矮緊型、抗病同源四倍體不結(jié)球白菜矮樁秋冠新材料創(chuàng)制

王新雅 陳文麗 李竹帛 楊 陽 侯喜林 柳李旺 劉同坤,*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095；2 南京理想農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇 南京 210095)

不結(jié)球白菜(Brassicacampastrisssp.chinensisMakino)屬十字花科蕓薹屬白菜亞種中的變種，原產(chǎn)于我國，品種繁多，主要在長江中下游地區(qū)種植，因其生長周期短、品質(zhì)好，富含可溶性糖、可溶性蛋白、有機酸、氨基酸及人體所需的微量元素，受到人們的廣泛喜愛，在長江中下游的年均消費量約占全年蔬菜總產(chǎn)量的1/3[1]。近年來，北方地區(qū)也大量引進種植不結(jié)球白菜，目前不結(jié)球白菜在我國蔬菜的周年供應(yīng)中占有重要地位，不結(jié)球白菜的多倍體育種為不結(jié)球白菜種質(zhì)創(chuàng)新和新品種培育奠定了基礎(chǔ)。

蔬菜多倍體育種已有80余年的歷史[2]。多倍體植物的成功誘變，為我國蔬菜作物的生產(chǎn)與發(fā)展提供了一條全新的途徑。多倍體育種也是提高植物營養(yǎng)品質(zhì)、增強抗逆性的有效方法之一[2]。多倍體植物抗逆性強、綜合性狀優(yōu)良，使得多倍體育種變得越來越重要[3]。在生產(chǎn)和試驗中，多倍體的誘導(dǎo)方法主要包括物理方法、化學方法和生物方法。但由于誘變效果普遍偏低，物理方法誘導(dǎo)已經(jīng)完全被化學方法誘導(dǎo)所取代[4]。化學方法誘導(dǎo)主要包括秋水仙素和其他植物激素處理。秋水仙素因其誘變效果較好、操作簡單、處理方法多樣、成本低，在植物育種中廣泛用于誘導(dǎo)多倍體，是最常用的化學誘變試劑[5]。近年來，秋水仙素已成功誘導(dǎo)出歐洲溫室黃瓜[6]、矮牽牛[7]、油菜[8]、甜葉菊[9]、青花菜[10]和不結(jié)球白菜六合矮腳黃[11]等多種植物的多倍體植株。前人研究用濃度為0.2%的秋水仙素分別處理豇豆子葉生長點[12]、二倍體蘿卜滿堂紅子葉生長點、二倍體不結(jié)球白菜超華一號莖尖生長點[13]和二倍體蘿卜小頂紅子葉生長點[14]，已成功誘導(dǎo)出多倍體植株，誘變率分別為2.809%、4.79%、6.44%和4.76%。

多倍體鑒定的常用方法包括形態(tài)學鑒定、解剖學鑒定、細胞學鑒定、流式細胞儀鑒定等。形態(tài)學和解剖學鑒定能夠初步篩選出疑似四倍體植株；染色體計數(shù)和流式細胞術(shù)是測定植物倍性水平的常規(guī)方法[15]。流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是近年來新興的檢測技術(shù)，通過使用流式細胞儀檢測細胞核DNA含量，經(jīng)計算機統(tǒng)計分析，繪制分布曲線圖[16]。流式細胞術(shù)效率高、速度快、準確度高、重復(fù)性好，目前已通過該方法在百合[17]、草莓[18]、中華獼猴桃[19]等植物上成功鑒定出同源四倍體植株，但是不同植物品種利用流式細胞儀鑒定植株倍性時，在處理方法上會有所不同[20]。

矮樁秋冠是十字花科不結(jié)球白菜中的一個優(yōu)良品種，葉片肥厚，植株矮壯，開展度較大，具有豐富的營養(yǎng)價值。四倍體植株相較于二倍體普遍具有巨大性，品質(zhì)更高，抗病能力更強。作為以葉、莖為食用部位的蔬菜，不結(jié)球白菜四倍體植株能夠提高其產(chǎn)量和商業(yè)價值。鑒于此，本研究利用秋水仙素處理矮樁秋冠二倍體植株，通過形態(tài)學、解剖學、細胞學特征和使用流式細胞儀進行鑒定，并對篩選出的四倍體植株進行農(nóng)藝性狀統(tǒng)計及營養(yǎng)品質(zhì)鑒定，以期獲得優(yōu)質(zhì)同源四倍體植株，進一步提高矮樁秋冠的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用的材料為不結(jié)球白菜二倍體品種矮樁秋冠(2n=2X=20)多代自交系，由南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院白菜系統(tǒng)生物學實驗室提供。試驗于2019年9月—2020年11月在江蘇省鎮(zhèn)江市句容農(nóng)博園試驗基地進行。

1.2 同源四倍體不結(jié)球白菜誘導(dǎo)方法

本試驗使用濃度為0.2%秋水仙素溶液，采用點滴的方式對二倍體植株子葉期生長點進行處理。于子葉出土后每日上午9點與下午5點分別進行1次處理，共進行5次處理，每次處理秋水仙素溶液劑量為20 μL，以蒸餾水作為對照。

1.3 多倍體的鑒定方法

1.3.1 形態(tài)學鑒定 在植株成熟后，以二倍體植株為對照，在同一時間觀察誘變植株葉片、花器官、種子、植株高度等形態(tài)學性狀[21]，對誘變植株進行初步的篩選。

1.3.2 解剖學鑒定 以氣孔和花粉粒的大小、形狀為依據(jù)，氣孔鑒定：選取疑似四倍體植株的完全展開葉，避開葉脈，撕取葉片下表皮，在光學顯微鏡(DM6B,Leica)下進行觀察，并對氣孔進行拍照?；ǚ哿ｈb定：以二倍體花粉粒為參照，在顯微鏡下進行大小和形狀的比較，多倍體花粉粒多呈現(xiàn)不規(guī)則形狀[22]，觀察疑似植株花粉粒是否在大小和形態(tài)上與對照植株存在差異。

1.3.3 細胞學鑒定 將收取的疑似同源四倍體植株的種子進行催芽。將種子放置在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃恒溫條件下進行催芽。待種子根尖生長至1～2 cm時，將根尖切下放置在1.5 mL離心管中，冰水混合物預(yù)處理24 h后，卡諾試劑(無水乙醇∶冰醋酸為3∶1)固定24 h，隨后取出根尖放入蒸餾水中洗凈固定液。使用1 mol·L-1鹽酸在60℃條件下解離3～5 min，切取1～2 mm根尖制片，卡寶品紅染液染色10 min后，在顯微鏡下觀察并對染色體進行拍照[23]。

1.3.4 流式細胞儀倍性分析 采用流式細胞儀對細胞核內(nèi)的DNA相對含量進行測定。從矮樁秋冠疑似植株上取0.1 g新鮮幼嫩葉片放置于預(yù)冷的玻璃培養(yǎng)皿中，加入1 mL解離液(200 mmol·L-1Tris，4 mmol·L-1MgCl2·6H2O，0.5% (v/v) TritonX-100，pH值7.5)，用預(yù)冷的刀片快速切碎，300目網(wǎng)過濾至1.5 mL離心管中，冰上孵育15 min，離心(4℃，4 000 r·min-1) 5 min，棄上清。重復(fù)3～5次，直至沉淀由綠色變?yōu)榘咨?。加入染色?0.5 mL Tris-MgCl2，10 μL RNase，7 μL碘化丙啶)混合均勻，4℃避光放置15 min后上機檢測[24]。

1.4 二、四倍體矮樁秋冠的農(nóng)藝性狀統(tǒng)計及營養(yǎng)品質(zhì)測定

1.4.1 農(nóng)藝性狀統(tǒng)計 將鑒定為同源四倍體的植株M0代蕾期單株套袋，自交授粉，單株收種。將M1代種子與對照組種子同時播種。各隨機選取10株二、四倍體矮樁秋冠植株進行株高、單株質(zhì)量、單葉質(zhì)量、十葉厚、全株葉數(shù)、葉長、葉寬、葉柄長、葉柄寬、葉柄厚等農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計。

1.4.2 營養(yǎng)品質(zhì)測定 各隨機選取3株二、四倍體矮樁秋冠植株同一部位的葉片，測定可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素、游離氨基酸、硝態(tài)氮以及纖維素含量等營養(yǎng)指標?？扇苄蕴呛繙y定采用蒽酮比色法使用MB-C-B602植物可溶性糖含量測試盒(邁博生物，廣州)；可溶性蛋白含量測定參考青格爾等[25]采用考馬斯亮藍G-250染色法；葉綠素含量測定參考甘勇輝等[26]采用乙醇提取比色法；有機酸測定參考肖平等[27]采用NaOH滴定法；硝態(tài)氮含量測定參考郭蕓琿等[28]采用硝基水楊酸比色法；纖維素含量測定使用CLL-2-Y纖維素含量測試盒(科銘生物，蘇州)測定。

1.5 光合特性分析

于晴天上午9:00—11:00，采用Li-6400便攜式光合儀(北京力高泰科技有限公司)對光響應(yīng)曲線進行測定，設(shè)定CO2濃度為400 μmol·mol-1，測定其在0、20、50、100、150、250、500、750、1 000、1 200、1 500、2 000 μmol·m-2·s-1光強下單位面積凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn)、蒸騰速率(transpiration rate Tr)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductivity, Gs)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration, Ci)，每個光強下停留2～3 min，分別測定3個葉片，作3次重復(fù)。根據(jù)回歸方程分別求出光飽和點(light saturation point, LSP)、光補償點(light compensation point, LCP)、最大凈光合速率(maximum net photosynthetic rate,Pmax)、表觀量子效率(apparent quantum efficiency, AQY)、暗呼吸速率(dark breathing rate, Rday)等光合指標[29]。

注：A：植株；B：葉片；C：花器官；D：種子；E、F：氣孔；G：莢果；H、I：花粉。Note: A: Plant. B: Leaf. C: Floral organ. D: Seed. E、F: Stomata. G: Silique. H、I: Pollen.圖1 二、四倍體不結(jié)球白菜差異對比Fig.1 Comparison of tetraploid and diploid plants of non-heading Chinese cabbage

1.6 二、四倍體矮樁秋冠的抗病性測定

將菌種接種在V8固體培養(yǎng)基(36% V8果汁，2% 瓊脂，0.2% CaCO3)上進行繼代培養(yǎng)，20～25℃恒溫避光條件下培養(yǎng)7～14 d。待培養(yǎng)皿內(nèi)長滿孢子后，用組培刀將菌絲刮下置于重懸液(1%蛋白胨，4%麥芽糖)中，劇烈震蕩以釋放孢子，再用紗布過濾出孢子，采用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)孢子濃度至1×107個·mL-1。離體接種葉片時，將孢子懸浮液均勻點斑在葉片上，每個葉片2個斑，體積為10 μL，接種后的葉片放置于含有濾紙的培養(yǎng)皿中，12 h/12 h光暗交替、光強為400 μmol·m-2·s-1、 25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察葉片發(fā)病情況。于接種3 d后，以二倍體矮樁秋冠為對照組，四倍體矮樁秋冠為試驗組，取對照組和試驗組葉片病斑周圍1 cm內(nèi)健康的組織，于-80℃條件下保存待測。采用實時熒光定量PCR 檢測受灰霉菌侵染的二倍體、四倍體矮樁秋冠中Botrytiscinereaactin的表達情況。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)利用Excel 2019對所得數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學與解剖學鑒定分析

如圖1所示，以二倍體為對照，同源四倍體植株開展度變小(圖1-A)；葉片變小、皺縮，葉色變淺，葉柄變短(圖1-B)；花瓣、雄蕊、柱頭、花萼相較于二倍體有所變大(圖1-C)；種子直徑增大(圖1-D)；顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，同源四倍體氣孔孔徑變大、保衛(wèi)細胞體積變大且單位面積密度變小(圖1-E、F)；種莢更為膨脹粗大(圖1-G)；二倍體花粉粒呈規(guī)則的棒狀，而同源四倍體的花粉粒呈現(xiàn)棒狀、矩形、菱形等多種不規(guī)則形狀(圖1-H、I)。

2.2 細胞學鑒定分析

取部分通過形態(tài)學和解剖學鑒定的疑似四倍體植株的種子進行催芽，在顯微鏡下觀察根尖細胞染色體數(shù)目，如圖2所示。二倍體染色體為2n=2X=20條，同源四倍體植株根尖染色體為2n=4X=40條證明本試驗成功誘變出同源四倍體矮樁秋冠植株，并成功收獲同源四倍體植株的種子。

2.3 流式細胞儀鑒定分析

由圖3可知，二倍體細胞核內(nèi)的DNA相對含量峰值在50處，同源四倍體相對含量峰值在100處，為二倍體的2倍，通過流式細胞儀鑒定結(jié)果可再次確定細胞核內(nèi)的DNA相對含量峰值在100處的植株為四倍體植株。

圖2 二、四倍體不結(jié)球白菜細胞學鑒定結(jié)果Fig.2 The cytological identification of diploid and tetraploid non-heading cabbage

圖3 二(左)、四(右)倍體不結(jié)球白菜流式細胞儀鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of diploid(left)and tetraploid (right) non-heading Chinese cabbage by flow cytometry

2.4 二、四倍體矮樁秋冠農(nóng)藝性狀測定

由表1可知，四倍體植株的單葉質(zhì)量、十葉厚分別比二倍體植株提高了13.71%、40.36%，有極顯著差異；四倍體植株的葉片數(shù)、葉寬、單株質(zhì)量、葉柄厚、葉柄寬、株高、葉長、葉柄長分別比二倍體降低了1.32%、8.15%、11.03%、12.35%、15.56%、25.47%、37.82%、39.97%，其中株高、葉長、葉柄長有極顯著差異。

2.5 二、四倍體矮樁秋冠營養(yǎng)品質(zhì)鑒定

由表2可知，四倍體矮樁秋冠可溶性糖、纖維素、葉綠素四倍體植株分別比二倍體植株降低了26.98%、43.48%、45.95%，其中纖維素含量和葉綠素總濃度有極顯著差異；硝態(tài)氮、可溶性蛋白、氨基酸含量分別比二倍體植株提高了0.47%、9.90%、14.16%，其中氨基酸有顯著差異。

表1 二、四倍體植株主要農(nóng)藝學性狀比較Table 1 Comparison of main agronomic traits of diploid and tetraploid plants

表2 二、四倍體矮樁秋冠營養(yǎng)品質(zhì)的比較Table 2 Comparison of content of nutritional substance between diploid and tetraploid non-heading cabbage

2.6 二、四倍體矮樁秋冠的光合特性分析

如圖4所示，四倍體矮樁秋冠的光合速率對光強升高的響應(yīng)明顯高于二倍體，且在高光強下表現(xiàn)出更高的凈光合速率，說明四倍體的光合作用效率大于二倍體(圖4-A)。相同光強下，四倍體植株葉片氣孔導(dǎo)度明顯大于二倍體，說明四倍體矮樁秋冠比二倍體具有更強的氣體交換能力(圖4-B)。四倍體植株蒸騰速率明顯高于二倍體，再次說明在強光下四倍體的氣體交換能力更強(圖4-C)。同一光強下，四倍體胞間CO2濃度高于二倍體，與四倍體光合作用強于二倍體的結(jié)果一致(圖4-D)。由表3可知，四倍體的LSP、AQY、Rday、Pmax分別比二倍體增加10.72%、16.07%、14.09%、29.19%，LCP比二倍體降低1.11%，其中AQY有顯著差異，LSP、Rday、Pmax、LCP具有極顯著差異。說明四倍體矮樁秋冠植株對光強升高的響應(yīng)以及光合作用能力均強于二倍體植株。

圖4 二、四倍體植株光合特性比較分析Fig.4 Comparative analysis of photosynthetic characteristics of diploid and tetraploid non-heading Chinese cabbage

表3 二、四倍體的光響應(yīng)曲線參數(shù)的比較Table 3 Comparison of the parameters of response curves of diploid and tetraploid plants

2.7 二、四倍體矮樁秋冠抗病測定

采用實時熒光定量PCR檢測受灰霉菌侵染的二倍體、四倍體矮樁秋冠中B.cinereaactin的表達情況并觀察二、四倍體不結(jié)球白菜葉片受到灰霉菌侵染時的表型性狀。表型結(jié)果如圖5所示，對比二、四倍體不結(jié)球白菜葉片受到灰霉菌侵染時的表型圖，四倍體葉片癥狀明顯輕于二倍體。B.cinereaactin在二倍體、四倍體中均有表達，但四倍體葉片的表達量低于二倍體(圖6)。

圖5 二、四倍體不結(jié)球白菜葉片受到灰霉菌侵染時的表型圖Fig.5 Phenotype of diploid and tetraploid non-heading Chinese cabbage leaves infected by Botrytis cinerea

圖6 二、四倍體不結(jié)球白菜受到灰霉菌侵染時B.cinerea actin在葉片中的定量表達Fig.6 Quantitative expression of B.cinerea actin in the leaves of diploid and tetraploid non-heading Chinese cabbage infected by Botrytis cinerea

3 討論

多倍體植株在園藝生產(chǎn)中普遍比二倍體植株具有更高的營養(yǎng)品質(zhì)、產(chǎn)量和抗逆性,目前誘導(dǎo)植物多倍化已經(jīng)在多種植物中得到廣泛應(yīng)用。前人研究發(fā)現(xiàn),多倍體植株在外觀形態(tài)上多出現(xiàn)巨大化現(xiàn)象，但不是所有的四倍體都會產(chǎn)生此現(xiàn)象。劉惠吉等[30]選育出的南農(nóng)矮腳黃四倍體植株表現(xiàn)出多倍體的巨大性，兩年的增產(chǎn)率達到22.6%和22.4%;但是袁建民等[31]誘導(dǎo)的四倍體小果型西瓜株型矮小緊湊,葉片肥厚,葉色深綠;何立珍等[32]誘導(dǎo)的同源四倍體黃花菜植株生長勢強植株矮小，莖部增粗;張曉曼等[33]誘導(dǎo)的同源四倍體田埂報春植株變矮,葉片變大變厚。本研究中,農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果顯示,四倍體植株的株高沒有出現(xiàn)巨大化現(xiàn)象,葉面積變小、葉片肥厚,整體株型矮小緊湊，單位面積產(chǎn)量有所提高,四倍體植株葉色變淺，與前人研究結(jié)果基本一致。營養(yǎng)品質(zhì)測定結(jié)果顯示,相較于二倍體，四倍體植株的氨基酸、有機酸、可溶性蛋白含量增加,葉綠素、可溶性糖、纖維素含量降低，說明四倍體部分營養(yǎng)品質(zhì)提高,且食用口感較好,說明四倍體植株在食用價值方面有所提高。

光合作用是植物進行物質(zhì)積累與生理代謝的基礎(chǔ)，其效率的高低與產(chǎn)量潛力發(fā)揮以及品質(zhì)優(yōu)劣密切相關(guān)。因此研究作物的光合作用對農(nóng)業(yè)育種工作具有重要意義[34]。植物光合能力影響植物對光的適應(yīng)能力，通過光強-光合響應(yīng)曲線分析比較二、四倍體的葉片光合生理特性，曲線擬合計算出的相關(guān)參數(shù)，進一步反映植物在不同光照條件下的適應(yīng)能力[35]。本試驗通過分析比較二、四倍體的光合特性發(fā)現(xiàn),四倍體矮樁秋冠植株對光強升高的響應(yīng)強于二倍體植株，四倍體擁有更強的光合作用能力，有利于干物質(zhì)的積累。四倍體植株的LSP、AQY、Rday、Pmax均高于二倍體，LCP低于二倍體。研究中使用植物LSP和LCP作為植物對光環(huán)境適應(yīng)能力的判斷依據(jù)，其中LSP較高、LCP較低的植物對光環(huán)境具有更強的適應(yīng)能力[36]，結(jié)合本研究結(jié)果說明誘導(dǎo)后的不結(jié)球白菜四倍體的光合性能優(yōu)于二倍體。染色體加倍可能導(dǎo)致多倍體植物的抗逆性增強[37]。本試驗通過分析二、四倍體對灰霉菌侵染的抵抗能力發(fā)現(xiàn)，相比于二倍體，四倍體植株具有更強的抗逆性，說明四倍體具有更好的環(huán)境適應(yīng)能力。秋水仙誘導(dǎo)產(chǎn)生的同源四倍體矮樁秋冠在農(nóng)藝性狀、營養(yǎng)品質(zhì)、光合能力和抗病能力上相較于二倍體有一定程度的提高，符合育種目標的要求。同時，本研究創(chuàng)制的四倍體矮樁秋冠新種質(zhì)是純系，能作為育種親本或直接作為常規(guī)種在生產(chǎn)上應(yīng)用。

植株染色體加倍后，由于染色體發(fā)生變化導(dǎo)致染色體配對異常，與二倍體相比，四倍體植株的可育性降低，通過多代馴化可改善該情況。同時由于嵌合體[38]、基因突變和重組[39]導(dǎo)致誘變植株產(chǎn)生多種變化，在對植株進行鑒定篩選時，需選取各方面表現(xiàn)優(yōu)良的育種材料，以提高優(yōu)良品種的育種效率，從而進行下一步的研究[40]。

4 結(jié)論

本研究以二倍體不結(jié)球白菜矮樁秋冠植株為材料，獲得了矮緊型、抗病不結(jié)球白菜同源四倍體矮樁秋冠新材料，為不結(jié)球白菜種質(zhì)創(chuàng)新和新品種培育奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜同源四倍體矮樁秋冠相較于二倍體并沒有出現(xiàn)巨大化現(xiàn)象，具體原因有待后續(xù)研究證實。不結(jié)球白菜同源四倍體矮樁秋冠新材料的創(chuàng)制，為研究四倍體植株相較于二倍體未出現(xiàn)巨大化現(xiàn)象的原因提供了新的研究材料。