普通菜豆種質資源苗期抗旱性綜合評價

李 潔 張小寧 晉凡生 韓彥龍 李海金

(山西農業(yè)大學 山西有機旱作農業(yè)研究院/有機旱作山西省重點實驗室, 山西 太原 030000)

普通菜豆(PhaseolusvulgarisL.)又稱蕓豆，屬豆科(Leguminosae)菜豆屬(Phaseolus)，是我國主要雜糧作物之一，其籽粒營養(yǎng)豐富，具有藥用價值，既是傳統(tǒng)食糧，又是現(xiàn)代重要的保健品，頗受人們青睞，市場發(fā)展前景廣闊，出口潛力巨大[1-2]。普通菜豆具有生長周期短，適應范圍廣，耐旱耐瘠、易于種植管理等優(yōu)點，主要分布在北方和西南高寒冷涼地區(qū)。這些地區(qū)大多自然降雨量小，基礎設施差，無灌溉條件，導致干旱成為普通菜豆生產的主要限制因子。因此，研究建立普通菜豆苗期抗旱性鑒定方法，用以篩選、發(fā)掘抗旱種質資源，對普通菜豆的抗旱性遺傳改良、抗旱品種的選育具有重要意義。

國內外學者在各種作物的各個生育時期，針對作物抗旱性鑒定及抗旱指標篩選，開展了大量研究[3-6]。在普通菜豆方面，李龍等[7]利用灰色關聯(lián)度理論進行苗期的抗旱性指標篩選，通過加權抗旱指數(shù)和抗旱度量值進行抗旱性綜合評價，并通過聚類分析將50份普通菜豆參試材料分為高抗、中抗、敏感和高敏感4個等級；暢建武[8]采用蔗糖高滲溶液對615份菜豆資源進行鑒定，篩選出14份高度抗旱資源；曾輝等[9]通過隸屬函數(shù)法和灰色關聯(lián)分析法對30份普通菜豆進行抗旱姓綜合評價，鑒定出F1863、F2973、F3992和F3057 4個抗旱性較強的菜豆品種；Rao等[10]通過籽粒收獲指數(shù)篩選出SER16、SER5和SEA5這3種抗旱材料。目前，大量研究都是對作物某一時期的指標進行篩選，然后用隸屬函數(shù)值或抗旱度量值進行綜合評價，這種方法比以前僅用某一指標評價作物抗旱性，在可靠性上有了很大的提高，但是作物各個時期的抗旱性鑒定的結果差異仍然較大[11-13]。因此，研究普通菜豆某一時期新的抗旱性評價方法，有利于提高對普通菜豆抗旱種質資源鑒定的準確性。鑒于此，本研究選取50份普通菜豆材料，在苗期時測定干旱脅迫及復水后菜豆的各項生長及生理指標，并將干旱脅迫下的各項指標和復水后的各項指標分別進行綜合評價，將兩者綜合評價的結果進行比較，以期為更準確地篩選和鑒定出抗旱能力強的種質資源，為普通菜豆抗旱種質資源鑒定提供方法及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用不同抗旱性的普通菜豆材料共50份，所有種子均由山西省農業(yè)科學院品種資源所提供，其中引進法國品種2份、黑龍江省品種3份、山西省品種24份、陜西省品種16份、內蒙古自治區(qū)品種1份、貴州省品種1份、河北省品種1份、北京市品種2份。具體品種名稱、來源等信息見表1。

1.2 試驗設計

試驗于2018年5月20日—7月5日在山西省農業(yè)科學院旱地農業(yè)研究中心旱棚進行，采用盆栽法，選用20 cm(盆口直徑)×20 cm(高)×18 cm(盆底直徑)的塑料盆作為試驗用盆，盆土用育苗土與蛭石按1∶1等量混合，每盆裝土10 kg，5月20日播種，播前澆水，使盆土達到最大持水量，每個品種種植6盆，每盆播種6穴，每穴2粒，播后覆土1 kg。出苗后進行間苗，每盆保留均勻生長的幼苗6株，正常供水，使其正常生長，待幼苗長至第1個三出復葉完全展開時(6月5日)進行干旱脅迫處理，將材料分成2組，一組繼續(xù)正常供水，作為對照(CK)；另一組停止供水，進行自然干旱處理。待40%左右的材料出現(xiàn)嚴重水分脅迫癥狀時(6月17日，斷水12 d)，取樣測定各項指標[14]。然后進行復水，使盆土達到最大持水量，復水3 d后再進行取樣測定相關指標。

1.3 測定項目與方法

株高用直尺直接測量；葉片相對含水量(relative water content, RWC)參照孫群等[15]的方法，采用烘干稱重法測定；葉綠素相對含量參照汪明華等[16]的方法，利用SPAD-502葉綠素儀(柯尼卡美能達，日本)測定，每株選擇3片上層三出復葉的中間葉片測定葉綠素相對含量；生理指標參照孫群等[15]植物生理學研究技術的方法進行測定：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用氮藍四唑光還原法檢測；過氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定；丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定。以上指標均重復3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行整理分析，用DPS 18.10對試驗數(shù)據(jù)進行相關分析、主成分分析、聚類分析及逐步回歸分析。參照劉海卿等[17]、汪燦等[12,18-19]、張彥軍等[20]的方法分別計算各單項指標的抗旱系數(shù)(drought resistance coefficient, DC)、綜合指標隸屬函數(shù)值[subordinative function value,μ(xi)]和抗旱性度量值(drought resistance comprehensive evaluation value,D)。計算公式如下：

DC=處理測定值/對照測定值

(1)

負向指標的抗旱系數(shù)DC=-處理測定值/對照測定值

(2)

(3)

由公式(3)計算各綜合指標的隸屬函數(shù)值，式中，xi、ximin和ximax分別表示第i個綜合指標及第i個綜合指標的最小值和最大值。

(4)

(5)

分別按公式(4)和(5)計算各綜合指標的因子權重(ωi)和抗旱性度量值(D)。式中，ωi表示第i個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度；pi為第i個綜合指標的貢獻率。

2 結果與分析

2.1 各單項指標的抗旱系數(shù)分析

與對照相比，供試材料在干旱脅迫處理和復水后，各指標均發(fā)生了不同程度的變化(表2、3)。干旱脅迫后，葉片MDA含量和SOD、POD活性的抗旱系數(shù)平均值的絕對值均大于1，說明水分脅迫后，葉片MDA含量和SOD、POD活性均升高，絕對值越大，升高幅度越大；復水3 d后，葉片MDA含量和SOD、POD活性的抗旱系數(shù)平均值與干旱脅迫下的數(shù)值相比，都有不同程度地下降。由此可見，植物受到脅迫后，SOD、POD活性升高用以幫助植物清除氧自由基，且抗氧化物酶活性越高，植物抗旱性越強；MDA含量為負向指標能夠體現(xiàn)出葉片膜脂過氧化的程度，含量越高，抗旱性越弱，復水后，含量降低的幅度越大，抗旱性越強。

表1 試驗材料Table 1 Material list

干旱脅迫后，相對葉綠素含量、相對含水量和株高的抗旱系數(shù)平均值小于1，說明水分脅迫后，相對葉綠素含量、相對含水量和株高降低；復水3 d后，相對葉綠素含量的抗旱系數(shù)平均值小于干旱脅迫下的數(shù)值，相對含水量抗旱系數(shù)平均值大于干旱脅迫下的數(shù)值，說明復水后，相對葉綠素含量繼續(xù)降低，相對含水量則升高。由此可知，在水分脅迫下，葉綠素大量降解，使光合作用降低，復水后，相對葉綠素含量繼續(xù)降低，這可能與復水的時間長短有關，即時間過短，不能使相對葉綠素含量迅速恢復。相對含水量在干旱脅迫和復水中能夠體現(xiàn)出植物的保水能力和恢復能力，干旱脅迫后，相對含水量降低，說明植物出現(xiàn)了萎蔫的情況，降幅越大，植物萎蔫的程度越嚴重，復水后，相對含水量升高，說明植物的萎蔫情況得到了緩解，升幅越大，植物的恢復能力越強，抗旱性隨之越強。

由此可見，普通菜豆的各單項指標的變化和變化幅度不完全相同，很難用單一指標說明材料的抗旱性，因此需要利用多個指標通過綜合分析的方法進行評價。

表2 斷水12 d后各單項指標的抗旱系數(shù)Table 2 Drought resistance coefficients of single index after 12 days without water supply

表3 復水3 d后各單項指標的抗旱系數(shù)Table 3 Drought resistance coefficients of single index after rewatering for 3 days

2.2 抗旱性綜合評價

2.2.1 主成分分析 利用DPS 18.1軟件分別對水分脅迫和復水后的單項指標的抗旱系數(shù)進行主成分分析(表4、5)，水分脅迫和復水后的前4個綜合評價指標的貢獻率分別為26.443%、23.125%、18.283%、12.551%和29.533%、27.854%、17.992%、13.399%，累計貢獻率分別達到80.402%和88.778%，特征值的累計貢獻率均超過了80%，因此前4個因子足以反應該數(shù)據(jù)的絕大部分信息，分別用F1、F2、F3、F4和F1′、F2′、F3′、F4′來表示。在F1中脅迫后的POD活性有較高的載荷量，在F2中脅迫后的MDA含量有較高的載荷量，在F3中脅迫后的株高有較高的載荷量，F(xiàn)4中脅迫后的SOD活性有較高的載荷量；在F1′中復水后的葉綠素含量有較高的載荷量，在F2′中復水后的SOD活性有較高的載荷量，在F3′中復水后的MDA含量有較高的載荷量，在F4′中復水后的相對含水量有較高的載荷量。

表4 斷水12 d后各綜合指標載荷矩陣及貢獻率Table 4 Component matrix and cumulative contribute rate after 12 days without water supply

2.2.2D值及綜合評價 根據(jù)公式(2)(3)(4)可以得出各供試材料脅迫和復水后的抗旱性度量值D值(表6)，兩者的D值分別介于0.215～0.778 和0.168～0.831，平均值分別為0.656 和0.617，變異系數(shù)分別為19.5%和21.4%，根據(jù)各自的D值對供試材料進行排序，結果表明，兩種方法對供試材料的抗旱性排序雖然不完全相同，但是相同率很高，例如干旱脅迫下的D值排序前10的材料，分別在復水后D值的排序中排名第8、第29、第10、第4、第12、第3、第9、第5、第17、第11位。

表5 復水3 d后各綜合指標載荷矩陣及貢獻率Table 5 Component matrix and cumulative contribute rate after rewatering for 3 days

2.2.3 聚類分析及抗旱級別劃分 采用歐式距離可變類平均法對50個供試材料的D值進行系統(tǒng)聚類(圖1)，當距離約在0.4和0.6處時，可將50個供試材料的脅迫和復水的抗旱性聚為3類，分別為高抗、中抗和低抗。由表7可知，在脅迫12 d后的聚類結果中，篩選出高抗材料34份，占總數(shù)的68%；中抗材料9份，占總數(shù)的18%；低抗材料7份，占總數(shù)的14%。在復水3 d后的聚類結果中高抗材料、中抗材料和低抗材料分別為11、37和2份，分別占總數(shù)的22%、74%和4%。其中，復水3 d后篩選出的10份高抗材料和2份低抗材料與脅迫12 d后篩選出高抗材料和低抗材料完全相同；脅迫12 d后篩選出的9份中抗材料中的8份與復水3 d后篩選出的中抗材料完全相同；脅迫12 d后篩選出的其余24份高抗材料、其余5份低抗和1份中抗材料分別歸于復水3 d后的中抗和高抗材料中。從各個材料在脅迫和復水過程中的生理指標的變化來看，兩種方法篩選出的完全相同的10份高抗材料，在受到脅迫時，葉片細胞膜脂過氧化作用較輕，SOD活性和POD活性迅速升高，復水后，MDA含量降幅較大，葉片細胞膜損害受到修復的程度更深，質膜透性減小；C33安播和C24紅豆這兩份材料在受到脅迫時，葉片細胞膜脂過氧化作用嚴重，SOD活性和POD活性升高較小，復水后，MDA含量降幅較小，葉片細胞膜損害受到修復的程度較低，表現(xiàn)出較弱的抗旱性；兩種方法篩選出相同的8份中抗材料的抗旱表現(xiàn)則介于高抗和低抗之間。

表6 供試材料抗旱性評價的D值Table 6 D value of drought resistance evaluation in tested Materials

表6(續(xù))

圖1 基于D值的供試材料抗旱性系統(tǒng)聚類圖Fig.1 Fuzzy clustering dendrogram of drought resistance in tested materials based on D value

表7 供試材料抗旱性的聚類分析結果Table 7 Cluster analysis for the drought resistance of tested Materials

表7(續(xù))

2.3 抗旱指標篩選

以斷水12 d后和復水3 d后的D值為因變量，以兩者各個指標的抗旱系數(shù)為自變量分別進行逐步回歸分析，得到各自的回歸方程，兩個回歸方程的決定系數(shù)分別為R2=0.999 和R2=0.998，P=0.000 1達極顯著水平(表8)，說明上述回歸方程擬合度好，可以用于普通菜豆苗期的抗旱性評價。由兩個回歸方程可知，斷水12 d后的SOD活性、MDA含量、POD活性、相對含水量、株高和復水3 d后的 SOD活性、MDA含量、相對葉綠素含量、相對含水量對普通菜豆苗期抗旱性有顯著影響，可作為普通菜豆苗期抗旱性鑒定的指標。由表9、10可知，斷水12 d后SOD活性(x1)、POD活性(x3)和復水3 d后相對葉綠素含量(x′3)、相對含水量(x′4)與各自D值呈顯著相關性；斷水12 d后MDA含量(x2)和復水3 d后MDA含量(x′2)與各自D值呈極顯著相關性。說明斷水12 d后MDA含量(x2)和復水3 d后MDA含量(x′2)對各自D值的直接作用大于間接作用總和，兩者對各自D值起主要作用，而其余指標對各自D值的貢獻主要是通過斷水12 d后MDA含量(x2)和復水3 d后MDA含量(x′2)間接實現(xiàn)的。

表8 供試材料抗旱性模型預測Table 8 Model predict of drought resistance in tested Materials

3 討論

3.1 干旱脅迫和復水對普通菜豆苗期形態(tài)及生理特性的影響

普通菜豆大多生長在自然環(huán)境惡劣、土地貧瘠的干旱冷涼區(qū)，在長期的生長過程中形成了復雜的抗逆生理機制。張美俊等[21]研究表明，逆境可導致植株的形態(tài)和生理生化指標發(fā)生改變。本研究表明，在干旱脅迫下，與對照相比，植株株高普遍變矮，相對葉綠素含量和相對含水量下降，葉片MDA含量和SOD、POD活性升高，且抗旱性越強的品種株高和相對含水量下降越少，SOD活性和POD活性升高得越多，MDA積累得越少。Turkan等[22]研究指出，耐旱品種的脯氨酸積累量、SOD活性、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性均高于敏感品種，并且能保持更高的氣孔導度，耐旱品種通過保持較高的抗氧化酶活性，從而減弱活性氧對機體的損傷。邵惠芳[23]等通過研究豫煙10號和豫煙12號兩種煙草幼苗葉片在不同干旱脅迫下生理指標發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下仍保持較強的抗氧化酶活性是豫煙12號耐旱的主要生理原因。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在苗期，抗旱性強的品種在水分虧缺的狀態(tài)下，通過維持地上部一定的營養(yǎng)生長，為生殖生長提供堅實的基礎；同時抗旱性強的品種可以維持較高的葉片保水能力和SOD、POD活性，從而較好地保持自身葉片的水分平衡，快速清除干旱脅迫環(huán)境下產生的有害成分，減輕MDA積累對植株的傷害，以保證植株在干旱環(huán)境下能夠更好地生長。

表9 斷水12 d后各指標與D值的通徑分析Table 9 Path analysis of single index and Dvalue after 12 days without water supply

表10 復水3 d后各指標與D值的通徑分析Table 10 Path analysis of single index and D value after rewatering for 3 days

復水后，植株恢復的快慢和程度與品種的抗旱性關系緊密。徐穎等[24]通過對13個類型盆栽海棠的干旱及復水后的葉片凈光合速率(net photosynthesis rate, Pn)，蒸騰速率(transpiration rate, Tr)及水分利用效率(water use efficiency, WUE)進行研究，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下維持高水平的Pn和WUE以及復水后能夠很快恢復甚至超過原初狀態(tài)的點種更有利于適應干旱。本試驗通過研究復水3 d后不同品種生理指標的變化來說明復水后植物的表現(xiàn)與抗旱性的關系，結果表明，與干旱脅迫相比，復水后MDA含量均有不同程度地下降，相對含水量有小幅度上升，抗旱性強的品種在復水后SOD活性、POD活性和葉片相對含水量能維持較高水平且MDA含量大幅度降低。由此可知，復水后植物各個生理指標的變化與植物的抗旱性關系很緊密，將植物復水后的生理指標與干旱脅迫后的生理指標進行兩相比較，可以更科學準確地鑒定植物的抗旱性。

3.2 普通菜豆苗期抗旱性評價方法的選擇

目前，前人對多種作物不同生育時期的抗旱性鑒定都采用了隸屬函數(shù)法、主成分分析法和D值等綜合評價方法[25-27]。路之娟等[28]采用D值評價不同基因型苦蕎的耐旱能力，并將參試品種劃分為耐旱型、中間型和不耐旱型，鑒定結果較為理想。汪燦等[19]以D值、綜合抗旱系數(shù)(comprehensive drought resistance coefficient, CDC)、加權抗旱系數(shù)(weight drought resisitance coefficient, WDC)為標準對參試材料進行抗旱性排序，結果基本相同，但只有基于D值的聚類分析結果與各材料在田間的實際抗旱表現(xiàn)更接近，且與產量的相關性最為密切。D值是一個無量綱的純數(shù)，使得不同品種間的抗旱性差異具有可比性，是一種比較可靠的評價方法[29]。本試驗分別對干旱脅迫和復水的D值進行聚類，根據(jù)聚類結果分別對從試材料進行抗旱級別分類，可分為高抗、中抗和低抗3類，兩者總體分類結果的一致率(劃分在相同級別)達到40%，鄰級率(劃分在相鄰級別)為60%，未出現(xiàn)跨級的材料，由此說明這兩種研究方法的一致性很好。尤其是在高抗和低抗的品種分類中，復水后篩選出的品種與干旱脅迫后篩選出的品種重疊部分分別達到了90%和100%，進一步說明了復水后的抗旱性在普通菜豆苗期抗旱性綜合評價中的驗證補充作用。本研究將復水后普通菜豆的抗旱性引入到普通菜豆苗期綜合抗旱性的評價中，改變了以往在苗期抗旱性鑒定中只依靠干旱脅迫后的指標綜合評價的單一性，這兩種研究方法的結合使得鑒定結果更加科學和準確。

3.3 普通菜豆苗期抗旱性鑒定指標的篩選

作物的抗旱性很復雜，是眾多因素和多種機制共同作用的結果，不同作物在不同時期的抗旱機制也不同[30-33]。對普通菜豆苗期的抗旱性進行鑒定，指標的合理選擇尤為重要。國內外學者在不同作物苗期的抗旱性鑒定方面做了大量的工作，發(fā)現(xiàn)多種性狀和指標都與抗旱性有關。例如，趙利等[34]采用苗期反復干旱法，對16份胡麻品種進行苗期抗旱性鑒定，發(fā)現(xiàn)根冠比和反復干旱成活率可作為胡麻苗期抗旱性鑒定的指標；Munoz-Perea等[35]在干旱脅迫和非脅迫環(huán)境下，對6個中粒普通菜豆品種進行評價，發(fā)現(xiàn)水分利用效率在這些品種中差異顯著；Lizana等[36]在智利和玻利維亞的不同地點測定了24個菜豆品種的產量和光合特性，發(fā)現(xiàn)耐旱品種在氣孔導度、光合速率等方面表現(xiàn)出極大的可塑性；李龍等[7]根據(jù)各性狀指標與綜合抗旱指數(shù)的關聯(lián)度篩選出葉片相對含水量、相對葉綠素含量及PSⅡ最大量子產量3個與抗旱性關系最為密切的指標，認為在普通菜豆苗期抗旱性鑒定中應注重葉片生理指標的選用。本研究選取斷水12 d后和復水3 d后的形態(tài)和生理指標，發(fā)現(xiàn)這些指標與普通菜豆的抗旱性都有不同程度的相關性。通過逐步回歸分析及進一步的通徑分析得到與D值顯著相關的指標有斷水12 d后的SOD活性、MDA含量、POD活性、相對含水量、株高和復水3 d后的SOD活性、MDA含量、葉綠素含量、相對含水量，且兩者的MDA含量與各自D值呈極顯著相關性。由此可見，普通菜豆苗期的抗旱性鑒定中生理指標的測定尤為重要，尤其是干旱脅迫和復水后的MDA含量，可作為普通菜豆苗期抗旱性鑒定的有效評價指標。

本試驗是在盆栽的條件下研究了不同菜豆品種苗期脅迫12 d(重度脅迫)和復水3 d后的抗旱性，而對于菜豆在不同生育期及不同的脅迫程度(輕度脅迫、中度脅迫和重度脅迫)和復水后不同時間(復水1、2和3 d)下各自對抗旱性的影響方面仍有待進一步研究。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，普通菜豆復水后的生理指標與苗期的抗旱性關系緊密，在此基礎上確定了干旱脅迫和復水后兩者D值互相比較驗證的抗旱性綜合評價方法。本試驗還發(fā)現(xiàn)，普通菜豆苗期干旱脅迫和復水后的MDA含量可有效用于普通菜豆資源的抗旱性鑒定中，從而簡化鑒定篩選工作。