新鮮當歸采后青霉病病原菌分離鑒定、生物學特性及毒素積累

楊董云，呂丙鈺，薛華麗，楊志敏

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院，甘肅 蘭州 730070;2.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院,甘肅 蘭州 730000)

當歸為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的根，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為中品，具有廣泛的藥用價值，素有“十方九歸”的美譽[1-2]?？扇敫巍⑿?、脾經(jīng)，藥性甘、辛、溫，主要用于血虛萎黃、眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、腸燥便秘等癥狀[3]。當歸主產(chǎn)于我國甘肅東南部，其中以岷縣當歸產(chǎn)量多、品質(zhì)好。當歸在甘肅岷縣的人工種植已有近2000年的歷史，是甘肅道地藥材之一，占全國產(chǎn)量、銷量的90%以上[4]。

近年來隨著當歸種植規(guī)模的不斷擴大，當歸病害日益嚴重。目前當歸病害研究主要集中在采前田間生長階段，如當歸腐爛莖線蟲病、根腐病、褐斑病、菌核病、炭疽病、銹病和白粉病等[5]，而采后貯藏期間病害研究鮮見報道，對于當歸采后青霉病研究，陳娟從江西藥材市場的中草藥飲片中分離出皮落青霉(Penicilliumcrustosum)、鮮綠青霉(P.viridicatum)、橘灰青霉(P.aurantiogriseum)等青霉屬病原菌，但未對病原菌的生物學特性及其毒素積累報道[6]，同時，中藥飲片與新鮮藥材原材料上存在差異。當歸采收時間正值深秋，低溫高濕，且采后主要放在田間或農(nóng)民家里自然晾干，在晾曬過程中由于溫濕度不當，使當歸極易發(fā)生腐爛、發(fā)霉，通常農(nóng)民對發(fā)生霉變的組織進行簡單的清洗。然而，眾所周知，有一部分病原真菌在適宜的溫濕度條件下會代謝產(chǎn)生真菌毒素，這不僅嚴重降低當歸藥材的使用價值，還會給人類健康帶來巨大的安全隱患與威脅。所以，即使當歸田間病害得到了有效的控制，而采后貯藏期間發(fā)病，仍然會前功盡棄。因此，對當歸采后貯藏期間病害研究顯得尤為重要。

本試驗擬從新鮮當歸采后貯藏期間具有典型的青霉病病害癥狀組織進行分離、平板劃線，分離純化得到引起當歸青霉病的病原菌菌株，然后進行回接驗證，根據(jù)科赫氏法則證明其分離菌的致病性，通過形態(tài)學和分子生物學技術(shù)對采后當歸青霉病的病原菌進行鑒定，再從傳統(tǒng)植物病理學角度對該病原菌進行生物學特性分析，以期為有效控制該病害提供理論依據(jù)并通過HPLC法對青霉病原菌侵染當歸過程中積累的真菌毒素進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮當歸采購于甘肅省岷縣藥材種植基地，主要選取具有典型的青霉病病癥和健康的新鮮當歸，當日運抵甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院化學與生物學實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，水1 000 mL，自然pH)、查氏培養(yǎng)基(硝酸鈉2 g、磷酸二氫鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15 g、水1 000 mL)。碳源培養(yǎng)基：以葡萄糖、麥芽糖、β-環(huán)糊精、甘露醇、果糖替代查氏培養(yǎng)基中蔗糖，其他相同；氮源培養(yǎng)基：以硫酸銨、酵母浸粉、蛋白胨、甘氨酸、尿素替代查氏培養(yǎng)基中硝酸鈉，其他相同。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌分離 選取具有典型青霉病病害癥狀的新鮮當歸，用滅菌的不銹鋼刀片切取霉變當歸病健交界處3 mm×3 mm大小的組織，置于75%酒精中清洗5 s，后用無菌水漂洗3次，晾干后置于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。根據(jù)菌落形態(tài)對產(chǎn)生的真菌菌落進行分組，并隨機選擇特定組的代表性菌落在PDA平板上劃線，反復進行傳代培養(yǎng)，直至得到純的分離株。

1.3.2 分離菌株回接試驗 根據(jù)科赫氏法則，挑選無損傷、新鮮、健康的當歸，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，蒸餾水洗滌2次，室溫下自然風干。將濃度為1×106CFU/mL的分離菌株孢子懸浮液以噴霧接種的方式，接種于已消毒的當歸組織，觀察并記錄發(fā)病情況，30 d后從霉變組織中重新分離純化菌種，并與第一次純化的霉菌進行形態(tài)學對比是否一致，形態(tài)一致則確認其為致病菌。

1.3.3 病原菌形態(tài)學鑒定 將分離純化后致病菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5 d，觀察致病菌形態(tài)，記錄菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)、顏色變化并測定其菌落大小。通過光學顯微鏡(40倍物鏡下觀察)進行觀察菌絲體有無橫隔膜，以及孢子囊的形態(tài)，以掃描電子顯微鏡觀察致病菌孢子形態(tài)，參考真菌鑒定手冊[7]，鑒定病原菌種類。

1.3.4 病原菌分子生物學鑒定 將致病菌的孢子(1×106CFU/mL)接種在PDB培養(yǎng)基中，并在25 ℃下培養(yǎng)5 d。將過濾液體培養(yǎng)物收集真菌的菌絲體用液氮研磨成細粉。使用UNlQ-10柱真菌基因組DNA提取試劑盒(Sangon公司，中國上海)提取其DNA。

以上述提取DNA為模板，以ITS1(TCCGTAG-GTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCT-TATTGATATGC)為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物委托北京博邁德生物公司測序。將測序結(jié)果從GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，選取合適的序列，利用MEGA-7軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合分子生物學鑒定與形態(tài)學鑒定結(jié)果確定致病菌種屬。

1.3.5 溫度對致病菌生長的影響 PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的致病菌，刮取其孢子制成懸浮液(1×106CFU/mL)，備用。

致死溫度測定：上述致病菌孢子懸浮液分別置于35、45、50、55、60、65 ℃條件下恒溫水浴15 min，取2 μL孢子懸浮液滴于PDA平板中心處，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)，并采用十字交叉法測定菌落直徑[8]。

最適生長溫度：取配制好的孢子懸浮液2 μL接種于PDA培養(yǎng)基中心處，分別置于15、20、25、30、35 ℃(每個溫度梯度設置3個重復)，恒溫暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)、測定菌落直徑，并以血球計數(shù)板測定產(chǎn)孢量。

1.3.6 pH對致病菌生長的影響 用HCl與NaOH溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH值分別至5、6、7、8、9、11，分別將2 μL致病菌孢子懸浮液接種于6個pH梯度PDA平板中心處(每個pH梯度設置3個重復)，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)、測定菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.3.7 光照對致病菌生長的影響 將2 μL致病菌孢子懸浮液接種于PDA平板中心處，分別置于12 h光照、12 h黑暗交替環(huán)境中(設置3個重復)，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)、測定菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.3.8 不同碳源對致病菌生長的影響 分別以葡萄糖、麥芽糖、β-環(huán)糊精、甘露醇、果糖為不同碳源，查氏培養(yǎng)基為對照組，將2 μL致病菌孢子懸浮液接種于上述碳源培養(yǎng)基中(設置3個重復)，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)、測定菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.3.9 不同氮源對致病菌生長的影響 分別以硫酸銨、酵母浸粉、蛋白胨、甘氨酸、尿素為不同氮源，查氏培養(yǎng)基為對照組，將2 μL致病菌孢子懸浮液接種于上述氮源培養(yǎng)基上(設置3個重復)，25 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)、測定菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.3.10 棒曲霉素含量的測定 根據(jù)《食品安全國家標準食品中展青霉素的測定GB 5009.185-2016》測定棒曲霉素[9]，取回接當歸青霉病致病菌30 d后的病部組織，液氮研磨，稱取當歸研磨的粉末5.0 g，置于離心管中，加入20 mL乙酸乙酯于離心機中離心(5 000 r/min，4 ℃，5 min)，重復3次，合并提取液于燒瓶中，于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮氣吹干，2 mL pH為4的乙酸復溶，0.45 μm微孔濾膜過濾，樣液進行高效液相色譜進行檢測[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離和致病性分析

通過組織分離法從霉變新鮮當歸組織(圖1-A)中分離純化得到1株青霉菌，命名yang2。根據(jù)科赫氏法則進行回接試驗，結(jié)果表明yang2分離菌回接的當歸均有不同程度的病變(圖1-B)，取霉變部位與正常部位交界處組織進行分離純化菌株，結(jié)果表明，重新分離菌株與yang2菌株形態(tài)特征一致，因此yang2為當歸采后青霉病的主要致病菌。

A：當歸自然發(fā)病的癥狀；B：致病性檢測病害癥狀。

2.2 霉菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 根據(jù)形態(tài)學特征進行鑒定，yang2在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖2-A～B所示。并對其分生孢子梗(圖2-C)和孢子形態(tài)(圖2-D)進行觀察。25 ℃ 培養(yǎng)5 d，平均菌落直徑26.6 mm，菌絲體邊緣為白色，放射狀皺紋，正面呈深綠色，反面呈黃褐色，分生孢子梗為掃帚狀，分生孢子呈念珠狀串生，單孢無色，近球形，初步鑒定yang2為波蘭青霉(Penicilliumpolonicum)。

A：菌落形態(tài)(正面；B：菌落形態(tài)(反面)；C：分生孢子梗形態(tài)；D：孢子形態(tài)。

2.2.2 分子生物學鑒定 形態(tài)學鑒定初步確定yang2為波蘭青霉，經(jīng)過ITS通用引物進行PCR擴增，所得電泳圖如圖3所示，分子量為589 bp，對所得擴增序列進行測序，所得結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對分析，選取合適序列，利用MEGA-7軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果表明，yang2與波蘭青霉同源性為95%，結(jié)合形態(tài)學鑒定結(jié)果，確定yang2為青霉屬的波蘭青霉(Penicilliumpolonicum)。

圖3 yang2 ITS序列擴增結(jié)果

圖4 yang2 基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 病原菌生物學特性分析

2.3.1 波蘭青霉致死溫度影響 由圖5可知，波蘭青霉在35～55 ℃均能正常生長，在60 ℃時，生長受到抑制，而在65 ℃時不再生長，故波蘭青霉的致死溫度為65 ℃。

圖5 波蘭青霉致死溫度

2.3.2 溫度對波蘭青霉生長的影響 溫度對微生物的生長發(fā)育以及代謝具有顯著的影響，結(jié)果表明，波蘭青霉在15～35 ℃均能生長，其中在35 ℃時生長緩慢，最適生長的溫度范圍為20～25 ℃(圖6-A)，且25 ℃與20 ℃生長差異不顯著；波蘭青霉在15～35 ℃均能產(chǎn)孢，而在25 ℃時產(chǎn)孢量最高，顯著高于其他溫度，而在15 ℃與35 ℃時產(chǎn)孢量遠低于其他溫度條件下(圖6-B)。

圖6 溫度對波蘭青霉菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

2.3.3 pH對波蘭青霉生長的影響 pH對波蘭青霉的生長具有顯著影響，由圖7-A可知，波蘭青霉在pH為5～11均能生長，但在過酸或過堿的條件下波蘭青霉的生長明顯較慢，而在pH為7時的菌絲生長顯著高于其他pH條件；pH對波蘭青霉產(chǎn)孢量的影響如圖7-B所示，波蘭青霉在pH 5～11均能產(chǎn)孢，而在pH為7時產(chǎn)孢量最高。綜上所述，當pH為7時波蘭青霉最適生長和產(chǎn)孢。

圖7 pH對波蘭青霉菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

2.3.4 光照對波蘭青霉生長的影響 光照對波蘭青霉生長具有顯著的影響(圖8-A)，在黑暗條件下，波蘭青霉生長最好，12小時光暗交替次之，光照條件下生長最為緩慢；對波蘭青霉產(chǎn)孢而言(圖8-B)，光照也是抑制其產(chǎn)孢，黑暗條件產(chǎn)孢量最高，而光照條件下產(chǎn)孢量最低，且光照對產(chǎn)孢量的抑制極為顯著，光暗交替條件下生長速度與光照條件下差異不明顯，顯著低于黑暗條件生長情況。綜上所述，光照會顯著抑制波蘭青霉的生長和產(chǎn)孢。

圖8 光照條件對波蘭青霉菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

2.3.5 碳源對波蘭青霉生長的影響 不同碳源對波蘭青霉的菌絲生長的影響如圖9-A所示，在6種不同碳源的培養(yǎng)基中，波蘭青霉均能正常生長，其中麥芽糖作為碳源時波蘭青霉菌絲生長最好，其次為β-環(huán)糊精、甘露醇均顯著高于其他碳源，而蔗糖作為碳源時，菌絲生長最慢；而不同碳源對波蘭青霉產(chǎn)孢量影響(圖9-A)所示，蔗糖作為碳源時產(chǎn)孢量最高，其次為麥芽糖、甘露醇，β-環(huán)糊精作為碳源時產(chǎn)孢量最低。綜上所述，麥芽糖是波蘭青霉生長的最適碳源，蔗糖是波蘭青霉產(chǎn)孢的最適碳源。

圖9 碳源對波蘭青霉菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

2.3.6 氮源對波蘭青霉生長的影響 不同氮源對波蘭青霉的影響顯著，由圖10-A可見，波蘭青霉以蛋白胨為氮源時波蘭青霉生長最好，其次酵母浸粉，兩者顯著高于其他4種氮源條件下的生長，其中尿素和硫酸銨作為氮源時生長最緩慢；而不同氮源對波蘭青霉的產(chǎn)孢量影響(圖10-B)結(jié)果表明，酵母浸粉作為氮源時產(chǎn)孢量最好，顯著高于其他氮源的培養(yǎng)基，其中硫酸銨作為氮源時產(chǎn)孢量最低。綜上所述，波蘭青霉最適氮源為酵母浸粉。

圖10 氮源對波蘭青霉菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

A：標品色譜圖；B：青霉病當歸組織中棒曲霉素色譜圖。

2.4 青霉病當歸組織中真菌毒素積累分析

據(jù)報道波蘭青霉為棒曲霉素(patulin，PAT)產(chǎn)毒菌株[11]，本研究對波蘭青霉侵染采后新鮮當歸的青霉病組織中產(chǎn)毒情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)波蘭青霉侵染引起的青霉病當歸組織中有棒曲霉素的積累，其含量為6.166 μg/g。

3 討論

有關中草藥的病害在國內(nèi)外常有報道，如由黃芪白粉菌(Erysipheastragali)引起的黃芪的白粉病[12]；由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮刀菌(F.solani)引起的黃芪根腐病[13]；由茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的甘草根腐病[14]；由甘草尾孢、甘草單胞銹菌分別引起的甘草銹病、褐斑病等[15]；由燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)和銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)所造成的岷縣當歸根腐病[16]；由束狀炭疽菌(Colletotrichumdematium)危害引起的當歸炭疽病[17]等。然而，上述報道均屬于田間病害，而采后貯藏期間病害研究鮮見報道，雖然陳娟從采后儲藏期間的霉變的中藥材飲片當歸組織中分離出了皮落青霉(Penicilliumcrustosum)、鮮綠青霉(P.viridicatum)、橘灰青霉(P.aurantiogriseum)等病原菌[6]，然而，藥材飲片與新鮮藥材在原料上存在差異，同時，該研究未對分離病原菌的生物學特性及毒素積累情況進行系統(tǒng)報道。

本研究對甘肅岷縣新鮮當歸采后貯藏期間青霉病病害的致病菌進行分離純化、致病性檢測，并通過形態(tài)學和分子生物學技術(shù)進行分析，確定引起新鮮當歸采后青霉病的主要致病菌為波蘭青霉(Penicilliumpolonicum)。

波蘭青霉具有較廣的寄主范圍，如沙娜瓦爾·色買提從棗貯藏期的霉爛組織[18]、Duduk從洋蔥貯藏期的青霉病病害組織[19]、及閔曉芳從柑橘青霉病病害組織中[20]均分離出波蘭青霉(P.polonicum)。陳娟從霉變巴戟天、甘草的飲片上分離出P.polonicum等，但在當歸霉變組織中并未分離出P.polonicum[6]。

波蘭青霉的孢子致死溫度較高，不易失活，在溫度20～25 ℃、pH 7、黑暗、以麥芽糖為碳源、蛋白胨為氮源條件下菌絲生長最好：在溫度25 ℃、pH 7、蔗糖為碳源、酵母浸粉為氮源時產(chǎn)孢量最高。冉隆賢從霉爛竹材中分離出的指狀青霉在溫度25 ℃、pH 5～6、葡萄糖和淀粉為碳源時生長最好[21]；丁仁惠從霉變采后柑橘中分離的指狀青霉在溫度28～30 ℃、pH 6～7、葡萄糖為碳源時生長最好[22]，并且沒有差異性；郜海燕等發(fā)現(xiàn)，從藍莓采后病害中分離出的波蘭青霉在溫度30 ℃、pH 9、果糖為碳源、蛋白胨為氮源條件下生長最好。由此表明，不同宿主青霉病病害組織中分離得到的病原菌種類不同，病原菌的生物學特性也存在顯著差異。甘肅岷縣地處甘肅省南部，青藏高原東麓與西秦嶺隴南山地接壤區(qū)，境內(nèi)海拔為2 200～3 872 m，10月底11月初正值該地區(qū)低溫高濕季節(jié)，極有利于青霉菌類病原菌的生長與繁殖。

值得關注的是，本研究在波蘭青霉侵染的霉變當歸組織中檢測到棒曲霉素的存在，含量為6.166 μg/g。棒曲霉素為曲霉屬和青霉屬等真菌產(chǎn)生的主要次生代謝產(chǎn)物[23-24]，具有致畸、致癌、影響生育和免疫抑制等毒理作用[25]。謝芳超從陽信鴨梨腐敗果中分離鑒定出波蘭青霉，且伴有棒曲霉素的檢出[11]；蘇青峰從濃縮蘋果汁生產(chǎn)原料中也分離鑒定出波蘭青霉，且同時有棒曲霉素的檢出[26]。有關棒曲霉素的限量標準，不同國家標準不一，中國、美國及歐盟等國家規(guī)定果汁中棒曲霉素最大限量為50 μg/kg[27-28]，其中歐盟對嬰幼兒食品中棒曲霉素的最大限量規(guī)定為10 μg/kg[29]，1995年聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織(food and agriculture organization，F(xiàn)AO)規(guī)定每人每天棒曲霉素最大量攝入不超過0.4 μg/kg體質(zhì)量[30]。而對中草藥中棒曲霉素限量標準尚缺乏。

4 結(jié)論

新鮮當歸采后青霉病的主要致病菌為波蘭青霉(Penicilliumpolonicum)，波蘭青霉的孢子致死溫度為65 ℃，在溫度20～25 ℃、pH 7、以麥芽糖為碳源、蛋白胨為氮源時菌絲生長最好，而在溫度25 ℃、pH 7、蔗糖為碳源、酵母浸粉為氮源時產(chǎn)孢量最高。在波蘭青霉侵染鮮當歸的過程中會積累棒曲霉素，其嚴重威脅人類的健康。本研究可為有效防治當歸采后青霉病及當歸中真菌毒素積累提供理論依據(jù)。