甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR檢測(cè)體系的建立

吳偉懷，劉寶慧，鹿鵬鵬，梁艷瓊，賀春萍，李銳，易克賢

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；3.海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，海口 570228）

0 引言

由黑頂柄銹菌（Puccinia melanocephalaSydow）引起的甘蔗褐銹病是甘蔗生產(chǎn)中較為嚴(yán)重的病害之一[1]。該病主要為害葉片，起初病斑為淡黃色小斑點(diǎn)，并伴有黃色暈圈，后期病斑擴(kuò)大，顏色變?yōu)樯詈稚Ｏ逆咦佣褳榧t褐色，大多數(shù)著生在葉背面，嚴(yán)重時(shí)，葉正面也可見(jiàn)紅褐色孢子堆。受害后的甘蔗分蘗減少，蔗莖變細(xì)[2]。在我國(guó)，甘蔗銹病在云南、四川、江西、福建和廣東等甘蔗產(chǎn)區(qū)發(fā)生，一般減產(chǎn)15%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)40%以上，使得蔗糖含量下降10%～36%[3]。過(guò)去，該病害的鑒定主要依賴(lài)常規(guī)的形態(tài)學(xué)并結(jié)合傳統(tǒng)的鑒別寄主法。該方法需經(jīng)過(guò)病原菌的分離（獲得）—形態(tài)鑒定—回接與再分離等過(guò)程，整個(gè)過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還需要具備專(zhuān)業(yè)的分類(lèi)學(xué)知識(shí)以及豐富的經(jīng)驗(yàn)。即使如此，其結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度易受外界因素的影響，難以滿(mǎn)足快速、高通量鑒定與檢測(cè)的實(shí)際需求。顯然，依靠上述方法是無(wú)法對(duì)甘蔗褐銹病早期發(fā)生情況進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定。所以有必要對(duì)甘蔗褐銹病菌的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)技術(shù)做進(jìn)一步的研究。

由巢式PCR（Nested PCR）基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)的單管巢式PCR（Single-tube nested PCR），其具體原理是在同一個(gè)PCR 管中加入兩對(duì)引物（外引物、內(nèi)引物對(duì)）以完成兩輪PCR 擴(kuò)增；擴(kuò)增所需反應(yīng)液組分與普通PCR 的一樣，只是在擴(kuò)增時(shí)外引物的退火溫度要高于內(nèi)引物對(duì)的退火溫度約10 ℃。這樣在第一輪外引物擴(kuò)增時(shí)，而此溫度下內(nèi)引物不能結(jié)合；隨后第二輪內(nèi)引物擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物為模板，內(nèi)引物在較低退火溫度擴(kuò)增時(shí)，此時(shí)外引物則因消耗完（控制外引物量）而不能進(jìn)行有效擴(kuò)增[4]。與巢氏PCR相比，單管巢氏PCR由于試驗(yàn)過(guò)程中不需要開(kāi)PCR 管操作，從而降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)[4]。目前該技術(shù)已在梨火疫病病原菌（Erwinia amylovora）[5]、母羊胎兒組織弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）[6]、貓屎胎三毛滴蟲(chóng)（Tritrichomonas foetus）[7]、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）[8]、谷物樣品鐮刀病菌（Fusarium culmorum）[9]、菠蘿凋萎?。≒ineapple mealybug wilt）[10]、內(nèi)臟利什曼?。╒isceral leishmaniasis）[11]、濃毒癥（Pythiosis）[12]、結(jié)核性腦膜炎（Tuberculous meningitis）[13]、人類(lèi)瘧原蟲(chóng)（Human plasmodium）[14]等病原物檢測(cè)中得以應(yīng)用。目前，針對(duì)甘蔗褐銹菌雖已建立了該病原菌的常規(guī)PCR[15-16]以及巢式PCR分子檢測(cè)方法[17]，但是關(guān)于該病原菌的單管巢式PCR的檢測(cè)體系尚未建立。為此，本文擬建立甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR檢測(cè)體系，為該病原菌的鑒定與檢測(cè)提供一種可靠的分子診斷技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試樣品DNA 共計(jì)16份，分別為甘蔗褐銹病菌（P.melanocephala）、甘蔗黃銹病菌（P.kuehnii）、咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）、橡膠炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、咖啡褐斑病菌（Cercospora coffeicola）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）各2 份，以及甘蔗黑穗病菌（Sporisorium scitamineum）、劍麻莖腐病菌（Aspergillus niger）、雞蛋花鞘銹菌（Coleosporium plumierae）、葡萄層銹病菌（Phakopsora ampelopsidis）各1份（表1）。

表1 供試菌株Table 1 Strains used in this study

其中甘蔗褐銹病菌Pm1與Pm2，經(jīng)提取核酸后檢測(cè)與克隆測(cè)序確認(rèn)為甘蔗褐銹病菌后，作為本試驗(yàn)的陽(yáng)性樣品；而來(lái)自甘蔗褐銹病菌Pm1 菌株的ITS 質(zhì)粒DNA 則作為靈敏度分析的DNA 模板；而其余甘蔗黃銹病菌、雞蛋花鞘銹菌、橡膠炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌、劍麻莖腐病菌、甘蔗黑穗病菌樣品、葡萄層銹病菌等DNA 樣品一起作為特異性分析模板。所有菌株DNA 樣品均保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA提取

甘蔗褐銹病菌DNA 的提取方法采用CTAB法提取[18]；其他供試菌株的DNA 提取均采用真菌DNA 提取試劑盒（E.Z.N.ATM Fungal DNA kit，Omega公司，美國(guó)）提取，具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒的參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 甘蔗褐銹病菌ITS重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用WHITE等設(shè)計(jì)的引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[19]對(duì)甘蔗褐銹病菌基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL∶dd H2O 14.3 μL，10×rTaqBuffer 2 μL，2.5 mmol/L d NTPs 1.6 μL，rTaqDNA Polymerase 0.1 μL，10 μmol/L 的上下引物各0.5 μL，30 ng/μL 模板DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃下預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸4 min，結(jié)束后保存于12 ℃。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收。取2 μL PCR 回收產(chǎn)物與pEASY-T1連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌培養(yǎng)（E.colitrans T1），經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性克隆后，用OMEGA 質(zhì)粒提取試劑盒提取構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司廣州實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)下載與甘蔗褐銹病菌ITS 序列同源性比較高的相關(guān)序列，比對(duì)獲得甘蔗褐銹病菌ITS 序列的保守區(qū)域?；趩喂艹彩絇CR 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)原理：一般外引物退火溫度高于內(nèi)引物10 ℃左右，以所獲得Pm1 菌株ITS 序列為參考，利用Primer explorer 5.0 在線(xiàn)軟件針對(duì)多態(tài)性豐富特異性區(qū)域設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)好的引物委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司廣州合成部合成。

1.2.4 外引物與內(nèi)引物最佳退火溫度篩選

為了確認(rèn)甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 最佳的退火溫度，對(duì)所設(shè)計(jì)的內(nèi)引物進(jìn)行52～66 ℃梯度退火溫度擴(kuò)增，篩選出最佳退火溫度；在內(nèi)引物最佳退火溫度的基礎(chǔ)上，對(duì)外引物設(shè)置61～73 ℃梯度退火溫度，從中篩選出高于內(nèi)引物最佳退火溫度大約10 ℃的外引物最佳退火溫度。

上述擴(kuò)增均采用20 μL 反應(yīng)體系，其具體程序與參數(shù)同1.2.2。內(nèi)引物的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，梯度退火溫度52～66 ℃10 s，72 ℃延伸25 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸4 min，12 ℃保存。外引物的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，梯度退火溫度61～73 ℃10 s，72 ℃延伸25 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸4 min，12℃保存。

1.2.5 外引物與內(nèi)引物最佳濃度比篩選

單管巢式PCR 正常運(yùn)轉(zhuǎn)的第二個(gè)條件即為：通過(guò)外引物與內(nèi)引物量的不同而到達(dá)控制外引物擴(kuò)增。具體而言，在第一輪擴(kuò)增中（外引物擴(kuò)增）引物消耗殆盡后，內(nèi)引物則以外引物產(chǎn)生的模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。為此，以篩選出的外、內(nèi)最佳退火溫度為基礎(chǔ)，設(shè)置外引物為1 nmol/L、10 pmol/L、0.1 pmol/L、10 fmol/L、1 fmol/L、0.1 fmol/L 6個(gè)不同的濃度，內(nèi)引物設(shè)置為10 μmol/L，交叉組合進(jìn)行單管巢式PCR濃度比試驗(yàn)。

1.2.6 特異性分析及驗(yàn)證

選取甘蔗褐銹病菌、甘蔗黃銹病菌、咖啡駝孢銹菌、橡膠炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌菌株各2 株，以及雞蛋花鞘銹菌、葡萄層銹菌、甘蔗黑穗病菌、劍麻莖腐病菌株各1株，以上述16份菌株DNA為模板，并以dd H2O 為陰性對(duì)照。對(duì)所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系進(jìn)行特異性分析。PCR 反應(yīng)體系以及反應(yīng)程序以1.2.4和1.2.5最終確定的條件為準(zhǔn)。

選用EcoRI酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。酶切體系（20 μL）：10×Quick CutBuffer2 μL、PCR產(chǎn)物8 μL、EcoRI 1.5 μL、dd H2O 8.5 μL。酶切程序：37 ℃3 h 30 min，65 ℃30 min。酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.7 靈敏度分析

利用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000c）將質(zhì)粒DNA 初始濃度調(diào)整為10 ng/μL，采用梯度稀釋法對(duì)DNA 進(jìn)行100～10-6倍的稀釋?zhuān)詃d H2O 為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR 檢測(cè)。采用優(yōu)化后的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系，進(jìn)行靈敏度分析。并利用PmF2/R2 進(jìn)行普通PCR 靈敏度檢測(cè)，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考1.2.4和1.2.5。

1.2.8 田間疑似病樣采集與DNA提取

從廣東湛江農(nóng)墾東方紅農(nóng)場(chǎng)甘蔗地收集疑似甘蔗褐銹病病葉，采用CTAB 法提取葉片總DNA，以進(jìn)行單管巢式PCR檢測(cè)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR的引物設(shè)計(jì)

將甘蔗褐銹病菌ITS 序列與下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中包括銹菌目10 個(gè)科14 個(gè)屬的24 條同源序列通過(guò)DNAStar 軟件以及在MultAlin 網(wǎng)站上（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin.html）進(jìn)行多重比對(duì)。結(jié)果表明，甘蔗褐銹病菌ITS 序列與其它菌株序列存在差異區(qū)域，最終根據(jù)差異區(qū)域設(shè)計(jì)了外引物對(duì)PmF1/R1 與內(nèi)引物對(duì)PmF2/R2，二者預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為433 bp、266 bp（表2）。

表2 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 引物Table 2 Single-tube nested PCR primers for P.melanocephala

2.2 內(nèi)引物與外引物的最佳退火溫度

根據(jù)已合成引物的預(yù)期退火溫度，將內(nèi)引物對(duì)PmF2/R2設(shè)置為52～66 ℃8 個(gè)梯度退火溫度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果表明，在供試的8 個(gè)退火溫度中，內(nèi)引物PmF2/R2 在退火溫度為52～57.3 ℃時(shí)，均能擴(kuò)增出特異目的條帶；退火溫度為60.5 ℃時(shí)未擴(kuò)增出特異性目的條帶。因此，內(nèi)引物的最高退火溫度為57.3 ℃。據(jù)此，選取52 ℃作為內(nèi)引物的最佳退火溫度，開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)（圖1）。

圖1 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR內(nèi)引物最佳退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature for internal single-tube nested primers for P.melanocephala

同理，根據(jù)已合成引物的預(yù)期退火溫度，將外引物設(shè)置為61～73 ℃8 個(gè)梯度退火溫度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有退火溫度為61～63.4 ℃時(shí)能擴(kuò)增出清晰且特異條帶，退火溫度為65.5 ℃時(shí)，所擴(kuò)增出的條帶較微弱，而其余4 個(gè)退火溫度均未出現(xiàn)目的條帶（圖2）。而內(nèi)引物在退火溫度60.5 ℃及其以上時(shí)，并不能有效擴(kuò)增。換言之，只有外引物退火溫度為60.5 ℃及以上時(shí)，方可到達(dá)單管巢式PCR 中外引物有效擴(kuò)增。當(dāng)退火溫度為63.4 ℃，條帶最為清晰，所以，選取63 ℃作為外引物的最佳退火溫度。

圖2 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR外引物最佳退火溫度優(yōu)化Fig.2 Annealing temperature of single-tube nested PCR outer-primers for P.melanocephala

2.3 單管巢式PCR檢測(cè)體系外、內(nèi)引物最佳濃度比

通過(guò)設(shè)置外引物為1 nmol/L、10 pmol/L、0.1 pmol/L、10 fmol/L、1 fmol/L、0.1 fmol/L 6個(gè)濃度梯度，將內(nèi)引物濃度設(shè)為10 μmol/L，篩選可進(jìn)行單管巢式PCR 外引物的有效量。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試的6 個(gè)不同外內(nèi)引物濃度比中，均能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶（圖3）。從清晰度角度考慮，當(dāng)引物濃度為10 pmol/L 時(shí)，肉眼可見(jiàn)條帶最為清晰明亮，所以將外引物的最佳濃度定位10 pmol/L。因此，外內(nèi)引物的最佳終濃度比為0.5 pmol/L∶0.5 μmol/L。

圖3 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR外內(nèi)引物最佳濃度篩選Fig.3 Screening of optimal concentration of outer and inner primers for single tube nested PCR for P.melanocephala

2.4 單管巢式PCR檢測(cè)體系特異性分析

利用所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系，對(duì)2份甘蔗褐銹病菌，以及14份其它非甘蔗褐銹病菌株DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證其真實(shí)性。試驗(yàn)結(jié)果表明，只有DNA 模板為甘蔗褐銹病菌時(shí)，可產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的清晰且特異的目的條帶，而其它14 株非甘蔗褐銹病菌DNA 均未擴(kuò)增出目的條帶（圖4）。同時(shí)，擴(kuò)增出的甘蔗褐銹病菌PCR 產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI酶切驗(yàn)證，其酶切產(chǎn)物電泳出112 bp清晰條帶（圖5）。由此表明，所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR檢測(cè)體系具有高度的特異性。

圖4 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR特異性分析Fig.4 Specificity analysis of single-tube nested PCR for P.melanocephala

圖5 甘蔗褐銹病菌PCR產(chǎn)物酶切Fig.5 PCR product digestion of P.melanocephala

2.5 靈敏度效果分析

單管巢式PCR 靈敏度結(jié)果顯示，在供試的8 個(gè)模板濃度中，前7 個(gè)模板的擴(kuò)增條帶強(qiáng)弱隨其濃度的降低而依次變?nèi)?。?dāng)質(zhì)粒模板濃度為10 fg/μL時(shí)，檢測(cè)出的目的條帶最弱；而當(dāng)質(zhì)粒模板濃度大于10 fg/μL時(shí)，則檢測(cè)不出目的條帶。由此表明，所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系的最低檢測(cè)濃度為10 fg/μL（圖6A）。比較而言，普通PCR 的最低檢測(cè)濃度為10 pg/μL（圖6B）。所以，本試驗(yàn)所開(kāi)發(fā)的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR反應(yīng)體系的最低檢測(cè)終濃度（10 fg/μL）是常規(guī)PCR最低檢測(cè)終濃度（10 pg/μL）的1 000倍。

圖6 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR靈敏度檢測(cè)Fig.6 Sensitivity detection of single-tube nested for P.melanocephala

2.6 田間疑似病樣分子鑒定

對(duì)田間采集的19 份疑似病樣進(jìn)行了單管巢式PCR 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，其中18 份樣品經(jīng)檢測(cè)均擴(kuò)增出唯一條帶，其大小與預(yù)期的266 bp 一致。利用EcoRI 酶對(duì)18 份樣品PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切結(jié)果表明，所有樣品PCR 產(chǎn)物均可酶切出預(yù)期大小的目的條帶?？傊?，采集的19份疑似病樣經(jīng)單管巢式PCR 檢測(cè)后，其中18份樣品DNA 中均含有甘蔗褐銹病菌（表3）。

表3 田間疑似病樣的分子檢測(cè)Table 3 Molecular detection of suspected disease samples in the field

3 討論與結(jié)論

隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，許多技術(shù)用于病原微生物的分子檢測(cè)中。巢式PCR 檢測(cè)技術(shù)由于通過(guò)兩輪PCR 的擴(kuò)增而大大提高了檢測(cè)的靈敏性，也正是通過(guò)第一輪擴(kuò)增而產(chǎn)生的非特異性序列，由于不包含第二輪引物的擴(kuò)增位點(diǎn)以致于其特異性也大大提高[4]。正因?yàn)槌彩絇CR 具有較好的特異性與靈敏度，已被廣泛應(yīng)用。然而，巢式PCR 在以第一輪PCR產(chǎn)物作為模板擴(kuò)增過(guò)程中其被潛在污染的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。為此，基于巢式PCR改善而來(lái)的單管巢式PCR能很好地克服該缺點(diǎn)。

分子檢測(cè)技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的前提條件就是高質(zhì)量的引物。換言之，開(kāi)發(fā)出高度特異引物對(duì)是分子檢測(cè)技術(shù)賴(lài)以生存的首要條件[20-21]。為此，在本研究中通過(guò)對(duì)銹菌目10 個(gè)科14個(gè)屬的24 條ITS 序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)甘蔗褐銹病菌ITS區(qū)域與其它非甘蔗褐銹病菌存在一段特異區(qū)域?；谠撎禺愋詤^(qū)域，結(jié)合單管巢式PCR 引物設(shè)計(jì)原則中外引物對(duì)與內(nèi)引物對(duì)退火溫度的要求，最終設(shè)計(jì)了單管巢式PCR 嵌套式引物對(duì)PmF1/R1與PmF2/R2，二者退火溫度預(yù)期相差約15 ℃。這為甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。

單管巢式PCR 檢測(cè)技術(shù)得以運(yùn)行的關(guān)鍵因素之一，即外引物的退火溫度必須高于內(nèi)引物的退火溫度10 ℃以上[10]。為此，本試驗(yàn)對(duì)設(shè)計(jì)的2對(duì)引物外引物與內(nèi)引物的實(shí)際退火溫度進(jìn)行了篩選。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，最終篩選出甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR分子檢測(cè)技術(shù)的外引物與內(nèi)引物的退火溫度分別為63 ℃與52 ℃。

在單管巢式PCR 檢測(cè)中，外引物與內(nèi)引物量的比例是建立該檢測(cè)體系的又一關(guān)鍵因素[4]。為此，本研究對(duì)外引物對(duì)PmF1/R1 與內(nèi)引物PmF2/R2 對(duì)之間的比例進(jìn)行了篩選與優(yōu)化。經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果表明甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)技術(shù)外引物與內(nèi)引物的最佳比例為0.5 pmol/L∶0.5 μmol/L。盡管單管巢式PCR 檢測(cè)技術(shù)體系中外引物與內(nèi)引物的比例是十分關(guān)鍵的，但是針對(duì)不同引物其最佳引物比例也是不同的。如母羊胎兒組織勾形蟲(chóng)外內(nèi)引物終濃度比例為0.01 μmol/L∶0.4 μmol/L[6]，谷物樣品鐮刀病菌外內(nèi)引物終濃度比0.1 fmol/L∶1 pmol/L[9]，菠蘿凋萎病外內(nèi)引物濃度比為2 pmol/L∶0.2 nmol/L[10]，貓屎胎三毛滴蟲(chóng)外內(nèi)引物濃度比為12.5 fmol/L∶0.25 pmol/L[7]?？偠灾?，單管巢式PCR 檢測(cè)技術(shù)體系中外引物與內(nèi)引物的比例是十分關(guān)鍵的，但針對(duì)不同引物，其最佳比例也不同。

本研究先后對(duì)建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系的特異性、靈敏度等方面進(jìn)行了測(cè)定。特異性結(jié)果顯示：該檢測(cè)體系只能從含有甘蔗褐銹病菌的DNA 模板中檢測(cè)出目的條帶，其它非同屬不同種的模板DNA 沒(méi)有產(chǎn)生任何條帶，具有高度的特異性。靈敏度結(jié)果顯示，甘蔗褐銹病菌單管巢式的靈敏度可達(dá)10 fg/μL。這一結(jié)果與結(jié)核性腦膜炎單管巢氏的靈敏度（1 fg/μL）[13]、霍亂弧菌的靈敏度（1 fg/μL）[8]相當(dāng)，但是要比菠蘿凋萎病菌單管巢氏的靈敏度（0.95 pg/μL）[10]、膿毒癥病原菌（Pythium insidiosum）單管巢氏的靈敏度（2.7 pg/μL）[12]均要靈敏。最后利用該檢測(cè)技術(shù)，對(duì)19 份疑似病樣進(jìn)行了檢測(cè)，其中18份樣本DNA 中均檢測(cè)出甘蔗褐銹病菌。由此可見(jiàn)，本研究所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系具有高度的特異性、靈敏性以及實(shí)用性。