劉 勇 肖旦望 秦 藝 陳 靜 陳婉瑜 熊興華,*
(1 湖南農業(yè)大學國家油料改良中心湖南分中心,湖南 長沙 410128;2 湖南農業(yè)大學農學院/湖南省水稻油菜抗病育種重點實驗室, 湖南 長沙 410128)
三酰甘油(triglycerides,TAG)是植物種子中油脂的主要儲藏形式,在生物體內均通過酶促機制合成[1-2]。溶血磷脂酸酰基轉移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT)是TAG生物合成的重要限速酶,在植物油脂合成、種子發(fā)育以及生物膜形成等方面有重大作用[3-5]。脂肪酸在植物種子中主要以TAG的形式存在,是構成植物油脂的主要成分,并參與植物多數代謝反應[6-8]。菜籽油中富含人體所需的多種長鏈多不飽和脂肪酸,營養(yǎng)價值可與橄欖油(Olea)媲美[9-10]。LPAT基因具有調控Kennedy途徑中的長鏈多不飽和脂肪酸裝配TAG的sn-2位上的功能[11-13]。尹永泰[14]通過同源克隆甘藍型油菜BnaLPATs基因并進行亞細胞定位發(fā)現,BnaLPAT1基因定位于葉綠體,屬于質體型LPAT,其他拷貝均定位于內質網,屬于微粒體型LPAT,并對LPAT基因功能進行了初步鑒定。肖旦望等[15]通過GUS基因染色法(B-Glucuronidase)確定了BnaLPAT4基因主要在油菜花器官和角果中表達,推測BnaLPAT4基因具有調控油菜油脂合成的功能。為驗證BnaLPAT4基因對甘藍型油菜油脂合成的影響,提高油菜種子油脂含量,本試驗通過參考洪波等[16]的方法構建BnaLPAT4表達載體轉化酵母和擬南芥,并通過氣相色譜法檢測轉基因株中的脂肪酸組分,分析BnaLPAT4基因在油菜油脂合成的作用,旨在為指導油菜育種提供一定的理論基礎。
1.1.1 植物材料及菌株 野生型擬南芥(哥倫比亞型)和釀酒酵母菌株(INVSC 1)均由湖南農業(yè)大學油料作物研究所提供;甘藍型油菜湘油15、野生型擬南芥由湖南省水稻油菜重點實驗室提供。INVSC 1酵母菌株和YES2.0表達質粒、過表達載體pBI121(napin)-LPAT4的構建均由湖南農業(yè)大學重點實驗室完成。
1.1.2 試劑材料 質粒提取試劑盒購自上海生工生物股份有限公司;酵母轉化試劑盒購自上海懋康生物有限公司;引物由湖南擎科生物公司設計;其他試劑均為分析純。
1.2.1 擬南芥總RNA提取及cDNA合成 取光照培養(yǎng)箱內生長的擬南芥種子50~100 mg置于2.0 mL離心管中,加入鋼珠和液氮后于磨樣機中充分研磨,參照北京全式金生物公司植物總RNA提取試劑盒(TransZol Up Plus RNA Kit)說明書提取擬南芥種子總RNA。以擬南芥種子總RNA為模板,通過北京百邁客生物公司反轉錄試劑盒(BiomarkerScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA第一鏈。逆轉錄反應體系20 μL:RNA模板2 μL, d(T)23VN(50 μmol·L-1) 2 μL, 10 mmol·L-1dNTPs 1 μL, ddH2O 3 μL, BiomarkerScript Ⅱ Reaction Mix (2X)10 μL,BiomarkerScript Ⅱ Reaction Mix (10X)2 μL,將上述試劑混合均勻后置于離心機上8 000 r·min-1離心15 s。反應程序:42℃孵育1 h;80℃加熱5 min使酶失活; -20℃ 保存。逆轉錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)反應體系10 μL:cDNA 1 μL, 2×Tap Plus Master Mix Ⅱ 5 μL,正反引物各0.4 μL,ddH2O 3.2 μL。反應程序;95℃預變性3 min,95℃變性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸20 s,30~35個循環(huán);72℃終延伸7 min,4℃保存。
1.2.2 YES2.0表達載體的構建 甘藍型油菜BnaLPAT4基因的基因編碼序列(coding sequence,CDS)來源于Enesembl plants(http://plants. Ensembl. org/index. html)數據庫。CTAB法提取甘藍型油菜湘油15號葉片DNA,通過Primer 5.0軟件設計BnaLPAT4基因克隆引物。在2個基因上游引物5′處添加SacI(GAGCTC)和保護堿基(C),下游引物5′處添加EcoRI(GAATTC)和保護堿基(G),引物設計如表1所示。PCR反應體系為20 μL:cDNA模板1 μL,Tap Polymerase 高保真酶0.5 μL,上下游引物各 1 μL, 2.5 mmol·L-1dNTP 2 μL,10×Buffer 2 μL,ddH2O 12.5 μL。PCR反應程序;95℃預變性3 min;95℃變性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸90 s,33個循環(huán);終延伸15 min。取上述反應產物4 μL于1%瓊脂糖凝膠中進行檢測,使用SacI和EcoRI兩種內切酶對回收產物片段和YES2.0表達載體分別進行雙酶切。體系為10 μL:10× buffer 1 μL,PCR產物5 μL,Sac I酶0.2 μL,EcoRI酶0.2 μL,ddH2O 3.6 μL。37℃條件下反應過夜,回收酶切片段后,連接至YES2.0載體中。反應體系10 μL:酶切產物2.5 μL,T4 ligease 0.5 μL,載體1 μL,10×buffer 2 μL,ddH2O 4 μL。置于恒溫箱中16℃過夜培養(yǎng)。將連接產物轉化至大腸桿菌(DH5α)后平板培養(yǎng),挑選PCR檢測為陽性的菌落繼續(xù)進行無菌恒溫培養(yǎng),通過質粒提取成功獲得pGAL::BnaLPAT4-1和pGAL::BnaLPAT4-2陽性質粒。
表1 PCR引物Table 1 PCR primers
1.2.3 轉化酵母菌INVSC1 通過醋酸鋰法(PEG/LiAC)將已構建成功的pGAL::BnaLPAT4-1和pGAL::BnLPAT4-2表達載體及不含目的基因的YES2.0表達載體分別轉入工程菌株INVSC1內,接種于SD-Ura培養(yǎng)基上進行篩選,獲得含有目的基因YES2.0載體及空白YES2.0載體的工程菌株。
1.2.4 PBI121表達載體的構建 根據BnaLPAT4基因的CDS序列設計引物(表1),在2個基因上游引物5′處添加BamHI(GGATCC)和保護堿基(CGC),下游引物5′處添加SacI(GAGTC)保護堿基(C)。成功克隆BnLPAT4-1和BnLPAT4-2基因后,通過內切酶SacI和BamHI對目的產物和pBI121質粒進行酶切。經T4酶連接后成功構建表達載體BnaLPAT4-1::pNapin和BnaLPAT4-2::pNapin,并將構建好的表達載體轉化大腸桿菌(DH5a)內。轉化方法:解凍感受態(tài)后,加入上述連接產物,冰上放置40 min;水浴鍋內42℃處理90 s;冰盒內放置5 min;分別加入無抗大腸桿菌(Luria-Bertani, LB)液體培養(yǎng)基800 mL,搖床內37℃復蘇1 h;取上述200 μL菌液均勻涂抹至50 mg·L-1Kan抗生素LB固體平板上;37℃條件下倒置過夜培養(yǎng),挑取數個單菌落分別進行菌落PCR檢測,提取質粒,酶切鑒定。
1.2.5 農桿菌介導法轉染擬南芥 農桿菌介導法參考文獻[9],具體步驟略有改變。制備農桿菌GV3101感受態(tài):將1.2.4提取的陽性質粒轉化感受態(tài)細胞中,挑取陽性菌進行菌落PCR檢測。接種農桿菌菌種于農桿菌(Agrobacterium rhizogene Broth Medium, YEB)固體培養(yǎng)基[25 mg·L-1鏈霉素(streptomycin, str)+25 mg·L-1利福平(rifampin, rif)+50 mg·L-1卡那霉素(kanamycin, Kan)],28℃恒溫條件下放置48 h,然后在超凈工作臺上將準備好的農桿菌接種于10 mL含有相應抗性的YEB液體培養(yǎng)基中,置于搖床上震蕩培養(yǎng)24 h;接種上述混合物于75 mL含對應抗生素YEB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD值=1.5,離心收集菌體。浸染液為100 mL體系:蔗糖5 g,Silwett-77 30 μL,蒸餾水定容。野生型擬南芥種子置于4℃條件下低溫春化處理3 d,然后置于光照培養(yǎng)箱內。培養(yǎng)箱參數設置為:溫度24℃,光暗比16∶8,相對濕度75%,擬南芥生長達到盛花期時開始花絮浸染。室溫條件下將擬南芥花序完全浸泡于浸染液中40 s,然后將已浸染的擬南芥套上黑色塑料袋遮光培養(yǎng)1 d,最后放置于光照培養(yǎng)箱內使其正常生長,期間每隔3 d重新浸染1次,每次侵染40 s,共浸染3次(浸染液現配現用)。完成浸染后置于光照培養(yǎng)箱繼續(xù)生長至收獲擬南芥T0代轉基因種子。將收獲的轉基因種子用75%酒精處理3 min后置于3%次氯酸鈉溶液內消毒15 min,無菌水反復清洗4次,均勻鋪種擬南芥種子于含有Kan抗性的1/2MS固體培養(yǎng)基中,待種子發(fā)芽后移栽至栽培基質中,并將其放置在光照培養(yǎng)箱內生長,光照培養(yǎng)箱參數設置同上。待擬南芥轉基因植株開花后嚴格自交授粉,并收獲完全成熟的T1代種子。繼續(xù)按照上述方法培養(yǎng)至收獲轉基因T3代種子。
1.2.6 檢測酵母轉化子和轉擬南芥種子脂肪酸成分 超低溫冰箱內取出酵母轉化子,置于冰上融解為液體狀后均勻涂抹在SD-Ura培養(yǎng)基上,恒溫箱內30℃培養(yǎng)64 h后,將挑選的單菌落懸浮于YPDA培養(yǎng)基中,搖床200 r·min-1培養(yǎng)50 h左右,移至烘箱內烘干水分,徹底研磨至粉末狀。0.05 g上述粉末高溫滅菌后的5 mL離心管內,緩慢加入5%硫酸甲醇3 mL后混勻,將混合液置于85℃水浴鍋內90 min,冷卻至室溫后離心至混合物分層,小心吸取適量上清液于另一干凈的離心管內,用移液槍吸取NaCl、正己烷各2 mL至離心管內,8 000 r·min-1離心5 min,復制上一步驟吸取上清液至干凈離心管內;等量吸取上述上清液和乙醚-石油醚各200 μL后待用。參照氣相色譜儀(Aglient7890,美國安捷倫科技有限公司)使用說明測定酵母轉化子脂肪酸成分,操作方法:調節(jié)起始溫度100℃并保持12 min,15℃·min-1升溫至210℃并保持7 min,1 min內升溫至230℃,分流比100∶1,進口量1.0 μL。每個處理設置3個重復,擬南芥種子脂肪酸測定同上。
2.1.1 YES 2.0表達載體的構建BnLPAT4-1和BnLPAT4-2經PCR擴增后進行膠回收,EcoRI與SacI雙酶切回收的目的基因片段和YES2.0穿梭表達質粒的鑒定結果如圖1所示,得到2條大小約為1 200 bp的條帶。酶切片段及載體經T4連接酶連接得到重組質粒如圖2所示。
2.1.2 表達載體轉化酵母 隨機挑選6個菌落(BnLPAT4-1和BnLPAT4-2各3個)進行PCR擴增,經鑒定均為轉基因陽性菌落,經擴大培養(yǎng)后提取其陽性菌質粒。采用LiAc高效酵母轉化法,將提取的陽性質粒轉入酵母菌INVSC 1中,通過菌落PCR鑒定發(fā)現,PCR產物約為1 200 bp,說明質粒成功轉入酵母菌中,檢測結果如圖3所示。
注:M:Trans 2 000 bp DNA marker;1~2:產物。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1~2: Samples.圖1 酶切BnaLPAT4基因PCR鑒定圖Fig.1 PCR identification of BnaLPAT4 gene by enzyme digestion
注:A:pGAL::BnaLPAT4-1載體; B:pGAL::BnaLPAT4-2載體。Note: A: pGAL::BnzLPAT4-1 carrier. B: pGAL::BnaLPAT4-2 carrier.圖2 pGAL::BnaLPAT4-1和pGAL::BnaLPAT4-2酵母表達載體Fig. 2 pGAL::BnaLPAT4-1 and pGAL::BnaLPAT4-2 of yeast expression vector
注:M: Trans 2 000 bp DNA marker;1:質粒; 2:陰性對照; 3~5: BnLPAT4-1 的單菌落;6~8: BnLPAT4-2的單菌落。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1: Plasmid. 2: Negative control. 3~5: BnLPAT4-1 colonies. 6~8: BnLPAT4-2 colonies.圖3 酵母菌落PCR鑒定Fig.3 Yeast colony PCR identification
2.1.3 酵母脂肪酸組成分析 PEG/LiAc法轉化酵母菌INVSC 1的氣相色譜分析結果如表2所示,檢測發(fā)現,轉BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因酵母轉化子與空酵母轉化子YES 2.0脂肪酸組分之間發(fā)生明顯變化,轉化子間脂肪酸種類和比例出現差異。其中BnaLPAT4-1轉化子脂肪酸種類較對照YES 2.0轉化子特異性生成了亞麻酸(C18:3)和花生酸(C20:0)2種成分,硬脂酸(C18:0)和軟脂酸(C16:0)含量較空轉化子分別提高25.72和5.39個百分點,棕櫚酸(C16:1)、油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)含量分別下降了14.71、21.35和15.24個百分點;BnaLPAT4-2轉化子脂肪酸較對照C16碳鏈脂肪酸含量特異性增加,其中軟脂酸和棕櫚酸含量分別提升了18.67和7.82個百分點,而硬脂酸、油酸和亞油酸含量有不同程度的下降,并且較對照未生成其他種類脂肪酸。
表2 酵母轉化子脂肪酸檢測Table 2 Detection of fatty acids in yeast converters
BnaLPAT4-1轉化子中飽和脂肪酸(軟脂酸和硬脂酸)含量達到YES 2.0轉化子飽和脂肪酸含量的2.60倍,不飽和脂肪酸(棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和花生酸)僅為YES 2.0轉化子的0.58倍。BnaLPAT4-2轉化子中飽和脂肪酸含量達到YES 2.0轉化子的1.61倍,不飽和脂肪酸為YES 2.0轉化子的0.79倍。
2.2.1 表達載體構建及鑒定BamHI與SacI雙酶切目的基因BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2,分別連接表達載體pBI121后PCR擴增檢測結果顯示,試驗成功擴增出2條796 bp的BnaLPAT4基因條帶(圖4),證明成功將克隆的2條BnaLPAT4基因連接至載體pBI121上獲得重組質粒pNapin::BnaLPAT4-1和pNapin::BnaLPAT4-2。將上述重組質粒分別轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,經菌落PCR檢測,取3個陽性菌落搖菌,并提取質粒,可用于后續(xù)試驗。重組質粒如圖5所示。
注:M:Trans 2 000 bp DNA marker;1~3:產物。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1~3: Samples.圖4 酶切BnaLPAT4基因PCR鑒定圖Fig. 4 PCR identification of BnaLPAT4 gene by enzyme digestion
注:A:pNapin::BnaLPAT4-1載體;B:pNapin::BnaLPAT4-2載體。Note: A: pNapin:: BnaLPAT4-1 carrier. B: pNapin::BnaLPAT4-2 carrier.圖5 pNapin::BnaLPAT4-1和pNapin:::BnaLPAT4-2載體構建Fig.5 Construction of pNapin::BnaLPAT4-1 and pNapin::BnalPAT4-2 vectors
2.2.2 農桿菌轉化及陽性株鑒定 農桿菌從超低溫冰箱取出后,將上述重組質粒轉化農桿菌感受態(tài)細胞中,通過PCR檢測表達載體成功轉化農桿菌如圖6所示。將帶有表達載體的農桿菌擴大培養(yǎng)后配置浸染液,采用花絮浸染轉化法,將重組質粒導入擬南芥中。
2.2.3 重組質粒轉化擬南芥分析 農桿菌重組質粒BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2轉化野生型擬南芥(哥倫比亞型)后PCR檢測轉基因陽性株結果如圖7所示。檢測結果表明,重組質粒BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2成功轉化擬南芥中,并獲得Napin啟動子驅動BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因的轉基因陽性擬南芥株。
注:M:Trans 2 000 bp DNA marker;1:陽性質粒;2:陰性對照;3~5:BnaLPAT4-1農桿菌菌落;6~8:BnaLPAT4-2農桿菌菌落。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1: Positive plasmid. 2: Negative control. 3~5: Agrobacterium BnaLPAT4-1 colony. 6~8: Agrobacterium colony BnaLPAT4-2.圖6 農桿菌重組質粒PCR檢測Fig.6 PCR detection of agrobacterium tumefaciens recombinant plasmid
注:M:Trans 2 000 bp DNA marker;1:陽性質粒;2:陰性對照;3~5:轉BnaLPAT4-1擬南芥;6~8:轉BnaLPAT4-2擬南芥。Note: M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1: Positive plasmid. 2: Negative control. 3~5: Transplanting BnaLPAT4-1 Arabidopsis. 6~8: Transfer BnaLPAT4-2 Arabidopsis.圖7 轉基因擬南芥PCR檢測Fig.7 PCR detection of transgenic Arabidopsis thaliana
2.2.4 擬南芥種子脂肪酸組成分析 轉pNapin::BnaLPAT4基因擬南芥RT-PCR結果如圖8所示。轉BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因擬南芥株系擴增產物條帶亮度明顯高于野生型對照,證明轉基因擬南芥中BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因都高于野生型擬南芥,Actin條帶亮度一致。表達量較野生型擬南芥有明顯提升。氣相色譜法檢測擬南芥轉基因BnaLPAT4-1 T3代株系種子脂肪酸組分并較對照材料脂肪酸組分進行比對分析,得到Napin::BnLPAT4-1 T3代種子脂肪酸組分如表3所示。由于擬南芥轉基因BnLPAT4-2株系未收獲正常發(fā)芽種子,無法進行脂肪酸檢測試驗。
由表3可知,轉BnaLPAT4-1擬南芥的3個株系的種子較野生型對照的脂肪酸組分之間存在明顯差異。其中轉BnaLPAT4-1擬南芥株系1、2和3種子中的花生烯酸含量較野生型分別提高了3.57、4.48和3.60個百分點,平均提高3.88個百分點,而轉基因株中花生酸和二十碳二烯酸較野生型對照的含量明顯降低,3個轉基因株花生酸的含量分別降低0.84、0.52和0.78個百分點,平均降低7.20個百分點,二十碳二烯酸含量分別降低0.68、0.96和0.74個百分點,平均降低0.79個百分點。轉基因株種子脂肪酸較野生型對照中的硬脂酸、油酸、亞油酸以及亞麻酸組分的含量與野生型對照無明顯差異,但轉基因株種子脂肪酸中無花生三烯酸和芥酸的產生,由此可得出BnaLPAT4-1基因具有抑制花生三烯酸和芥酸生成且催化花生烯酸生成的功能。
M:Trans 2 000 bp DNA marker;1~2:擬南芥野生型;3~5:轉BnaLPAT4-1擬南芥植株;6~7:轉BnaLPAT4-2擬南芥植株。M: Trans 2 000 bp DNA marker. 1~2 : Arabidopsis wild-type. 3~5: Transforming Arabidopsis thaliana plants with BNLPA 4-1. 6-7: Transforming Arabidopsis thaliana plants with BNLPA 4-2.圖8 擬南芥轉基因BnaLPAT4株系RT-PCR檢測Fig.8 RT-PCR detection of Transgenic BnaLPAT4 strain in Arabidopsis thaliana
表3 擬南芥種子脂肪酸組分Table 3 Arabidopsis thaliana seeds fatty acid component
油菜是我國重要的油料作物之一,對我國油料安全生產有重大意義[17-20]。研究油菜油脂形成機制和發(fā)掘調控油脂合成的相關基因,對提高油菜種子含油量和提升油脂品質具有重要的指導作用[21-23]。研究發(fā)現LPAT基因具有調控植物油脂合成的生物學功能[24-26]。本試驗通過克隆甘藍型油菜湘油15號BnaLPAT4基因,構建表達載體轉化酵母和擬南芥,并采用氣相色譜法檢測發(fā)現,轉基因株脂肪酸組分明顯發(fā)生變化,證明BnaLPAT4基因具有調控油脂合成的生物學功能。同時本研究檢測到BnaLPAT4-1與BnaLPAT4-2轉化子間的脂肪酸組分存在差異,BnaLPAT4-1轉化子生成亞麻酸和花生酸,而BnaLPAT4-2轉化子脂肪酸組分中軟脂酸和棕櫚油酸比例明顯提高,證明BnaLPAT4基因拷貝間在油脂合成的表達模式中存在差異,確定BnaLPAT4基因具有調控植物脂肪酸鏈合成,從而影響植物含油量的功能,這與尹永泰[14]、柏楊等[18]、肖旦望等[27]、丁檢等[28]和陳四龍[29]的研究結果相似。
LPAT酶具有調控脂肪酸鏈裝配在TAG的sn-2位上的功能,對不飽和脂肪酸具有特異選擇性,胡蓉等[30]通過構建BnaLPAT2過表達載體轉化擬南芥,發(fā)現轉基因擬南芥種子亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸有明顯提升,但油酸含量明顯下降。Zhang等[31]通過設計多個sgRNA位點并構建CRISPR/Cas9編輯載體對油菜BnaLPAT2和BnaLPAT5基因多同源拷貝進行定向編輯,發(fā)現編輯油菜種子中含油量較野生型明顯下降,并且種子性狀、大小和千粒重受到明顯的影響。以上試驗驗證了LPATs基因家族具有調控油菜油脂合成的生物學功能。本試驗構建了BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因表達載體轉化酵母,并通過氣相色譜法檢測到酵母轉化子飽和脂肪酸(軟脂酸和硬脂酸)的含量明顯提高。氣相色譜檢測轉BnaLPAT4-1基因植株發(fā)現花生烯酸含量明顯提高,兩種轉基因材料脂肪酸變化結果不一致。本試驗僅在酵母和擬南芥中對BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2基因功能進行了驗證,還需要轉化油菜后驗證BnaLPAT4基因功能。
本研究從甘藍型油菜湘油15號中克隆獲得兩條BnaLPAT4基因,長度分別為1 143、1 140 bp,分別命名為BnaLPAT4-1、BnaLPAT4-2。構建重組質粒分別轉化酵母和擬南芥,并通過氣相色譜法檢測轉基因材料脂肪酸組分發(fā)現,轉基因株脂肪酸組分較野生型對照有明顯變化,從而驗證了BnaLPAT4基因具有調控植物脂肪酸鏈合成,從而影響植物含油量的生物學功能。