生物可降解封堵器中錫殘留量的檢測(cè)方法

向有緣,王書(shū)晗,彭俊,柯浩奇

（深圳市藥品檢驗(yàn)研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心），廣東 深圳 518052）

封堵器屬于一種植入物用器械，被廣泛應(yīng)用于房間隔缺損、室間隔缺損等常見(jiàn)先天性心臟病的臨床介入治療中［1］。采用鎳鈦金屬材料制備的封堵器在應(yīng)用中會(huì)有引發(fā)后期并發(fā)癥的不良效用，且存在著手術(shù)治療上的限制［1-2］。為了盡可能地減少封堵器在植入后產(chǎn)生的多種不良并發(fā)癥，同時(shí)保證封堵器的較好治療效果，采用生物可降解材料制備的生物可降解封堵器在近年來(lái)的研究和應(yīng)用中引起了較多關(guān)注［2］。聚乳酸（Polylactic acid，PLA）作為一類新型的可吸收無(wú)毒生物醫(yī)用材料，在人體內(nèi)具有較好的生物相容性和生物降解性能，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用方面有著廣闊的應(yīng)用前景［3-5］。采用PLA 材料制備的可吸收房間隔缺損封堵器，具有較好的生物可降解性能，屬于一類生物可降解封堵器產(chǎn)品。聚乳酸也被稱為聚丙交酯，通常采用乳酸合成丙交酯和丙交酯開(kāi)環(huán)聚合兩步流程來(lái)合成［6-7］。用于開(kāi)環(huán)聚合過(guò)程的催化劑種類較多，其中含錫化合物是常用的一種，如辛酸亞錫［8］、四苯基錫［9］等。在精制工藝去除含錫催化劑的過(guò)程中，錫殘留量過(guò)多會(huì)影響植入物用PLA 的生物相容性和生物降解性能，且人體內(nèi)錫的殘留累積到一定程度時(shí)引起腸胃疾病的幾率較大。因此，為保證生物可降解封堵器產(chǎn)品的質(zhì)量符合使用要求，降低植入物用PLA 的健康風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)估測(cè)定生物可降解封堵器產(chǎn)品中的錫殘留量尤為重要。

目前，對(duì)于PLA 中錫殘留量的測(cè)定方法已有相關(guān)報(bào)道，但大多是對(duì)于原材料中殘留錫的檢測(cè)，較少對(duì)于PLA 材質(zhì)產(chǎn)品中錫殘留量檢測(cè)方法的研究。已報(bào)道的相關(guān)研究中，鄧翎等［10］使用火焰原子吸收光譜法建立了測(cè)定聚乳酸基外科植入物中殘留錫的分析方法，趙國(guó)琴等［11］探索了一種適用于測(cè)定聚乳酸輔料中錫殘留量的苯芴酮光度法，王世亮等［12］建立了一種可用于測(cè)定藥用輔料聚乳酸中殘留錫的石墨爐原子吸收光譜法。對(duì)于PLA 材質(zhì)生物可降解封堵器中錫殘留量的測(cè)定相比文獻(xiàn)中對(duì)輔料PLA中錫殘留量測(cè)定更加具有實(shí)際意義，降低原材料應(yīng)用的安全風(fēng)險(xiǎn)更加具有針對(duì)性。對(duì)于產(chǎn)品中殘留錫的安全限量值，已有國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，其中食品中錫的限量值為250 mg?kg?1、飲料類的錫限量值為150 mg?kg?1［13］。PLA 中催 化劑殘留錫的限 量值也有行業(yè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0661-2017 和YY/T 0510-2009 做了嚴(yán)格的規(guī)定，其中外科植入物用聚乳酸樹(shù)脂中的殘 留錫限 量值應(yīng) 不大于150 μg?g?1［14-15］。同時(shí)，使用該材料生產(chǎn)的生物可降解封堵器產(chǎn)品中錫殘留量也應(yīng)低于原材料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中錫的殘留限量值。

先采用微波消解方式對(duì)PLA 材料生物可降解封堵器進(jìn)行消解，通過(guò)微波快速升溫及密閉系統(tǒng)內(nèi)部高壓消解有效結(jié)合，避免了封堵器中殘留微量錫元素的揮發(fā)損失。另外，微波消解也具有用酸量少、消解時(shí)間短、消解效率高的優(yōu)點(diǎn)，該法使用廣泛，能夠很好地滿足封堵器中錫殘留量測(cè)定的樣品前處理要求［16-17］。然后采用石墨爐原子吸收法（GFAAS）和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES），對(duì)封堵器中的錫殘留量進(jìn)行測(cè)定。最后通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證評(píng)估了測(cè)定方法的可行性和準(zhǔn)確性，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比試驗(yàn)評(píng)估了產(chǎn)品的符合性。兩種檢測(cè)方法具有測(cè)試快捷、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)［18-19］，檢出限和定量限較低，精密度和回收率均滿足中國(guó)藥典2020 年版中的相關(guān)要求。GFAAS 法和ICP-AES法，可為測(cè)定生物可降解封堵器中錫殘留量的標(biāo)準(zhǔn)方法研究，以及方法精密度和準(zhǔn)確度評(píng)定提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

樣品為聚乳酸材質(zhì)可吸收房間隔缺損封堵器（生產(chǎn)有效期內(nèi)的產(chǎn)品）。試劑為錫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，1000 μg?mL?1），硝酸（市售產(chǎn)品，優(yōu)級(jí)純），磷酸二氫銨（市售產(chǎn)品，優(yōu)級(jí)純）。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器：原子吸收分光光度計(jì)（PerkinElmer，Pi?nAAcle 900T），電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES，PerkinElmer，Avio 200）。

設(shè)備：微波消解系統(tǒng)（CEM，MARS5），純水器（Milli-Q Gradient），電子天平（瑞士梅特勒-托利多，MS 204S/01），錫 無(wú) 極 放 電 燈（PerkinElmer，N3050675）。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.1 g 封堵器產(chǎn)品試樣，加入微波消解罐中，同時(shí)加入5 mL 硝酸，按照消解程序（表1）消解試樣。消解完成并冷卻后將消解液轉(zhuǎn)至25 mL 容量瓶中，使用少量的硝酸（濃度2%）洗滌消解罐3次，合并洗滌液，用2%的硝酸定容至刻度。隨后，根據(jù)測(cè)定需要稀釋消解液，作為試樣待測(cè)液。同法制備試樣空白、平行樣。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedures

1.4 儀器工作條件

GFAAS 法工作條件：波長(zhǎng)286.33 nm，狹縫0.7 nm，積分方式為峰面積，積分時(shí)間3.0 s，燈電流225 mA，原子化溫度2200 ℃，背景校正方式為塞曼。

ICP-AES 法工作條件：波長(zhǎng)189.927 nm，延遲時(shí) 間30 s，氣 體 流 速12 L ?min?1，輔 助 氣 流 速0.2 L?min?1，霧化氣流速0.6 L?min?1，高頻發(fā)生器功率1300 W。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.5.1 GFAAS 法

用2%硝酸逐級(jí)稀釋錫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制濃度為100 μg?L?1的校準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備溶液。先將原子吸收分光光度計(jì)開(kāi)機(jī)，預(yù)熱待測(cè)錫元素?zé)簦M(jìn)行石墨爐優(yōu)化。選擇磷酸二氫銨作為測(cè)試時(shí)的基體改進(jìn)劑，儀器自動(dòng)稀釋濃度為0、20、40、60、80、100 μg?L?1的系列錫標(biāo)準(zhǔn)溶液。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中錫的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，經(jīng)線性擬合建立校準(zhǔn)曲線。

1.5.2 ICP-AES 法

分別配置0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg?L?1的不同濃度系列錫標(biāo)準(zhǔn)溶液。先將ICP-AES 開(kāi)機(jī)預(yù)熱，點(diǎn)燃等離子體，待其運(yùn)行穩(wěn)定后，完成光譜初始化。將系列錫標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度由低到高的順序分別由蠕動(dòng)泵吸入，儀器自動(dòng)測(cè)定各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的特征譜線強(qiáng)度值。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中錫的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的譜線強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，經(jīng)線性擬合建立校準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 GFAAS 法測(cè)定生物可降解封堵器產(chǎn)品中錫殘留量

2.1.1 校準(zhǔn)曲線及方法檢出限和定量限

在儀器最佳測(cè)試條件下，每個(gè)濃度的溶液平行測(cè)定2 次，取其平均值作為該點(diǎn)的吸光度值，擬合得到校準(zhǔn)曲線如圖1 所示。從圖1 可見(jiàn)，隨著溶液中錫濃度升高，對(duì)應(yīng)吸光度值也在逐漸變大。錫濃度與對(duì)應(yīng)吸光度值呈現(xiàn)出了較好的線性關(guān)系，線性回歸方 程 為y=0.0043x+2×10?5，線 性 相 關(guān) 系 數(shù) 為0.999 638。

圖1 GFAAS 法的校準(zhǔn)曲線Figure 1 Calibration curve for GFAAS method

按照樣品分析步驟，對(duì)空白溶液進(jìn)行平行測(cè)定11 次。以3 倍的測(cè)試值標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)含量計(jì)算出該方法的檢出限，以10 倍的測(cè)試值標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)含量計(jì)算出該方法的檢出限和定量限，檢出限為0.29 μg?L?1、定量限為0.97 μg?L?1。

2.1.2 方法精密度（RSD）及回收率

在儀器最佳測(cè)試條件下，對(duì)同一測(cè)試溶液做7次平行測(cè)定，錫含量的測(cè)試結(jié)果分別為19.36、19.20、19.56、19.82、19.14、19.25、18.99 μg?L?1，平均值為19.33 μg?L?1，RSD（n=7）為1.45%。

回收率試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果列于表2。由表2 可知，回收率的平均值為103.8%，RSD（n=6）為1.19%。依據(jù)中國(guó)藥典（2020 年版 第四部），對(duì)待測(cè)定成分含量100 μg?g?1的加標(biāo)回收率限度為85%—110%，測(cè)試回收率結(jié)果滿足檢測(cè)要求。

表2 GFAAS 法回收率測(cè)試結(jié)果表Table 2 Recovery results for GFAAS method

2.2 ICP-AES 法測(cè)定生物可降解封堵器產(chǎn)品中錫殘留量

2.2.1 校準(zhǔn)曲線及方法檢出限和定量限

在儀器最佳測(cè)試條件下，對(duì)系列溶液進(jìn)行測(cè)試，經(jīng)擬合得到校準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2 所示。從圖2 可見(jiàn)，錫濃度與對(duì)應(yīng)特征譜線強(qiáng)度值呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=1.0001x－0.0002，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 968。

圖2 ICP-AES 法的校準(zhǔn)曲線Figure 2 Calibration curve for ICP-AES method

按照樣品分析步驟，制備出空白溶液并平行測(cè)定11 次，由測(cè)試結(jié)果計(jì)算得到該方法的檢出限和定量 限，檢 出 限 為2.68 μg ?L?1、定 量 限 為8.94 μg ?L?1。

2.2.2 方法精密度及回收率

在儀器最佳測(cè)試條件下，對(duì)同一試樣做6 次平行測(cè)定，錫含量的測(cè)試結(jié)果分別為0.239、0.233、0.224、0.227、0.223、0.230 mg ?L?1，平 均 值 為0.229 mg?L?1，RSD（n=6）為2.63%?；厥章试囼?yàn)測(cè)試結(jié)果列于表3。由表3 可知，回收率的平均值為96.1%，RSD（n=6）為1.39%。

表3 ICP-AES 法回收率測(cè)試結(jié)果表Table 3 Recovery results for ICP-AES method

2.3 封堵器產(chǎn)品中錫殘留量測(cè)定及檢測(cè)方法的比較分析

每種分析方法平行測(cè)定兩個(gè)試樣，取兩者的平均值作為最終的錫殘留量測(cè)定值，結(jié)果列于表4。由表4 可知，GFAAS 法測(cè)得的錫殘留量為27 μg ?g?1，而ICP-AES 法 測(cè) 得 的 錫 殘 留 量 為31 μg ?g?1。

表4 生物可降解封堵器產(chǎn)品中錫殘留量測(cè)定結(jié)果表Table 4 Determination results of tin residues in biodegradable occluder products

采用GFAAS 法和ICP-AES 法測(cè)定生物可降解封堵器中殘留錫含量，在儀器最佳測(cè)試條件下得到的校準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999 以上，滿足了樣品測(cè)試所需的線性條件。兩種分析方法所測(cè)得的檢出限和定量限較低，表明兩種方法均能夠滿足樣品中微量殘留錫的測(cè)定。GFAAS 法所得的檢出限和定量限明顯低于ICP-AES 法的，表明GFAAS 法測(cè)試含量范圍更寬。兩種分析方法的精密度值均小于5%，表明兩種方法均可滿足樣品分析所需精密度的要求，而GFAAS 法的精密度更好。兩種分析方法的回收率平均值均在85%—110%之間，GFAAS 法的回收率相對(duì)ICP-AES 法更高，回收率的精密度值小于5%，符合樣品分析所需的回收率范圍條件。

3 結(jié)論

通過(guò)微波消解的方式對(duì)樣品進(jìn)行前處理，采用GFAAS 法和ICP-AES 法測(cè)定產(chǎn)品中的錫殘留量，測(cè)試方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、可行性較好，適用于生物可降解封堵器中微量殘留錫的測(cè)定。GFAAS法及ICP-AES 法測(cè)得封堵器中錫殘留量分別為27和31 μg ?g?1，均 低 于 行 業(yè) 標(biāo) 準(zhǔn) 中 的 限 量 值150 μg ?g?1，產(chǎn) 品 滿 足 使 用 要 求 及 安 全 要 求。相 比 于ICP-AES 法，GFAAS 法檢出限和定量限更低，方法精密度更好，且實(shí)際應(yīng)用中的儀器設(shè)備價(jià)格更低、維護(hù)成本也相對(duì)較低，更加適用于生物可降解封堵器中錫殘留量的測(cè)定。