碳酸鈉對甘薯軟腐病菌的抑制及致死作用研究

孫江麗，唐仙，楊佳琪，郭心怡，朱洪梅*，額日赫木

山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院（太原 030000）

甘薯屬于旋花科番薯屬的草本植物，其產(chǎn)量在世界糧食總產(chǎn)量中排名第七[1]，中國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國[2]，甘薯在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。軟腐病是甘薯貯藏期的主要病害之一，由于甘薯組織脆嫩且水分含量較高，易發(fā)生損傷，導(dǎo)致生理機(jī)能減弱，使甘薯塊根極易感染致病菌[3]。甘薯發(fā)生軟腐病時，表面快速形成水漬病斑，發(fā)病組織質(zhì)地變軟[4]，并散發(fā)出酸臭味，直至完全腐敗，發(fā)病甘薯表面生成的霉毛會入侵周圍健康的甘薯，造成成片性腐爛，導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失。

防治果蔬采后病害的方法多種多樣，比較廣泛使用的是化學(xué)方法[5]，主要通過給果蔬噴灑藥劑或用藥液浸漬果蔬[6]，從而抑制或殺死存在于果蔬表面的微生物。常用的化學(xué)藥劑有噻苯咪唑[7]、多菌靈[8]和嘧菌酯[9]，但這些農(nóng)藥具有毒性、高殘留等缺點[10]，會損害人體健康并對生態(tài)環(huán)境造成破壞，因此，選擇化學(xué)藥劑時，要考慮所選藥劑是否具有安全、健康等特點。碳酸鈉性質(zhì)穩(wěn)定[11]、容易獲得，且符合國內(nèi)和美國的防霉保鮮劑標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。近年來，人們對碳酸鈉的防腐保鮮作用進(jìn)行大量研究，主要用于柑橘[14]、番茄[15]、木瓜[16]等果蔬上，未見關(guān)于甘薯病害防治的報道。試驗從軟腐的甘薯中分離單株致病菌，觀察病原菌的菌落形態(tài)和微觀形態(tài)，應(yīng)用rDNA-ITS技術(shù)[17-18]對病原菌進(jìn)行鑒定。選取碳酸鈉作為藥劑，探究其對病原菌孢子和菌絲的抑制作用及對孢子活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碳酸鈉（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；碘化丙啶（PI）、二乙酸熒光素（FDA）：Sigma公司；BGI 2xSuper PCR Mix（with dye）、BGI D2000 Plus DNA Ladder（北京六合華大基因科技有限公司）；基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；瓊脂糖（廈門太陽馬生物工程有限公司）；PCR產(chǎn)物磁珠法純化試劑盒（上海碩美生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

BX40光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯有限公司）；萊卡DM500熒光倒置顯微鏡（德國萊卡顯微系統(tǒng)有限公司）；5417R離心機(jī)（Eppendorf）；9700 PCR儀、3730XL測序儀（ABI）；DYY-8C電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌分離和純化

待甘薯出現(xiàn)典型的軟腐病癥狀時，將其表面的病原菌菌絲挑至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）平板上，利用稀釋涂布平板法數(shù)次純化菌株。

1.3.2 病原菌致病性驗證

采用柯赫式法則[19]對甘薯進(jìn)行致病性驗證。將洗凈的甘薯對半切開，用75%酒精消毒處理后，孢子液浸染，觀察甘薯發(fā)病情況，再次從發(fā)病組織分離病原菌，比較與原接病原菌是否一致。

1.3.3 病原菌形態(tài)觀察

應(yīng)用點接種法[20]觀察病原菌的菌落形態(tài)，利用光學(xué)顯微鏡觀察病原菌微觀形態(tài)并拍照記錄，參考《真菌鑒定手冊》[21]對該病原菌進(jìn)行初步鑒定。

1.3.4 病原菌總DNA提取

在1.5 mL離心管中，加入200 μL預(yù)處理液、3個鋼珠及樣品，用研磨機(jī)研磨。加入20 μL Proteinase K溶液，在37 ℃條件下，放置30～60 min。加入200 μL裂解液，于0 ℃放置10 min。加200 μL無水乙醇，過吸附柱，用洗滌液洗1次，用漂洗液洗2次，室溫下，放置5～10 min，晾干漂洗液。轉(zhuǎn)入新離心管，向吸附膜中加50～100 μL ddH2O，放置5～10 min，按12 000 r/min離心2 min，備用。

1.3.5 病原菌18S rDNA基因PCR擴(kuò)增

以ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）為引物。PCR反應(yīng)體系：Super Mix 15 μL，Primer F（10 p）1 μL，Primer R（10 p）1 μL，模板（ng/μL）1 μL，ddH2O 12 μL，反應(yīng)體系共30 μL。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s。循環(huán)35次后，在72 ℃條件下，保持10 min，待樣品溫度冷卻到16 ℃后取出。用瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。將純化后的PCR產(chǎn)物雙向測序，并進(jìn)行NCBI-BLAST比對。

1.3.6 不同濃度碳酸鈉對病原菌菌落生長的影響

取1 mL藥液，與14 mL PDA培養(yǎng)基混合均勻，分別配制成含2，4，6，8和10 mg/mL碳酸鈉的含藥培養(yǎng)基，以無菌水為對照。取直徑為4 mm的菌苔（未產(chǎn)孢的菌絲）接種至平板中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每組設(shè)定3個重復(fù)，采用十字交叉法測量菌落直徑，每12 h測定1次并記錄。

1.3.7 不同濃度碳酸鈉的馬鈴薯葡萄糖（Potato Dextrose，PD）培養(yǎng)液pH測定

將含不同濃度碳酸鈉溶液的PD培養(yǎng)液滅菌后，用pH計測定其pH。

1.3.8 不同濃度碳酸鈉對病原菌菌絲干重的影響

將5 mL 1×105CFU/mL孢子液分別加入含2.5，5，10和20 mg/mL碳酸鈉的PD培養(yǎng)液中，以無菌水為對照，置于28 ℃恒溫水浴搖床中，培養(yǎng)3 d，經(jīng)濾紙過濾，放入70 ℃鼓風(fēng)箱中干燥并測定菌絲干重。菌絲抑制率按式（1）計算。

式中：Wc為對照組的菌絲干重，g；Ws為處理組的菌絲干重，g。

1.3.9 不同濃度碳酸鈉對病原菌孢子萌發(fā)的影響

在2 mL離心管中，分別加入0.5 mL 50，100和200 μg/mL的碳酸鈉溶液、0.5 mL PD培養(yǎng)液和1 mL 1×105CFU/mL的孢子液，以無菌水作為對照，于28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察100個孢子，統(tǒng)計孢子萌發(fā)情況，凡孢子萌發(fā)的芽管長度超過孢子直徑長度一半即視為萌發(fā)，按式（2）計算孢子萌發(fā)率。

1.3.10 不同濃度碳酸鈉對病原菌孢子活性的影響

在2 mL的離心管中，分別加入0.5 mL 5，10，20和40 mg/mL的碳酸鈉溶液、0.5 mL無菌水和1 mL 1×105CFU/mL的孢子液，以無菌水為對照，于28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，PBS溶液清洗3次，用5 μg/mL PI染液和10 μg/mL FDA染液進(jìn)行單染，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 20對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，使用Origin 2018和Adobe Photoshop 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定及驗證

病原菌在PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h時，白色匍匐菌絲基本能夠布滿平皿，生長24 h后，病原菌開始產(chǎn)生孢子，如圖1（A）所示，菌落從中間開始轉(zhuǎn)黑，直到蔓延滿整個平皿。將病原菌孢子接到甘薯塊上，5 d后，甘薯開始出現(xiàn)軟腐癥狀，如圖1（B）所示，發(fā)病部位變軟且呈現(xiàn)出水漬狀，散發(fā)出酸臭味，之后長出白色棉狀菌絲，白色菌絲進(jìn)一步會出現(xiàn)褐色小顆粒，即病原菌孢子囊，隨著病情進(jìn)一步擴(kuò)大，甘薯流出淺黃色汁水。此癥狀與首次分離病原菌的甘薯軟腐癥狀相同且兩次分離的菌株也一致。

圖1 病原菌菌落形態(tài)（A）和甘薯軟腐病癥狀（B）

2.2 甘薯軟腐病病原菌的形態(tài)特征及ITS序列比對

經(jīng)光學(xué)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，病原菌的孢囊梗（圖2A）叢生，不分枝，褐色，并可產(chǎn)生發(fā)達(dá)的褐色假根（圖2B），褐色孢子囊（圖2C）呈球形或橢圓形，孢子囊內(nèi)有褐色球形孢子（圖2D），該病原菌的形態(tài)特征與根霉屬的菌株極其相似。周鋒等[22]從甘薯軟腐組織分離到的病原菌為匍枝根霉（Rhizopus stolonifer），其匍匐菌絲也為白色，且假根根結(jié)處簇生直立暗褐色孢囊梗，頂端著生1個球狀孢子囊，孢子囊內(nèi)有大量暗色單胞圓形孢子。

圖2 病原菌菌絲的微觀形態(tài)和病原菌的PCR電泳擴(kuò)增結(jié)果

試驗選用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增病原菌的DNA，瓊脂糖凝膠檢測之后，如圖2（E）所示，在500～750 bp之間出現(xiàn)1個條帶。測序儀對純化的DNA片段進(jìn)行雙向測序分析，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，病原菌與米根霉（Rhizopus oryzae，序列登陸號MT540020.1）的同源性為100%。根據(jù)病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)和ITS序列比對，可以鑒定出甘薯軟腐病病原菌為米根霉。Clark等[23]的研究中，甘薯軟腐病的2株致病菌均為根霉屬的菌株，分別是匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）和少根根霉（Rhizopus arrhizus）。白劍宇等[24]應(yīng)用PCR技術(shù)獲取了紅棗軟腐病病原菌的ITS序列片段，結(jié)合柯赫氏法則驗證和形態(tài)學(xué)觀察，并與GenBank中已有的相關(guān)序列進(jìn)行BLAST比對分析，鑒定病原菌為米根霉。還有李潤根等[25]從低溫儲藏的軟腐龍牙百合種球中分離病原菌，經(jīng)致病性研究和ITS鑒定，發(fā)現(xiàn)龍牙百合軟腐病的致病菌也為米根霉。由于甘薯本身的品種和生長產(chǎn)地不同，感染甘薯的病原菌種類也會有所差別。

2.3 碳酸鈉對病原菌菌絲生長的抑制作用

從圖3看出，碳酸鈉可抑制病原菌菌落的擴(kuò)大，隨碳酸鈉濃度增加，菌落生長范圍逐漸變小。生長12 h和24 h的CK組病原菌菌落直徑分別為3.23 cm和8.19 cm，而在含不同濃度碳酸鈉的PDA平板中，菌落直徑顯著小于CK組（p＜0.05），隨著藥劑濃度的增加，菌落直徑呈下降趨勢，當(dāng)碳酸鈉質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時，生長12 h和24 h的病原菌菌落直徑最小，分別為0.77 cm和0.82 cm。由此可見，10 mg/mL的碳酸鈉可顯著抑制病原菌菌絲在PDA平板上的生長（p＜0.05），對病原菌菌絲具有最好的抑制作用。崔建潮等[26]研究表明，0.8%碳酸鈉溶液對梨輪紋病菌有明顯抑制作用，可完全抑制病菌菌絲的生長。

圖3 不同質(zhì)量濃度碳酸鈉對病原菌菌絲生長的影響

由圖4看出，6組PD培養(yǎng)液均呈堿性，在對照組中，pH為7.36，這是由于試驗所用水質(zhì)偏堿而導(dǎo)致的，含2，4，6和8 mg/mL碳酸鈉的PD培養(yǎng)液的pH依次為8.39，8.81，9.02和9.22，碳酸鈉質(zhì)量濃度10 mg/mL時，pH達(dá)到最大，PD培養(yǎng)液的pH隨碳酸鈉濃度的升高而增大。碳酸鈉通過把微生物生長環(huán)境的pH升高起到抑制微生物生長的作用[27]，藥劑處理使環(huán)境遠(yuǎn)離病原菌的最適生長條件[13]，從而影響病原菌的生長。這與碳酸鈉抑制病原菌菌絲生長的變化趨勢一致，碳酸鈉濃度越高，堿性越強(qiáng)，對病原菌菌絲生長的抑制作用越大。

圖4 不同質(zhì)量濃度碳酸鈉的初始pH

2.4 不同質(zhì)量濃度碳酸鈉對菌絲干重的影響

由圖5（A）看出，隨碳酸鈉濃度增加，菌絲干重呈現(xiàn)下降趨勢，碳酸鈉可以明顯抑制液體培養(yǎng)基中病原菌菌絲的生長量，含2.5，5，10和20 mg/mL碳酸鈉的PD營養(yǎng)液培養(yǎng)孢子3 d時，病菌菌絲干重分別達(dá)到0.506 7，0.449 5，0.095 5和0.046 3 g，而對照組的菌絲干重為0.595 7 g，經(jīng)過碳酸鈉處理的菌絲干重均顯著低于對照組的菌絲干重（p＜0.05）。如圖5（B）所示，碳酸鈉的抑菌率隨其濃度升高而增強(qiáng)，2.5和5 mg/mL碳酸鈉的抑菌效果并不高，僅為14.95%和24.54%，質(zhì)量濃度達(dá)到10和20 mg/mL時，碳酸鈉的抑菌率分別為83.97%和92.23%，由此可見，20 mg/mL碳酸鈉對病原菌的菌絲生長具有最好的抑制作用。

圖5 不同質(zhì)量濃度碳酸鈉對菌絲干重的影響及其抑菌率

2.5 不同濃度碳酸鈉對孢子萌發(fā)率的影響

甘薯軟腐病菌屬于霉菌，孢子是其重要的繁殖方式[28]，抑制孢子的萌發(fā)就相當(dāng)于抑制病原菌的繁殖。含50，100和200 μg/mL碳酸鈉的PD營養(yǎng)液處理孢子12 h后，通過光學(xué)顯微鏡觀察得出如圖6所示的孢子萌發(fā)圖。對照組（圖6A）的孢子吸收充足的營養(yǎng)物，形狀飽滿，體積較大，孢子萌發(fā)數(shù)最多。碳酸鈉50 μg/mL（圖6B）時，與對照組相比，孢子的體積有所減小，萌發(fā)數(shù)也減少。藥液質(zhì)量濃度增加至100 μg/mL（圖6C），很大程度地抑制孢子體積的增大，且只有少數(shù)孢子萌發(fā)。200 μg/mL（圖6D）時，孢子體積最小，未觀察到萌發(fā)的孢子，但孢子保持原有形狀。未經(jīng)碳酸鈉處理的孢子萌發(fā)率可達(dá)90.35%，碳酸鈉質(zhì)量濃度50和100 μg/mL時，其萌發(fā)率分別降低至54.17%和10.92%，200 μg/mL碳酸鈉可完全抑制孢子的萌發(fā)，對孢子萌發(fā)的抑制效果最佳。

圖6 不同質(zhì)量濃度碳酸鈉對孢子萌發(fā)率的影響

2.6 不同濃度碳酸鈉對孢子活性的影響

孢子懸浮液經(jīng)FDA染色液單染后，在熒光顯微鏡下觀察到活孢子呈綠色熒光（圖7 A～E），PI染色液單染后，死亡孢子呈紅色熒光（圖7 a～e）[29-30]。對照組中，大部分為發(fā)出綠色熒光的活性孢子（圖7A），還有個別無活性的死亡孢子（圖a），紅色熒光的孢子可能是自然死亡所導(dǎo)致的。碳酸鈉5 mg/mL時，發(fā)出綠色熒光的孢子數(shù)目減少（圖B），紅色熒光的孢子數(shù)目增多（圖7b），說明碳酸鈉對孢子有一定致死作用。藥液濃度增加至10 mg/mL時，有活性的孢子（圖C）和無活性的孢子（圖7c）數(shù)目基本一致，碳酸鈉對孢子的致死作用增大。20 mg/mL時，有較為明顯的致死作用，紅色熒光的孢子（圖7d）超過綠色熒光的孢子（圖7D）。當(dāng)藥液濃度最高時，活性孢子數(shù)目降至最低（圖7E），致死量達(dá)到最大（圖7e），40 mg/mL碳酸鈉對孢子的致死效果最好。

圖7 不同質(zhì)量濃度碳酸鈉對孢子活性的影響

3 結(jié)論

結(jié)合柯赫氏法則、微觀形態(tài)觀察和rDNA-ITS技術(shù)對甘薯軟腐病的致病菌進(jìn)行鑒定，確定該菌株為米根霉（Rhizopus oryzae）。在離體條件下，碳酸鈉通過提高病原菌生長環(huán)境pH抑制菌絲的生長，含10 mg/mL碳酸鈉的培養(yǎng)基中，菌落生長范圍最小，對病原菌菌絲生長的抑制作用最大。碳酸鈉質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL時，菌絲干重最輕，對菌絲生長量的抑制效果最好。隨碳酸鈉濃度升高，其對孢子萌發(fā)的抑制作用增強(qiáng)，200 μg/mL碳酸鈉可完全抑制孢子的萌發(fā)。碳酸鈉處理孢子后，經(jīng)FDA和PI染色，熒光顯微鏡下的綠色和紅色熒光反映不同濃度碳酸鈉對孢子的致死情況，隨著藥劑量增加，死亡孢子的數(shù)量也增加，40 mg/mL碳酸鈉對孢子致死作用最大。這將為甘薯軟腐病害的防治奠定理論依據(jù)，后續(xù)試驗還可將碳酸鈉用于甘薯活體試驗，對甘薯軟腐病進(jìn)行防治。