紅比利時杜鵑愈傷懸浮顆粒瞬時轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建及植株再生

何 凡 吳月燕 謝曉鴻 楊國霞 蔣寶鑫 李東賓 鄢毅鋮 賈永紅,*

(1 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2 寧波市林場，浙江 寧波 315440)

杜鵑花(Rhododendron)是一種常見的灌木或喬木類園藝觀賞花卉，其形態(tài)多樣、花色繁多、花期較長，廣泛用于環(huán)境綠化和室內(nèi)美化，具有很高的觀賞價值與經(jīng)濟(jì)價值。我國杜鵑花種類豐富，據(jù)統(tǒng)計，目前我國擁有600多種，占世界杜鵑花種類總量的半數(shù)以上[1-2]。但是，我國的杜鵑花多為野生原種，經(jīng)過馴化或改造而適于室內(nèi)栽培的杜鵑花品種較少。目前國內(nèi)市場上大量銷售的杜鵑花園藝栽培品種如比利時、東洋等，多是引自歐洲或日本的品種。同時，由于生態(tài)環(huán)境惡化，局部地區(qū)棲息的野生杜鵑花也面臨生存挑戰(zhàn)[3]。據(jù)《杜鵑花紅色名錄》[4]報告，我國受不同等級威脅的杜鵑花種類有213種，占總數(shù)的32.03%，表明我國杜鵑花的生存狀態(tài)岌岌可危[5]。因此，加強(qiáng)我國杜鵑花遺傳資源保護(hù)與開發(fā)利用研究迫在眉睫。

目前，我國杜鵑花研究主要集中于苗木栽培、雜交育種、生理生化指標(biāo)測定等領(lǐng)域[6]，而在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)闡述、關(guān)鍵功能基因挖掘、遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探索等領(lǐng)域的研究較少，表型發(fā)生分子機(jī)制的解析也需要深入探索。遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)作為開展功能基因組學(xué)、分子育種、生物反應(yīng)器等研究的關(guān)鍵技術(shù)之一，在促進(jìn)基因功能研究領(lǐng)域的深入發(fā)展方面具有重要作用。特別是近年來，瞬時轉(zhuǎn)化體系以其高效、快捷的優(yōu)勢日益被用于開展基因功能驗證及組織定位、基因沉默[7-9]、蛋白互作等研究[10-14]，并在快速重組蛋白生產(chǎn)方面顯示出重要的應(yīng)用價值[15]。

自從Rossi等[16]于1993年在煙草中首次成功建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)以來，該技術(shù)目前已成功應(yīng)用于多種植物，模式植物如擬南芥[17]、番茄[18]，農(nóng)作物如水稻[19]，木本植物如蘋果[20]、板栗[21]，以及草本植物如草莓[22]、苜蓿[23]等。杜鵑花作為一種重要的木本園藝植物，其瞬時轉(zhuǎn)化仍鮮有報道。

紅比利時杜鵑花(Rhododendron×hybridumHort)是皋月杜鵑(Rhododendronindicum)、映山紅(R.simsii)及毛白杜鵑(R.mucronatum)等經(jīng)長期、反復(fù)雜交而育成的一種園藝花卉新品種。該品種花色艷麗、顏色多樣，花期長，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。然而，紅比利時杜鵑花生長緩慢、適應(yīng)性不強(qiáng)，一定程度制約了該品種的廣泛種植。鑒于此，本研究以寧波市地域特色杜鵑花園藝品種紅比利時為研究對象，開展愈傷誘導(dǎo)、愈傷增殖、愈傷懸浮顆粒培養(yǎng)等研究，建立以愈傷懸浮顆粒為受體的農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化體系，并通過植物組織細(xì)胞工程技術(shù)，獲得再生植株，以期為開展包括該品種在內(nèi)的杜鵑花生物學(xué)性狀發(fā)生與調(diào)控、分子育種、基因編輯等理論研究，以及提高杜鵑花經(jīng)濟(jì)附加值的實踐應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及前處理

紅比利時杜鵑花嫩葉取自寧波北侖萬景杜鵑良種園。從多株生長旺盛、無病害的3歲齡杜鵑花頂部分枝采集長(1.0～1.5)cm×寬(0.5～1.0)cm的嫩葉，無菌水沖洗葉片表面浮塵后放入冰盒帶回浙江萬里學(xué)院植物生理與分子改良實驗室，參照何凡等[26]的方法進(jìn)行前處理：少量清潔劑清洗嫩葉表面臟污后將其轉(zhuǎn)入干凈的廣口瓶中并置于自來水細(xì)流下緩慢沖洗30 min左右。之后用無菌鑷子將沖洗完成的嫩葉外植體轉(zhuǎn)移至無菌玻璃瓶中，在滅菌的超凈工作臺上用適量70%酒精浸洗嫩葉約30 s，倒出酒精并用無菌水清洗1次。瀝干無菌水，將0.1%的HgCl2溶液倒入玻璃瓶中消毒嫩葉約5 min，同時輕輕搖晃玻璃瓶，使外植體與HgCl2溶液充分接觸，隨后用無菌水浸泡清洗4～5遍。使用無菌鑷子取出嫩葉放置于滅菌的干燥濾紙上，待水分吸干后，用滅菌剪刀將嫩葉剪成約1 cm2的小塊，用無菌鑷子將小塊嫩葉外植體接種至培養(yǎng)基。

1.2 菌株、試劑與儀器

菌株：大腸桿菌DH5α，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；農(nóng)桿菌GV3101、pCAMBIA1301-CFP，上海唯地生物技術(shù)有限公司；pRI 101-AN，浙江萬里學(xué)院李旭博士后饋贈。

試劑：木本植物培養(yǎng)基(woody plant medium，WPM)、植物組培抗菌劑(plant preservative mixture，PPM)，美國Phytotech公司；噻重氮苯基脲(thidiazuron，TDZ)、6-芐基腺嘌呤(benzyladenine，6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid, NAA)、玉米素(zeatin, ZT)、激動素(kinetin, KT)，北京索萊寶科技有限公司；其余常規(guī)生化試劑均來自寧波奧博生化試劑公司。

主要儀器與設(shè)備：5804R高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德中國有限公司；RZX型智能人工氣候箱，寧波江南儀器有限公司；ZQZY-78BN震蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；LSM980激光共聚焦顯微鏡，德國卡爾蔡司股份公司；DN300雙目生物顯微鏡，寧波永新光學(xué)股份有限公司；超凈工作臺，力康精密科技(上海)有限公司。其余常規(guī)設(shè)備來自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 愈傷誘導(dǎo)的生長調(diào)節(jié)劑組合試驗

以2.41 g·L-1WPM+ 20 g·L-1蔗糖+ 10 g·L-1麥芽糖+ 7.0 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基，以2,4-D的4個濃度(0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1)和TDZ的4個濃度(0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1)按照濃度梯度一一對應(yīng)的方式設(shè)定4個組合，將完成前處理的嫩葉分別接種到4組培養(yǎng)瓶中，每組接30瓶，共120瓶。接種后的培養(yǎng)瓶先在暗箱中培養(yǎng)7 d，然后將其轉(zhuǎn)移到溫度25±2℃、 光照強(qiáng)度1 500 lx、光照16 h/黑暗8 h的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每7 d觀察外植體的形態(tài)變化并及時清理發(fā)生污染、褐化、死亡的組培瓶。49 d后統(tǒng)計外植體的變化情況，以外植體正常愈化的數(shù)量占總接種數(shù)量的比例計算誘導(dǎo)率，依據(jù)試驗結(jié)果確定生長調(diào)節(jié)劑的最優(yōu)濃度組合。

1.4 愈傷增殖的響應(yīng)面試驗

把誘導(dǎo)獲得的愈傷組織切割成小塊，將其接種到繼代培養(yǎng)基中作增殖培養(yǎng)。以2.41 g·L-1WPM + 20 g·L-1蔗糖 + 10 g·L-1麥芽糖 +7.0 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基，借助Expert-Designer 10.0軟件中Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計如下試驗：以2,4-D(mg·L-1，X1)、6-BA(mg·L-1，X2)、TDZ(mg·L-1，X3)為自變量，以培養(yǎng)30 d后愈傷組織鮮重的增加值占最初接種愈傷組織塊鮮重的百分比，即增殖率(%，Y)為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平試驗(表1)，確定繼代培養(yǎng)過程中愈傷組織增長最快的生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)濃度組合。

表1 愈傷組織繼代增殖的Box-Behnken響應(yīng)面法試驗設(shè)計Table 1 Experimental design of Box-Behnken response surface method for callus subculture and proliferation

1.5 愈傷顆粒懸浮培養(yǎng)

在生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)濃度組合條件下，選取繼代培養(yǎng)5～7次的顆粒狀愈傷組織5 g，將其接種到約100 mL液體繼代培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基方案為響應(yīng)面試驗優(yōu)化后的結(jié)果)，在溫度25±2℃、光照強(qiáng)度1 500 lx、光照16 h/黑暗8 h、轉(zhuǎn)速120 r·min-1的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，2～3周后，用40目的無菌細(xì)胞篩濾除大組織塊，將篩選出的愈傷組織小顆粒分作2～3瓶，置于相同液體培養(yǎng)基并在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述步驟，最終獲得批量愈傷顆粒懸浮液。

1.6 愈傷顆粒懸浮液的理化特性測定

在愈傷顆粒懸浮液制備過程中，稱取2 g愈傷懸浮顆粒，接種到40 mL液體培養(yǎng)基中，重復(fù)30瓶，在同樣培養(yǎng)條件下連續(xù)震蕩培養(yǎng)20 d，期間每隔2 d隨機(jī)取出3瓶測定如下指標(biāo)：用pH計測量濾液的pH值；用電導(dǎo)率儀檢測電導(dǎo)率；過濾溶液得到愈傷組織顆粒，將顆粒于60℃烘干2 h，之后稱其干重，依據(jù)接種前后質(zhì)量變化繪制生長曲線。

1.7 GUS染色

采用熱激法將含有GUS(β-葡萄糖苷酸醇，β-glucuronidase)基因的pRI 101-AN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入活化的農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)菌液培養(yǎng)、抗性篩選后，挑取陽性克隆接種于農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(yeast extract beef, YEB)液體培養(yǎng)基中，經(jīng)擴(kuò)增、離心等步驟獲得含有pRI 101-AN的農(nóng)桿菌。對照組選用不含pRI 101-AN質(zhì)粒的活化的農(nóng)桿菌GV3101。用10 mmol·L-1乙-(N-嗎啉)乙磺酸，[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES](pH值5.6)+10 mmol·L-1MgCl2+200 mmol·L-1乙酰丁香酮(acelosyringone, AS)的混合液重懸農(nóng)桿菌，調(diào)節(jié)OD600為0.4、0.6、0.8、1.0，備用。準(zhǔn)備生長狀態(tài)良好的紅比利時杜鵑花愈傷顆粒懸浮液3份，靜置，去上清，將準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌侵染液與愈傷顆?；旌?，分別侵染15、20、30、40 min后，棄上清，在下層顆粒中加入5 mL WPM液體培養(yǎng)基，輕輕混勻后，1 650 r·min-1室溫離心3 min，獲得沉淀物，洗滌重復(fù)3次；將洗滌后的懸浮顆粒接入新的WPM培養(yǎng)液，于30℃避光條件下，130 r·min-1搖床培養(yǎng)1 d，去上清獲得侵染后的愈傷顆粒。將GUS染液與該愈傷顆粒在37℃恒溫條件下孵育40 min，之后用75%乙醇對GUS染色后的愈傷顆粒脫色，在雙目生物顯微鏡下觀察染色情況并拍照記錄。以平板中染色顆粒占全部顆粒的比例計算侵染率。

1.8 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)熒光試驗

參照1.7節(jié)的試驗方法及GUS染色的最佳條件，將含有pCAMBIA1301-GFP的農(nóng)桿菌GV3101侵染液在OD600為0.6時侵染愈傷懸浮顆粒15 min，對照組選用不含pCAMBIA1301-GFP的GV3101侵染液。侵染后洗滌愈傷顆粒并制作制作懸浮顆粒裝片，使用激光共聚焦顯微鏡并設(shè)置藍(lán)光激發(fā)，觀察GFP的發(fā)光效果。

1.9 不定芽、不定根誘導(dǎo)試驗

參考前期研究結(jié)果[24]，以2.41 g·L-1WPM+7 g·L-1瓊脂+20 g·L-1蔗糖為基本培養(yǎng)基，添加2.0 mg·L-1TDZ與0.5 mg·L-12,4-D誘導(dǎo)愈傷組織不定芽。將生出不定芽的愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到1/2 Read培養(yǎng)基，添加0.5 mg·L-1的吲哚丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)誘導(dǎo)生成不定根，并同時探討了IBA與NAA對生根的影響。

1.10 統(tǒng)計分析

采用Excel 2019處理試驗數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)的形式表示。響應(yīng)面試驗采用Expert-Designer 10.0軟件設(shè)計，方差分析采用該軟件自帶的ANOVA。折線圖采用GraphPad Prism 8.0生物統(tǒng)計軟件繪制，在統(tǒng)計結(jié)果分析中，P<0.05認(rèn)為差異顯著，P<0.01 認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)與優(yōu)化方案的確定

觀察發(fā)現(xiàn)，嫩葉接種2 d后，嫩葉切口處由綠色變?yōu)樯詈稚~片出現(xiàn)彎曲(圖1-A)；14 d后嫩葉變皺，葉脈開始膨脹變大，葉片邊緣及葉脈處生出少量淡綠色愈傷組織；30 d后嫩葉四周由外向內(nèi)逐步愈化生出大量愈傷組織(圖1-B～D)；49 d后整片嫩葉愈化完成(圖1-E、F)。生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)嫩葉的愈化率統(tǒng)計結(jié)果見表2。依據(jù)愈化率及愈傷生長勢，確定紅比利時杜鵑花嫩葉的適宜誘導(dǎo)方案為：在2.41 g·L-1WPM+20 g·L-1蔗糖+10 g·L-1麥芽糖+7 g·L-1瓊脂+0.050 mg·L-1PPM抗菌劑的基本培養(yǎng)基中，加入0.3 mg·L-12,4-D+0.3 mg·L-1TDZ，此條件下的愈化率可達(dá)97.78%。

表2 愈傷誘導(dǎo)的生長調(diào)節(jié)劑組合設(shè)計方案與結(jié)果Table 2 Combination design and experiment result of growth regulators for callus induction

注：A：嫩葉接種；B～D：愈傷分化過程；E、F：致密型愈傷組織；G、H：繼代5次后的疏松型愈傷組織。Note：A: Young leaves inoculation. B～D: Callus differentiation process. E、F: Compact callus. G、H: Loose callus after subculture for 5 times.圖1 嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)及繼代Fig.1 Callus induction and subculture of young leaves

2.2 愈傷增殖的響應(yīng)面試驗

2.2.1 愈傷增殖的響應(yīng)面試驗結(jié)果 設(shè)定2,4-D(mg·L-1，X1)、6-BA(mg·L-1，X2)和TDZ(mg·L-1，X3)的三因素三水平試驗，測定愈傷組織的增殖率，響應(yīng)面試驗結(jié)果如表3所示。對結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，得到各參數(shù)之間的二次多項式回歸模型：

Y=164.53+2.67X1+13.23X2+24.26X3+5.91X1X2+0.11X1X3+8.58X2X3-90.86X12-63.56X22-32.33X32。

2.2.3 最佳提取工藝參數(shù)的預(yù)測及試驗驗證 取X1、X2、X3中任意2個變量，愈傷增殖率受其中2個變量交互作用的影響結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，曲面受TDZ變化的曲折程度大于6-BA和2,4-D。通過二次模型所得到的等高線圖和響應(yīng)曲面可知，3種激素之間的交互作用較強(qiáng)。由圖2-A可知，激素TDZ曲線面最陡，說明激素TDZ對愈傷增殖的影響最大。各激素交互作用明顯，均呈曲線，有明顯峰值，說明增殖率隨3種激素濃度的增加先升高后降低，且有明顯的最佳值。

表3 愈傷組織增殖的Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 Box Behnken response surface experiment results of callus proliferation

表4 愈傷組織增殖的響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface quadratic regression equation model for callus proliferation

綜上分析，愈傷組織最優(yōu)增殖效果的生長激素配比方案為：0.61 mg·L-12,4-D+0.65 mg·L-16-BA+1.57 mg·L-1TDZ，理論預(yù)測增殖率高達(dá)170.19%。采用優(yōu)化后的方案進(jìn)行愈傷組織增殖檢驗，實際測得增殖率約為167%，比軟件理論預(yù)測值170.19%約小3個百分點。

圖2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Fig.2 Results of response surface experimental

圖3 愈傷顆粒懸浮培養(yǎng)的接種(A)和持續(xù)增殖(B、C)及最終結(jié)果(D)Fig.3 Inoculation (A) and continuous proliferation (B, C) of callus suspension culture and results (D)

2.3 愈傷顆粒懸浮培養(yǎng)物建立及理化特性

將繼代5次獲得的愈傷顆粒經(jīng)細(xì)胞篩過濾后所得的小顆粒(圖1-G、H)接種于2.41 g·L-1WPM+20 g·L-1蔗糖+10 g·L-1麥芽糖+0.61 mg·L-12,4-D+0.65 mg·L-16-BA+1.57 mg·L-1TDZ的液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)(圖3-A)，每7 d換一次新的培養(yǎng)液，期間肉眼可見愈傷顆粒數(shù)量不斷增加(圖3-A～C)，30 d后愈傷顆粒懸浮培養(yǎng)結(jié)果如圖3-D所示。在培養(yǎng)過程中，3種理化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，pH值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(圖4-A)；溶液電導(dǎo)率總體呈現(xiàn)下降趨勢(圖4-B)，這種反向相關(guān)性可能與不斷消耗的離子和持續(xù)生成的代謝物有關(guān)。懸浮顆粒在第4至第12天期間呈現(xiàn)指數(shù)生長，最高增幅可達(dá)45%(圖4-C)。

2.4 GUS染色試驗

染色試驗結(jié)果表明，對照組愈傷顆粒未被染色(圖5-A、B)，而成功轉(zhuǎn)化pRI101-AN質(zhì)粒的愈傷顆粒呈現(xiàn)出GUS染色效果(圖5-C、D)。以愈傷顆粒GUS染色為指標(biāo)，評價愈傷顆粒在不同濃度侵染液、侵染不同時間下的侵染率，結(jié)果表明，OD600為0.6的農(nóng)桿菌在侵染15 min時效果最好，侵染率為26.28%(表5)，此時GUS染色效果如圖5-C、D所示。

2.5 GFP熒光試驗

GFP熒光試驗結(jié)果表明，對照組未檢測到熒光(圖6-A)，試驗組檢測到多個GFP熒光斑塊(圖6-B，藍(lán)色箭頭所示)。當(dāng)含有pCAMBIAB01-GFP的農(nóng)桿菌侵染愈傷顆粒時，因侵染效果不同與瞬時轉(zhuǎn)化效率差異，愈傷懸浮顆粒出現(xiàn)GFP熒光斑彩。

圖4 愈傷顆粒培養(yǎng)過程中pH值的變化(A)、電導(dǎo)率的變化(B)和生長曲線(C)Fig.4 Changes of pH value (A), conductivity (B) and growth curve (C) during callus culture

2.6 不定根、不定芽誘導(dǎo)結(jié)果

誘導(dǎo)結(jié)果表明，將不定芽接種至1/2 Read培養(yǎng)基中(圖7-A、B)，培養(yǎng)40 d后長出不定根(圖7-C、D)，直至長成試管苗(圖7-E、F)。同時，參考前期研究方法[24]，通過比較IBA與NAA對生根效果的影響，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)IBA和NAA均可誘導(dǎo)根的分化，但NAA誘導(dǎo)的根細(xì)短且易脫落，而IBA誘導(dǎo)的根長勢較快且健壯。隨著IBA和NAA生長調(diào)節(jié)劑濃度的增加，生根率降低。當(dāng)IBA含量為0.5 mg·L-1、NAA含量為0 mg·L-1時，生根率最高，統(tǒng)計結(jié)果顯示為20.16%±0.71%。由此表明，IBA有利于根的分化；生根的最適培養(yǎng)基為1/2 Read+0.5 mg·L-1IBA。

圖5 GUS染色的對照組(A、B)與試驗組(C、D)愈傷懸浮顆粒Fig.5 Control group(A、B) and experimental group(C、D) stained with GUS in callus suspension particles

表5 農(nóng)桿菌侵染愈傷顆粒實驗結(jié)果Table 5 Experiment of Agrobacterium tumefaciens infecting callus particles

3 討論

瞬時轉(zhuǎn)化體系與再生系統(tǒng)的構(gòu)建是開展基因功能研究以及構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株的重要技術(shù)之一。本研究以嫩葉為外植體，成功構(gòu)建紅比利時杜鵑愈傷顆粒瞬時轉(zhuǎn)化體系，并通過誘導(dǎo)愈傷組織出芽、生根，成功獲得試管苗。

圖6 GFP瞬時表達(dá)的對照組(A)和試驗組(B，藍(lán)色箭頭指示)愈傷懸浮顆粒Fig.6 Control of transient expression of callus particles (A) and GFP expression (B, indicated by blue arrow)

注：A、B為不定芽分化；C、D為不定根分化；E、F為試管苗。Note: A and B are adventitious bud differentiation. C. D are adventitious root differentiation. E. F are test tube seedling.圖7 愈傷組織不定芽、不定根的誘導(dǎo)Fig.7 Induction of adventitious buds and roots from callus

愈傷組織誘導(dǎo)是植物細(xì)胞工程研究領(lǐng)域中一項基礎(chǔ)且重要的試驗，其誘導(dǎo)效果受基因型、組織部位、生長調(diào)節(jié)劑種類與濃度等許多因素影響[25]。表6比較了多個不同物種的愈傷組織誘導(dǎo)試驗，發(fā)現(xiàn)常用的生長素類生長調(diào)節(jié)劑包括NAA、IBA、2,4-D，常用的細(xì)胞分裂素類生長調(diào)節(jié)劑包括6-BA、ZT、TDZ、KT。在多數(shù)試驗中，兩類生長調(diào)節(jié)劑分別選一種按“1+1”方式組合使用，如杜鵑紅山茶[26]、云錦杜鵑[27]、仙茅[28]、鳳丹牡丹[29]、郁金櫻[30]及本研究的紅比利時杜鵑等，但部分試驗采用“2+1”方式如興安杜鵑的根段[31]、甬之妃杜鵑的嫩葉[24]和杉木的針葉[32]或“1+2”方式如野生大白杜鵑的針葉、嫩葉和上胚軸等組織[33]，也有采用“2+2”的方式的如芍藥的花藥[34]。誘導(dǎo)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除芍藥的花藥外，其余試驗都獲得了高于60%的愈傷誘導(dǎo)率。本研究紅比利時杜鵑采用“1+1”組合方式，獲得了97%的愈傷誘導(dǎo)率。在生長調(diào)節(jié)劑濃度使用上，有“低生長素、高細(xì)胞分裂素”組合，如云錦杜鵑幼葉的“0.05+2.0”[27]、仙茅幼葉的“0.5+1.5”組合[28]；也有高生長素、低細(xì)胞分裂素組合，如甬之妃杜鵑嫩葉的“2.0+1.0”[24]、鳳丹牡丹幼胚的“2.5+0.1”[29]；還有生長素與細(xì)胞分裂素濃度近似的組合如本研究紅比利時杜鵑嫩葉的“0.3+0.3”，且都獲得了高于60%的誘導(dǎo)率。從上述結(jié)果看，在外植體、生長調(diào)劑種類與濃度等3個參數(shù)的選擇上，愈傷組織誘導(dǎo)試驗在外源生長調(diào)節(jié)劑的種類與濃度選擇上似乎沒有固定規(guī)律。1957年Skoog等[35]曾經(jīng)提出一個著名的“Skoog-Miller”模式，即細(xì)胞分裂素與生長素的濃度比例會影響外植體的分化方向，比例高可誘導(dǎo)芽分化，比例低則誘導(dǎo)根分化，比例接近1則誘導(dǎo)愈傷組織分化。然而，本研究結(jié)果與“Skoog-Miller”模式發(fā)生矛盾，該矛盾可能因不同外植體中內(nèi)源激素的種類與含量差別所導(dǎo)致，詳細(xì)原因有待深入研究。

表6 愈傷組織誘導(dǎo)試驗的生長調(diào)劑使用比較Table 6 Comparison of growth regulators used in callus induction experiment

愈傷組織增殖與愈傷組織誘導(dǎo)是兩個不同的生物學(xué)過程。愈傷組織誘導(dǎo)是體細(xì)胞去分化的試驗，涉及到體細(xì)胞中與分化有關(guān)基因的重編程，然而愈傷組織增殖是去分化后獲得的分生細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、厚壁細(xì)胞等的增殖試驗，主要與有絲分裂有關(guān)[36]。因此，在愈傷組織誘導(dǎo)與愈傷組織增殖試驗中，外源生長調(diào)節(jié)劑的使用方式也不同。例如仙茅[28]幼葉愈傷組織誘導(dǎo)試驗的生長調(diào)劑為0.5 mg·L-1NAA + 1.5 mg·L-16-BA，而愈傷組織增殖試驗的生長調(diào)節(jié)劑為0.5 mg·L-1NAA + 2.0 mg·L-16-BA；郁金櫻[30]愈傷組織誘導(dǎo)試驗的生長調(diào)節(jié)劑為1.0 mg·L-12, 4-D + 0.5 mg·L-16-BA，而愈傷組織增殖試驗的生長調(diào)節(jié)劑為1.0 mg·L-16-BA，差別明顯。本研究紅比利時杜鵑愈傷組織誘導(dǎo)試驗的生長調(diào)節(jié)劑為0.3 mg·L-12, 4-D + 0.3 mg·L-1TDZ，而愈傷組織增殖試驗的生長調(diào)節(jié)劑為0.61 mg·L-12, 4-D + 0.65 mg·L-16-BA + 1.37 mg·L-1TDZ，兩個試驗的誘導(dǎo)率和增值率分別為97.78%與167%，效果均較好。

在紅比利時杜鵑愈傷組織增殖效果研究的基礎(chǔ)上，本研究以愈傷懸浮顆粒為受體，探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化效果與菌株類型、侵染液濃度、受體類型、外界環(huán)境等諸多因素有關(guān)[12]，受到組織細(xì)胞的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)、生理、生化、免疫等多種參數(shù)影響[37]。表7比較了幾個不同物種的瞬時轉(zhuǎn)化試驗參數(shù)，結(jié)果表明，常用的農(nóng)桿菌菌株為GV3101、EHA105，侵染液OD600多數(shù)在0.6～1.0之間；受體材料多數(shù)為葉片[38]、愈傷組織[39-40]、愈傷懸浮細(xì)胞[41-42]等，只有少數(shù)使用莖段[43]或子葉節(jié)[44]的報道；報告基因通常采用GUS或GFP[38-45]。從轉(zhuǎn)化效率來看，不同的受體材料轉(zhuǎn)化效率差別較大，杜梨葉片采用GV3101的轉(zhuǎn)化效率甚至達(dá)到100%[38]。本研究針對紅比利時杜鵑瞬時轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的參數(shù)設(shè)置與上述報道結(jié)果中的參數(shù)值相近，并獲得26.8%的轉(zhuǎn)化效率。

表7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)化試驗的部分參數(shù)比較Table 7 Comparison of some parameters of Agrobacterium mediated transient transformation experiment

再生系統(tǒng)的構(gòu)建是植物組織工程的重要環(huán)節(jié)[6]。據(jù)不完全統(tǒng)計，杜鵑花屬植物的再生系統(tǒng)多是以頂芽、側(cè)芽或帶芽的莖段為外植體，借助直接器官誘導(dǎo)的方式建立的。例如，用莖尖成功繁殖的錦繡杜鵑(R.pulchrum)[46]，以頂芽繁殖的兩種西洋杜鵑栽品種(R.britannia和R.america)[47]。少數(shù)杜鵑花屬植物的再生系統(tǒng)是通過愈傷組織誘導(dǎo)，再從愈傷組織種產(chǎn)生不定芽的間接器官發(fā)生方式建立的。例如，目前僅發(fā)現(xiàn)2例以葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷并培育出組培苗的研究報道，即牛皮杜鵑(R.aureum)和云錦杜鵑(R.fortunei)[48]。張開文等[6]認(rèn)為，杜鵑屬植物因外植體滅菌難度大、易污染等原因?qū)е露霹N花愈傷組織再生相對困難，因此以間接器官發(fā)生的方式構(gòu)建的再生系統(tǒng)較少。本研究以紅比利時嫩葉為外植體，借助響應(yīng)面方法優(yōu)化了生長調(diào)節(jié)劑的使用方案，高效率誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，之后通過誘導(dǎo)出芽、生根，建立了紅比利時杜鵑花的間接器官發(fā)生途徑。

綜上，本研究成功構(gòu)建了紅比利時杜鵑愈傷懸浮顆粒瞬時轉(zhuǎn)化體系，并實現(xiàn)了愈傷組織間接再生試管苗，研究結(jié)果為后續(xù)開展功能組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以愈傷懸浮顆粒為受體，構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅比利時杜鵑瞬時轉(zhuǎn)化體系，并實現(xiàn)愈傷組織再生試管苗。研究發(fā)現(xiàn)，2,4-D和TDZ組合能高效誘導(dǎo)嫩葉愈化，2,4-D、6-BA和TDZ組合能促進(jìn)愈傷增殖。愈傷繼代5次后可形成疏松型愈傷顆粒，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可獲得愈傷懸浮顆粒，該愈傷懸浮顆粒是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化體系的良好受體。同時，該愈傷組織可通過間接器官發(fā)生途徑實現(xiàn)試管苗再生。