽勢(%)=第4天時發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

(2)發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

(3)發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)式中：Gt為第t日的出苗數(shù)；Dt為相應出苗天數(shù)。

(4)活力指數(shù)(VI)=GI×S；式中，S為平均芽長。

式中，ti為第i日出苗天數(shù)；ni為第i日出苗種子數(shù)；k為結(jié)束發(fā)芽時間。

(6)同步指數(shù)(the synchronization index，Z)

Z=∑Cni,2/N,Cni,2=ni(ni-1)/2N=∑ni(∑ni-1)/2，式中，ni為第i日出苗種子數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用方差分析比較3個溫度條件下20個紫花苜蓿品種的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、同步指數(shù)、平均發(fā)芽時間、活力指數(shù)、平均苗長，并采用最小顯著差異法(LSD)對其進行多重比較。在計算各發(fā)芽指標相關性時為減少和消除紫花苜蓿種子初始指標間的差異性，選擇相對萌發(fā)指標來評價。20 ℃下各指標值為1，4和8 ℃低溫培養(yǎng)下的各指標值占20 ℃下相應指標值的比例即為相對指標值。運用簡單相關分析法比較發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間、同步指數(shù)、平均苗長等7個萌發(fā)指標之間的相關性。

選取發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗長等5個指標對20個品種進行打分制綜合評價[13]。以4、8 ℃低溫處理下的指標值(T)占20 ℃測定的指標(CK)值的百分數(shù)(T/CK×100%)作為該指標的變化率。根據(jù)材料各個指標變化率的大小進行打分，打分的標準是把每一種指標的最大變化率與最小變化率之間的差值均分為10個級別，每級分別賦予不同的得分，即1分、2分……、10分。各個指標均以抗寒性最強的品種得分最高，即10分，抗寒性最弱的品種得分最低，即1分，依此類推。最后把各個指標的得分進行相加得到試驗材料萌發(fā)期的抗寒性總分，根據(jù)各品種苗期的抗寒性總分可得到抗寒性排序。

方差分析、相關分析均用SPSS 21.0軟件輔助完成，使用Origin完成制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對紫花苜蓿種子發(fā)芽指標的影響

2.1.1 發(fā)芽種子數(shù) 20 ℃下，各紫花苜蓿品種均在第1天開始發(fā)芽，第3天時各品種發(fā)芽種子數(shù)皆達到50個以上，第4天后各品種發(fā)芽種子數(shù)恒定(圖1-A)。8 ℃下，第3天時，SG403等品種開始發(fā)芽，至發(fā)芽結(jié)束各品種發(fā)芽種子數(shù)緩慢增加(圖1-B)。4 ℃下，第6天時，僅有亮牧、巨能耐鹽、金皇后等部分品種開始發(fā)芽；第10天時，巨能耐濕等12個品種發(fā)芽的種子數(shù)小于5個(圖1-C)。

圖1 20個品種紫花苜蓿種子的發(fā)芽過程

2.1.2 發(fā)芽勢 20 ℃時，SG403發(fā)芽勢最高，達97%，與龍牧806、龍牧801、SG402、WL525、SG401、4010、巨能418Q、肇東之間差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；草原3號發(fā)芽勢最低，為71%(表2)。8 ℃時，同樣，SG403發(fā)芽勢最高，為43%，與巨能418Q、亮牧、4020MF、巨能耐鹽、SG402差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；4010發(fā)芽勢最低，只有1%(表2)。而4 ℃時的發(fā)芽勢，除了巨能耐鹽發(fā)芽勢為10%以外，幾乎都為0(表2)。

同一品種在不同溫度下的發(fā)芽勢存在差異，所有參試品種在20 ℃時的發(fā)芽勢均顯著(P<0.05)高于8和4 ℃時；且除了4010、龍牧806、龍牧801草原3號以外，其余品種在8 ℃的發(fā)芽勢均顯著(P<0.05)高于4 ℃時。

2.1.3 發(fā)芽率 20 ℃時，龍牧806發(fā)芽率最高，達到100%，與肇東、龍牧801、SG402、4010、SG403、SG401、WL525差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；草原3號20 ℃發(fā)芽率最低，為72%(表2)。8 ℃時，巨能418Q發(fā)芽率最高，達92%，與SG403、巨能耐濕、中苜3號、亮牧、SG402、WL525、肇東差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；龍牧806在8 ℃發(fā)芽率為最低，為40%(表2)。4 ℃時，SG402發(fā)芽率最高，達65%，與巨能耐鹽、4020MF、亮牧、SG401之間差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；龍牧806在4 ℃時發(fā)芽率最低，為4%(表2)。

同一品種在不同溫度下的發(fā)芽率存在差異，除中苜3號、巨能耐濕、巨能418Q、SG402、龍牧801、WL525、4020MF、肇東以外，其余參試品種皆是在20 ℃時的發(fā)芽率顯著(P<0.05)高于8 ℃和4 ℃；8 ℃時的所有品種發(fā)芽率都顯著(P<0.05)高于4 ℃。

2.1.4 發(fā)芽指數(shù) 20 ℃時，WL525發(fā)芽指數(shù)最高，達267.82，顯著(P<0.05)高于其余品種；草原3號發(fā)芽指數(shù)最低，為144.25(表2)。8 ℃時，SG403發(fā)芽指數(shù)最高，達86.10，與巨能418Q差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；龍牧806發(fā)芽指數(shù)最低，達21.29。4 ℃時，巨能耐鹽發(fā)芽指數(shù)最高，達45.96，與4020MF、SG402差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；龍牧806發(fā)芽指數(shù)為最低，為0.47。

除了金皇后在8 ℃與4 ℃條件下的發(fā)芽指數(shù)之間不存在顯著差異，其余各品種在20 ℃時的發(fā)芽指數(shù)均最高，在4 ℃時均最低，不同溫度間差異顯著(P<0.05)。

2.1.5 活力指數(shù) 20 ℃時,WL525活力指數(shù)最高，達688.54，與肇東、龍牧806、龍牧801差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；草原3號活力指數(shù)最低，為227.21(表2)。8 ℃時，巨能418Q活力指數(shù)最高，達89.91，與SG403、SG402差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；龍牧806活力指數(shù)最低，為12.10(表2)。4 ℃時，巨能耐鹽活力指數(shù)最高，達39.10，顯著(P<0.05)高于其余參試品種；龍牧806活力指數(shù)最低，為0.23(表2)。

表2 紫花苜蓿各品種發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)

20個品種在20 ℃時的活力指數(shù)，均顯著(P<0.05)高于8 ℃和4 ℃；巨能CR、巨能418Q、巨能耐濕、中苜1號、亮牧等5個品種在4 ℃時的活力指數(shù)，均顯著(P<0.05)低于8 ℃時，其余品種4和8 ℃時的活力指數(shù)之間差異不顯著。

20 ℃時各品種活力指數(shù)為688.54～277.21，8 ℃時各品種活力指數(shù)的變幅為89.91～12.10，4 ℃時各品種活力指數(shù)為39.10～0.23，且20 ℃時的活力指數(shù)均值為429.32，8 ℃時的活力指數(shù)均值為49.09，4 ℃時的活力指數(shù)均值為0.23。

2.1.6 苗長 20 ℃時，龍牧806的苗長最大，為3.17 cm，與龍牧801差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；中苜1號苗長最小，為1.39 cm，各品種的平均苗長為1.9 cm(表3)。8 ℃時，巨能418Q的苗長最大，為1.10 cm，與巨能CR、SG403、巨能耐濕、中苜3號、SG402差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余品種；草原3號苗長最小，為0.56 cm，各品種的平均苗長為0.86 cm。4 ℃時，巨能耐鹽的苗長最大，為0.85 cm，與金皇后，SG401、亮牧、4020MF、SG402、差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于其余參試品種；中苜1號苗長最短，達0.23 cm，各品種的平均苗長為0.47 cm。20 ℃下各品種的苗長均顯著(P<0.05)高于8和4 ℃。

2.1.7 平均發(fā)芽時間 20 ℃時，WL525平均發(fā)芽時間最短，為5.55 d，顯著(P<0.05)低于其余品種，中苜3號平均發(fā)芽時間最長，o 6.02 d(表3)；8 ℃時，SG403平均發(fā)芽時間最短，為7.21 d，與SG402、巨能418Q、巨能耐鹽、巨能CR、4020MF、中苜1號、肇東差異不顯著，但顯著(P<0.05)低于其余品種，4010平均發(fā)芽時間最長，為8.25 d(表3)。4 ℃時，龍牧801平均發(fā)芽時間最短，為10.09 d，與SG401、SG402、SG403、金皇后等12個品種差異不顯著，但顯著(P<0.05)低于其余品種，中苜1號發(fā)芽時間最長，為13.51 d(表3)。

表3 紫花苜蓿各品種苗長、平均發(fā)芽時間和同步指數(shù)

隨著溫度的降低，20個紫花苜蓿品種的平均發(fā)芽時間均顯著(P<0.05)增加，20 ℃時的平均發(fā)芽時間最短，4 ℃最長，3個溫度間差異顯著(P<0.05)。相對于20 ℃，8 ℃時的平均發(fā)芽時間增加了32%，4 ℃時的平均發(fā)芽時間增加了109%。

2.1.8 同步指數(shù) 20 ℃時，WL525同步指數(shù)最低，為0.0991，與巨能418Q、巨能CR、4010、巨能耐濕等8個品種差異不顯著(P>0.05)，但顯著(P<0.05)低于其余參試品種，SG402同步指數(shù)最高，達0.1057(表3)。8 ℃時，SG403同步指數(shù)最低，為0.1408，與SG402、巨能418Q、巨能耐濕、巨能耐鹽等10個品種差異不顯著，但顯著(P<0.05)低于其余參試品種，4010同步指數(shù)最高，達0.1973(表3)。4 ℃時，龍牧801同步指數(shù)最低，為0.0521，與肇東、中草3號等5個品種差異不顯著，但顯著低于其余參試品種，巨能418Q同步指數(shù)最高，達0.2116(表3)。

同一品種在不同溫度下的同步指數(shù)存在差異，20與8 ℃條件下除肇東與龍牧806差異不顯著，其余參試品種均差異顯著(P<0.05)；金皇后、中草3號、4020MF、巨能耐鹽等4個品種在8 ℃時的同步指數(shù)顯著高于20和4 ℃，且20和4 ℃的同步指數(shù)差異不顯著。

2.2 相關性分析

8 ℃時，除相對發(fā)芽勢與相對苗長顯著(P<0.05)相關外，其余各指標之間均極顯著(P<0.01)相關(表4)，其中，相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)、相對苗長等5個指標間均呈極顯著(P<0.05)正相關，并與相對發(fā)芽時間和相對同步指數(shù)呈極顯著(P<0.01)負相關。4 ℃時，相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)、相對苗長之間呈極顯著(P<0.01)正相關，并與相對發(fā)芽時間呈顯著(P<0.05)負相關。相對發(fā)芽勢與相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)呈顯著正相關(P<0.05)，與相對平均發(fā)芽時間呈顯著負相關(P<0.05)。

表4 各相對發(fā)芽指標相關分析

2.3 紫花苜蓿發(fā)芽期抗寒性綜合評價

根據(jù)發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間、苗長等6個發(fā)芽指標綜合評價各紫花苜蓿品種在低溫下的發(fā)芽表現(xiàn)。8 ℃時，巨能418Q、SG403、巨能耐濕、中苜3號、4020MF、SG402等6個品種的總得分為50以上(表5)。4 ℃時，巨能耐鹽得分最高，為57分(表6)。

表5 8 ℃下各紫花苜蓿品種抗寒性綜合評價

表6 4 ℃下各紫花苜蓿品種牧草抗寒性綜合評價

3 討論

低溫作為一種主要的環(huán)境脅迫因子，不僅限制植物地理分布，而且嚴重影響植物生長發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量。本研究結(jié)果表明，紫花苜蓿種子萌發(fā)期的活力隨著溫度的降低而降低，其表現(xiàn)為各紫花苜蓿品種的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的降低以及苗長的縮短；同時，其萌發(fā)一致性也隨著溫度的降低而降低，表現(xiàn)為發(fā)芽勢降低，發(fā)芽時間延長。萌發(fā)期種子活力以及發(fā)芽一致性的降低可能是因為低溫打破了原有的代謝平衡，破壞生物體酶系統(tǒng)，使植物體內(nèi)代謝紊亂，有毒物質(zhì)累積，從而影響植物生長發(fā)育[14]。

低溫脅迫顯著延長種子萌發(fā)時間。本試驗結(jié)果表明，在20、8、4 ℃下，多數(shù)紫花苜蓿品種分別在第1、3、7天開始萌發(fā)。這可能是因為低溫會降低種子的吸水速率，從而導致吸水后的種子代謝速率減慢，甚至擾亂代謝修復，影響有機物代謝與運輸，降低與種子萌發(fā)相關的酶活性，造成吸脹冷害，使胚根突出時間延長，最終導致發(fā)芽遲緩[15-18]。且有研究表明，溫度的變化會影響植物對水分和養(yǎng)分的吸收[19-20]，間接影響植物的生長和生物量的積累[21]。

以往研究表明，15～25 ℃為紫花苜蓿最佳發(fā)芽溫度[22-24]。Twain等[22]在研究溫度對豆科植物發(fā)芽影響時指出，大豆等暖季型植物最適發(fā)芽溫度為25 ℃，紫花苜蓿等冷季型植物的最適發(fā)芽溫度為20 ℃。沈忱等[23]研究6個紫花苜蓿品種在5～40 ℃下的發(fā)芽表現(xiàn)時，得到，5～25 ℃時，各品種均具有較高的發(fā)芽率，在25 ℃時發(fā)芽速率均顯著高于其他溫度；30 ℃時，各品種發(fā)芽率開始降低，胚根長度顯著變短。本研究中，相比4和8 ℃，20個紫花苜蓿品種在20 ℃的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗長等發(fā)芽活力特征上均表現(xiàn)了顯著的優(yōu)勢。

作物通過多種代謝途徑應答低溫脅迫，表現(xiàn)出復雜的耐寒機理，應綜合考慮多種指標對耐寒性的作用，即選取多個指標共同評價作物耐低溫性，以合理有效地區(qū)分不同基因型間的耐低溫性。關于作物耐寒性的評價方法很多，常用的有聚類分析、主成分分析、灰色關聯(lián)度、平均隸屬函數(shù)法等[25]。在評價植物其他抗逆性表現(xiàn)時，打分法也是一種綜合評價方法。吐爾遜娜依等[13]選取活力指數(shù)、質(zhì)膜相對透性、丙二醛含量、相對生長速度以及相對含水量5種指標對8種牧草的耐鹽性進行打分；呂亞慈等[26]則選取發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長、苗長5個指標對6種燕麥耐鹽性進行打分；羅志娜等[27]使用發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長和苗長等4個指標對24個燕麥品種的耐鹽性進行評價。本研究中，相關性分析表明，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗長等指標兩兩之間均極顯著(P<0.01)正相關，發(fā)芽勢與以上4個指標均極顯著(P<0.01)正相關，低溫脅迫下的發(fā)芽時間與代表種子活力的4個指標以及發(fā)芽勢之間均顯著(P<0.05)負相關，這說明種子萌發(fā)活力與發(fā)芽一致性之間存在一定的聯(lián)系。本研究采用打分法對紫花苜蓿在低溫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時間、苗長等6個發(fā)芽指標綜合評價各紫花苜蓿品種在低溫下的發(fā)芽表現(xiàn)，得出巨能418Q、SG403、巨能耐濕、中苜3號、4020MF、SG402和巨能耐鹽等品種在低溫下的發(fā)芽表現(xiàn)較好。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，隨著溫度的降低，紫花苜蓿的發(fā)芽活力以及發(fā)芽一致性均逐漸降低，表現(xiàn)為不同品種紫花苜蓿的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗長的降低以及平均發(fā)芽時間的延長。在我國北方播種紫花苜蓿時，氣溫較低的區(qū)域可考慮巨能418Q、SG403、巨能耐濕、中苜3號、4020MF、SG402以及巨能耐鹽等7個品種。