薏苡仁脂肪酸的α-葡萄糖苷酶抑制活性

周麗琬，李穎，陳惠琴，楊小雨，徐幸蓮*，戴好富,*

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（南京 210095）；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室（海口 571101）；3. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所（興義 562400）

薏苡（Coix lacryma-jobiL. var. ma-yuen Stapf）為禾本科（Gramineae）薏苡屬（CoixL.）一年生或多年生草本植物[1]。將殼及種皮從種子中剝離后的部分為薏仁，也被稱作薏仁米、薏珠子等[2-3]。薏苡是一種藥食兩用的栽培作物，有豐富的營養(yǎng)價值以及多樣的保健功能，享有“世界禾本科植物之王”的美譽[4-5]。在中國、印度、日本及越南等東南亞國家均有廣泛種植[6]。

薏苡歷史悠久，可作為保健品以及中成藥，其味甘、淡，性涼，歸脾、胃、肺經(jīng)，有利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結(jié)的功效[7-9]。有關(guān)薏苡仁降血糖的功效自古即有跡可尋，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載薏苡能夠清熱除濕、健脾潤肺，因此對于消渴（糖尿病）的三多癥狀均有功效；《本草拾遺》中稱薏苡仁可“溫氣、主消渴”；《本草綱目》中也有記載其可“治消渴飲水”[10]。薏苡仁作為薏苡可直接食用的一部分，國內(nèi)外對其活性方面已有了較多的研究，已有研究表明薏苡仁多糖具有降血糖活性[11-13]，但對于薏苡仁的其他成分是否參與降血糖作用的研究較少。因此，研究旨在探究薏苡仁脂肪酸的降血糖活性，并以作為治療II型糖尿病的重要靶點之一α-葡萄糖苷酶為活性篩選模型[14]，利用優(yōu)化后的pNPG法對各提取物及其中的主要脂肪酸成分進行α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選及酶動力學(xué)測試，為薏苡仁降血糖活性的研究開闊思路與方向，同時為相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品

薏苡仁采集于中國貴州省興仁市潘家莊實驗基地，經(jīng)劉凡值研究員（單位：貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所）鑒定其為禾本科（Gramineae）薏苡（Coix lacryma-jobiL. var. ma-yuen Stapf）。

1.2 標準品

順式-油酸甲酯（純度95%）和反式-油酸（純度95%），購自北京百靈威科技有限公司；棕櫚酸（純度97%）和順式-亞油酸甲酯（純度99%），購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；順式-亞油酸（純度99%）。購自北京曼哈格生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

HP6890/5975C型 GC/MS聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；RODI-50-RE超純水系統(tǒng)（北京華力航科技公司）；SynergyH1全波長多功能酶標儀（海南雋譽科技有限公司）；Delta 320-S型 pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；EN 2062電子秤（海南雋譽科技有限公司）；1～1 000 μL移液槍（德國Eppendorf）。

1.4 試劑

阿卡波糖（Sigma Chemical）；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg，Sigma Chemical）；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，上海源葉生物科技公司）；磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 薏苡仁粗提物的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）分析

1.5.1.1 樣品前處理

利用常溫浸提法對薏苡仁（27.7 kg）進行提取。按料液比1∶3（kg/L）用工業(yè)乙醇浸提三次，每次浸泡一周，收集濾液并濃縮得到乙醇提取物（405.1 g）。乙醇提取物用水充分溶解，依次用同等體積的石油醚、乙酸乙酯各萃取三次，濃縮后得到薏苡仁石油醚相（194.2 g）和乙酸乙酯相（15.0 g）。將乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相用色譜甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后待測。

1.5.1.2 GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱為彈性石英毛細管柱-HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為He，載氣流量1.0 mL/min，分流比40∶1；初始柱溫為50 ℃，以5 ℃/min的速度升溫到310℃，恒溫時間為10 min，汽化室的溫度均為250 ℃；溶劑延遲時間為3.0 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；接口溫度為280 ℃；發(fā)射電流為34.6 μA；倍增器電壓為1 434 V；質(zhì)量掃描范圍為20～550m/z。質(zhì)譜檢索采用Wiley 275標準譜庫檢索（要求相似度90%以上），各組分的相對百分含量采用峰面積歸一化法計算，推測出薏苡仁中主要成分。

1.5.2α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

α-葡萄糖苷酶抑制活性測定方法在Liu等[15]的基礎(chǔ)上加以改進。

1.5.2.1 所需試劑的配制

（1）α-葡萄糖苷酶溶液的配制：準確稱取2.0 mgα-葡萄糖苷酶固體（50 U/mg）溶解到1.0 mL PBS緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）中得到100 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，再用PBS緩沖液稀釋至0.2 U/mL。（2）pNPG的配制：準確稱取7.5 mgpNPG溶解至10 mL PBS緩沖液中得到2.5 mmol/LpNPG溶液。（3）樣品、陽性對照溶于DMSO中配制成相應(yīng)濃度。

1.5.2.2 化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制率測定

將適宜濃度的樣品與α-葡萄糖苷酶溶液混勻后加入96孔酶標板中，每孔中含有10 μL樣品及100 μL酶溶液，若樣品顏色較深，則需要設(shè)置一組樣品的本底對照以減去樣品在405 nm處的本底吸收值。以等量的DMSO代替樣品加入酶溶液中作為陰性對照和空白對照，以阿卡波糖為陽性對照，將96孔板于37 ℃下溫育15 min。然后，向空白對照及本底對照組中加入40 μL PBS（0.1 mol/L，pH 6.8），試驗組、陰性對照及陽性對照組均加40 μL底物，并于37 ℃下溫育15 min。最后用酶標儀測定在405 nm處的吸光度，記錄每孔的吸光度，重復(fù)3次取平均值。

化合物對α-葡萄糖苷酶抑制活性的計算公式：抑制率=（A2-A1）/（A2-A0）×100%；樣品顏色較深時的計算公式：抑制率=[A2-（A1-A1′）]/（A2-A0）×100%。

式中：A0、A1、A1′、A2分別為405 nm下測得的空白對照組、試驗組、本底對照組、陰性對照組的吸光度。

1.5.2.3 化合物對α-葡萄糖苷酶的IC50值測定

按照2.2.2方法，將每個樣品按梯度稀釋配制成5個濃度進行α-葡萄糖苷酶抑制活性測試，計算各濃度下的抑制率并繪制化合物濃度-抑制率曲線圖，計算得到樣品對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度（IC50值）。

1.5.2.4 化合物對α-葡萄糖苷酶的酶動力學(xué)測試

按照2.2.2方法，將稀釋的樣品溶液（稀釋3或4個濃度，通常選擇在樣品IC50值附近的濃度開始稀釋）與酶溶液混勻后，分別與濃度為2.5，1.25，0.625，0 mmol/L的底物反應(yīng)，在37 ℃下溫育，每隔1 min測定一次其在405 nm處的吸光度，共測定15 min，重復(fù)三次試驗求平均值。按Lineweaver-Burk方程作圖，繪制酶抑制作用的動力學(xué)曲線，確定其抑制類型。競爭性抑制動力學(xué)方程如式（1）所示。

式中：[S]為底物質(zhì)量濃度，mg/mL；[I]為抑制劑質(zhì)量濃度，mg/mL；Vmax為最大速度，mL/min；Km為米氏常數(shù)，mg/mL；Ki為[EI]的解離常數(shù)，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS結(jié)果分析

薏苡仁乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相粗提物均為油狀物，其GC-MS離子流圖和鑒定的化學(xué)成分見圖1和表1。棕櫚酸在乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相中的峰面積占比分別為17.00%，21.88%和19.66%；順式-油酸甲酯在這3個提取物中的峰面積占比分別為10.16%，50.79%和4.17%；順式-亞油酸甲酯在這3個提取物中的峰面積占比分別為6.63%，11.36%和26.46%；順式-亞油酸在乙醇粗提物和乙酸乙酯相中的峰面積占比為29.39%和27.40%；反式-油酸在乙醇粗提物和石油醚相中的峰面積占比分別為15.27%和9.4%。這5個化合物在乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相中的總占比分別為78.45%，93.43%和77.69%。另外，石油醚相中還含有少量酸、酯類化合物，乙酸乙酯相中還含有少量酯、醇、烯酸以及甾醇類化合物。因此推測棕櫚酸、反式-油酸、順式-亞油酸、順式-油酸甲酯、順式-亞油酸甲酯為薏苡仁中主要成分。

圖1 薏苡仁乙醇粗提物（a）、石油醚相（b）及乙酸乙酯相（c）的GC-MS離子流圖

表1 薏苡仁乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相中的主要成分

2.2 薏苡仁粗提物的α-葡萄糖苷酶抑制活性

薏苡仁乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性（表2）。

表2 薏苡仁乙醇粗提物、石油醚相和乙酸乙酯相的α-葡萄糖苷酶抑制活性（n=3，x±s）

2.3 薏苡仁中主要成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性

對薏苡仁中5種主要成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性作進一步探索。5個化合物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50值見表3，對α-葡萄糖苷酶的酶動力學(xué)結(jié)果見圖2。

2.3.1 主要成分的α-葡萄糖苷酶IC50值測定結(jié)果

化合物的IC50值見表3。這5個化合物對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，且都明顯強于陽性對照阿卡波糖（IC50=581.94±0.26 μmol/L）。

表3 薏苡仁中主要成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性（n=3，x±s）

2.3.2 主要成分對α-葡萄糖苷酶的酶動力學(xué)測試結(jié)果

以底物質(zhì)量濃度（S）的倒數(shù)與反應(yīng)速率（V）的倒數(shù)作雙倒數(shù)曲線圖（圖2）。從雙倒數(shù)曲線圖中可以判斷化合物的抑制類型：若所有曲線（不同的抑制劑濃度）的交點在y軸上，則表明化合物為競爭性抑制劑；若在x軸上則表明化合物為非競爭性抑制劑；若交點不在坐標軸上則表明化合物為混合性抑制劑[16]。由圖2可知，化合物2（圖2-b）、化合物4（圖2-d）和化合物5（圖2-e）的雙倒數(shù)圖有良好的線性關(guān)系，所有曲線均相交于y軸，即隨著抑制劑的質(zhì)量濃度增大，Vmax不變，Km增大，說明抑制劑和pNPG在該酶（E）上的結(jié)合位點一致，因此化合物2，4和5對葡萄糖苷酶有競爭性抑制作用；而化合物1（圖2-a）和3（圖2-c）的雙倒數(shù)曲線顯示，所有曲線的交點不在坐標軸上，即隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增大，Vmax減小，Km增大，說明這兩個抑制劑不僅與酶結(jié)合發(fā)揮抑制作用，還會與酶-底物復(fù)合物結(jié)合抑制α-葡萄糖苷酶活性，因此這兩個抑制劑對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為混合性抑制。表4為各抑制劑的酶抑制常數(shù)Ki（雙曲線倒數(shù)圖中各曲線斜率值-抑制劑質(zhì)量濃度所作曲線的x軸截距）和酶-底物絡(luò)合物抑制常數(shù)Kis（雙曲線倒數(shù)圖中各曲線的y軸截距-抑制劑質(zhì)量濃度所作曲線的x軸截距），根據(jù)這兩個抑制常數(shù)可以推斷出抑制劑對酶的親和力，數(shù)值越小，抑制劑對酶的親和力越好，結(jié)合更緊密，抑制能力越強[17-18]。由這5個化合物的Ki值可以判斷它們的抑制能力由強到弱依次為反式-油酸＞亞油酸甲酯＞順式-亞油酸＞棕櫚酸＞油酸甲酯。另外，根據(jù)混合型抑制劑的Ki和Kis值可以判斷抑制劑分別與酶、酶-底物復(fù)合物的親和程度，其中化合物1表現(xiàn)出與酶的親和力更好，說明抑制劑主要通過與酶結(jié)合發(fā)揮抑制作用；而化合物3則與酶-底物復(fù)合物的親和力更好，說明化合物3主要是通過與酶-底物復(fù)合物結(jié)合發(fā)揮抑制效果。

表4 主要成分對α-葡萄糖苷酶的抑制類型及抑制常數(shù)

圖2 化合物1～5對α-葡萄糖苷酶抑制活性的雙倒數(shù)曲線圖（a-e）

3 結(jié)論

已有文獻報道薏苡仁多糖的降血糖活性，而對于薏苡仁其他成分的降血糖活性少見報道，因此本文利用pNPG法對薏苡仁進行了α-葡萄糖苷酶抑制活性測試以探究其降血糖活性。經(jīng)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)其中的主要成分為棕櫚酸、反式-油酸、順式-亞油酸、順式-油酸甲酯、順式-亞油酸甲酯，對上述的5個化合物進行α-葡萄糖苷酶抑制活性測試及酶動力學(xué)探究發(fā)現(xiàn)它們對α-葡萄糖苷酶的抑制作用均明顯強于陽性對照阿卡波糖。酶動力學(xué)結(jié)果顯示：反式-油酸、順式-油酸甲酯和順式-亞油酸甲酯對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制，棕櫚酸和順式-亞油酸對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為混合性抑制；這5個化合物的抑制能力由強到弱依次為反式-油酸＞亞油酸甲酯＞順式-亞油酸＞棕櫚酸＞油酸甲酯。

薏苡仁中脂肪酸含量較高，且具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，為了進一步證明脂肪酸的降血糖活性，后期還需通過大量嚴格的體內(nèi)試驗、臨床試驗等的驗證，為薏苡仁的降血糖相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。