大孔樹脂串聯(lián)富集沙漠肉蓯蓉苯乙醇苷的工藝

向玲，陳一鳴，王松濤，陳泳潔，李姝，焦威*

1. 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所天然產(chǎn)物研究中心（成都 610000）；

2. 瀘州品創(chuàng)科技有限公司（瀘州 646000）；3. 川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（南充 637000）

肉蓯蓉原植物為列當(dāng)科植物肉蓯蓉屬的寄生植物，全世界約20種，我國(guó)有6種及1變種，分別為肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY. C. Ma.）、鹽生肉蓯蓉[C.salsa（C. A. Mey）G. Beck]、管花肉蓯蓉[C.tubulosa（Schenk）R. Wight]、沙蓯蓉（C.sinensisG. Beck）、蘭州肉蓯蓉（C.lanzhouensisZ. Y. Zhang）、迷肉蓯蓉[C.ambigua（Bge.）G. Beck]和1變種白花鹽蓯蓉（C.salsa var. albiflor P. F. Tuet Z. C. Lou）[1-2]。主要分布于北緯36°～37°，東西橫跨我國(guó)內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、青海、寧夏及新疆等省區(qū)[3]。在我國(guó)，肉蓯蓉?fù)碛杏凭玫乃幨硟捎脷v史[4]，肉蓯蓉藥用功效最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，強(qiáng)調(diào)有補(bǔ)五臟，強(qiáng)陰益精氣，益髓補(bǔ)中之功。被廣泛應(yīng)用于治療腎陽(yáng)虛、經(jīng)血虧虛、陽(yáng)痿不孕等疾病。具有溫而不熱，補(bǔ)而不峻的特點(diǎn)，適合長(zhǎng)期服用。肉蓯蓉食療養(yǎng)生最早記載于唐代的《本草拾遺》，而《本草經(jīng)集注》《藥性論》[5-6]記載具體的使用方法，其配料多以羊肉為主，以作羊肉羹。到明代，食用方法更加豐富，有煲湯、熬粥、燉、炒、煮等。到了現(xiàn)代，隨著對(duì)肉蓯蓉的不斷深入研究，人們對(duì)肉蓯蓉中的成分提取方法進(jìn)行研究[7-8]，提取的成分中主要含有苯乙醇苷類[9]、糖類[10]等多種生物活性，有預(yù)防神經(jīng)保護(hù)作用[11]，預(yù)防骨質(zhì)疏松[12]、血管性癡呆[13]，以及通便作用[14]、滋陰補(bǔ)陽(yáng)[15]等，證明其無(wú)毒副作用，服用安全可靠。不僅在醫(yī)學(xué)上被廣泛應(yīng)用，而且在食品發(fā)展中也不斷深入，如肉蓯蓉發(fā)酵酒的工藝技術(shù)[16]，肉蓯蓉的營(yíng)養(yǎng)保健[17]，復(fù)合肉蓯蓉固體飲料制粒工藝[18]等。

試驗(yàn)不僅優(yōu)化適合工業(yè)生產(chǎn)的肉蓯蓉提取方法，而且將大孔樹脂串聯(lián)富集方法用于肉蓯蓉有效成分純化的研究。該工藝簡(jiǎn)單可行、分離效果好，能很好地保留有效成分，降低色素含量，適用于肉蓯蓉苯乙醇苷的連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)，為工業(yè)生產(chǎn)高含量苯乙醇苷提取物提供參考，期望應(yīng)用于食品發(fā)展方向。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

肉蓯蓉2019年購(gòu)于內(nèi)蒙古阿拉善盟，經(jīng)鑒定為列當(dāng)科（Orobanchaccae）肉蓯蓉屬（Cistanche）植物荒漠肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY. C. Ma.），肉蓯蓉橫切面見圖1，干燥，粉碎。松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)PS000867，純度＞99%，成都普思生物科技股份有限公司）；大孔樹脂AB-8、ADS-7（天津浩聚樹脂科技有限公司）；蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室自制，成都品成科技有限公司）；無(wú)水乙醇（分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（HPLC級(jí)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

圖1 荒漠肉蓯蓉橫切面圖

1.2 儀器與設(shè)備

LC-16分析型高效液相色譜儀（日本SHIMADZU）；XD-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；B-260型恒溫水浴鍋（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；CCA-20型低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SHZ-D111型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；JA1203型精密電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；XTP-500A型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 檢測(cè)方法的建立

試驗(yàn)檢測(cè)采用HPLC檢測(cè)。對(duì)樣品做紫外全波段掃描，結(jié)果顯示樣品在315～335 nm之間有最大吸收峰。色譜條件：以0.5%醋酸為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)333 nm，進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精密稱取10 mg松果菊苷對(duì)照品置于燒杯中，加入甲醇溶解后轉(zhuǎn)入10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，充分振蕩溶解，即配制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密移取5，10，15和20 μL上述對(duì)照品溶液進(jìn)樣，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以松果菊苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程，所得回歸方程為y=（7×106）x-393 095（R2=0.994 8），在0～18 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取5 μL對(duì)照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，HPLC色譜圖如圖2和圖3所示，富集純化后肉蓯蓉提取物如圖4所示。

圖2 對(duì)照品HPLC圖

圖3 藥材HPLC圖

圖4 純化產(chǎn)品HPLC圖

2.2 荒漠肉蓯蓉中苯乙醇苷類的提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

考慮實(shí)際提取條件，基于預(yù)試驗(yàn)，使用熱回流提取方法提取，選用70%乙醇溶液[2]為提取媒介，考察影響荒漠肉蓯蓉中苯乙醇苷類提取的3個(gè)主要因素，即料液比、溫度、時(shí)間的最佳參數(shù)，對(duì)單個(gè)因素分別考察選出合適范圍，從每個(gè)因素各取3個(gè)水平，因素水平安排見表2。

表1 色譜條件梯度表

表2 正交試驗(yàn)因素水平

2.2.2 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 13軟件正交設(shè)計(jì)分析方法。

2.2.3 試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。通過(guò)對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)K值大小，最優(yōu)水平為A1B2（B3）C1，即提取溶液采用70%乙醇，溫度70 ℃下，每次1.5 h，料液比1∶10（g/L） 或提取溶液采用70%乙醇，溫度70 ℃下，每次2 h，料液比1∶10（g/L）。從目標(biāo)峰提取率來(lái)看，提取率在3%以上的提取時(shí)間均為2 h，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)苯乙醇苷類的影響較大。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.3 荒漠肉蓯蓉中苯乙醇苷類的純化工藝考察

為使提取出來(lái)的有效成分能夠應(yīng)用于食品生產(chǎn)中，需在重點(diǎn)清除色素與淀粉的同時(shí)，盡可能保留有效成分。采用大孔吸附樹脂作為填料。

2.3.1 大孔樹脂選擇

常規(guī)富集主要采用AB-8型大孔樹脂，弱極性的AB-8型大孔樹脂對(duì)肉蓯蓉有效成分具有很好的富集效果。肉蓯蓉有效成分主要為苯乙醇苷類，苯乙醇苷類在水溶液中可以很好地被AB-8型大孔樹脂吸附分離。AB-8型大孔樹脂采用條件：藥材與樹脂比1∶1，浸膏水溶解后上樣，將洗脫液二次上樣，分別用0，20%，40%和50%的乙醇。目標(biāo)物在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%以下，若體積分?jǐn)?shù)過(guò)高就有一些脂類物質(zhì)被沖出，將收集得到的含有目標(biāo)物的洗脫液濃縮進(jìn)行二次吸附。

由于大孔樹脂ADS-7具有很好的分離色素的能力，這對(duì)于應(yīng)用到食品方向有著重要意義。采用AB-8型大孔樹脂的研究方式類比到ADS-7型大孔樹脂，對(duì)ADS-7型大孔樹脂進(jìn)行最優(yōu)條件的探索，分為靜態(tài)吸附、動(dòng)態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)。將2種樹脂串聯(lián)使用研究承載量和不同洗脫濃度的松果菊苷含量。

2.3.2 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

將5 g浸膏濃縮干燥，通過(guò)超聲混合均勻配制成20 mg/mL的浸膏水溶液，測(cè)定各組分含量。準(zhǔn)確稱取2 g共5份ADS-7型大孔樹脂置于50 mL三角燒瓶中，混合均勻后的浸膏水溶液準(zhǔn)確量取50，25，16.65，12.5和10 mL，加入到三角燒瓶中，依次標(biāo)好標(biāo)簽，分別為樹脂與藥材比1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和5∶1，瓶口密封靜置24 h后，過(guò)濾將樹脂洗凈收集并濃縮濾液分別溶解在50.00，25.00，16.65，12.50和10.00 mL的純水中，測(cè)定各組分含量。運(yùn)用式（1）計(jì)算吸附率。

式中：A為吸附率，%；Cq為吸附前溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Ch為吸附后溶液中松果菊苷含量，mg/mL。

各個(gè)試驗(yàn)組經(jīng)過(guò)HPLC液相檢測(cè)，通過(guò)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品松果菊苷的含量變化確定承載量，吸附前松果菊苷的含量對(duì)應(yīng)的峰面積143 966。通過(guò)式（2）計(jì)算吸附率。計(jì)算結(jié)果如表4和圖5所示。結(jié)果顯示當(dāng)樹脂與藥材比達(dá)到4∶1及以上，吸附率以及吸附效果可觀。

圖5 ADS-7型大孔樹脂吸附率圖

表4 ADS-7型大孔樹脂吸附率表

式中：A為吸附率，%；Cq為吸附前溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Ch為吸附后溶液中松果菊苷含量，mg/mL。

2.3.3 動(dòng)態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)

將AB-8型大孔樹脂和ADS-7型大孔樹脂凈品級(jí)用純水濕法裝柱，檢驗(yàn)AB-8型大孔樹脂最優(yōu)條件：藥材與樹脂比1∶1，浸膏水溶解后上樣，將洗脫液二次上樣，使各組分充分吸附。用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫，分別為0，20%，40%和50%。目標(biāo)物在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%以下。

ADS-7型大孔樹脂按照樹脂與藥材比4∶1上樣，經(jīng)過(guò)對(duì)上樣質(zhì)量濃度，以及洗脫劑濃度的探究，并按式（3）和式（4）計(jì)算，得到表5和表6。

表5 ADS-7動(dòng)態(tài)吸附數(shù)據(jù)表

表6 ADS-7動(dòng)態(tài)解吸數(shù)據(jù)表

式中：A為吸附率，%；Cq為吸附前溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Ch為吸附后溶液中松果菊苷含量，mg/mL。

式中：B為解吸率，%；Cq為吸附前溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Ch為吸附后溶液中松果菊苷含量，mg/mL；Cj為解吸后松果菊苷的含量，mg/mL。

從數(shù)據(jù)可以看出，最佳上樣質(zhì)量濃度為18 mg/mL，50%乙醇溶液洗脫效果最好。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，獲得表7。

表7 松果菊苷富集率表

綜上所述，對(duì)于有效成分的富集，可以先用純水將無(wú)法吸附的雜質(zhì)清除干凈，后換用50%的乙醇溶液洗脫富集。富集條件相同但AB-8型大孔樹脂與ADS-7型大孔樹脂存在差異，AB-8型大孔樹脂富集效果更好，但是色素分離效果不及ADS-7型大孔樹脂優(yōu)秀。

2.3.4 樹脂串聯(lián)試驗(yàn)

由于一次富集除雜效果不好，所以需要將第1次富集的有效成分進(jìn)行二次洗脫富集，2次全部選用AB-8型大孔樹脂色素分離情況不佳，若2次全部選用ADS-7型大孔樹脂有效成分富集情況不及AB-8型優(yōu)秀，為適合產(chǎn)品效果，將提取的粗浸膏先通過(guò)AB-8型大孔樹脂進(jìn)行富集，后經(jīng)過(guò)ADS-7型大孔樹脂進(jìn)行二次富集。2次富集均采用2.3.3中最優(yōu)條件，采用2.1.1中的檢測(cè)方法檢測(cè)。

結(jié)合表8～表10數(shù)據(jù)，若2次全部選用AB-8型大孔樹脂色素，分離情況不佳，但富集效果好，若2次全部選用ADS-7型大孔樹脂，有效成分富集情況不及AB-8型優(yōu)秀，但具有良好的除色效果。所以將樹脂串聯(lián)，串聯(lián)后對(duì)有效成分有較好的富集效果，對(duì)色素也有很好的清除效果，產(chǎn)物金黃色且澄清透明。

表8 串聯(lián)試驗(yàn)富集率

表9 AB-8 2次富集率

表10 ADS-7 2次富集率

綜上所述可以得到樹脂串聯(lián)條件：AB-8型大孔樹脂、ADS-7型大孔樹脂與藥材比分別為1∶1∶1；先通過(guò)AB-8富集50%的組分，后通過(guò)ADS-7富集50%的組分。這種富集方法既可以避免2次都是用ADS-7型大孔樹脂對(duì)有效成分的大量消耗，又可以解決只使用AB-8型大孔樹脂難以分離色素的問(wèn)題。

3 結(jié)論

對(duì)有望應(yīng)用在食品方向上肉蓯蓉有效成分提取富集的工藝進(jìn)行研究設(shè)計(jì)。試驗(yàn)通過(guò)大孔樹脂的方法對(duì)肉蓯蓉的苯乙醇苷進(jìn)行提取純化，通過(guò)靜態(tài)吸附、動(dòng)態(tài)吸附與解吸，對(duì)上樣質(zhì)量濃度、上樣體積、洗脫液濃度進(jìn)行研究，比較AB-8型樹脂、ADS-7型樹脂和AB-8型樹脂串聯(lián)ADS-7型樹脂的富集率，試驗(yàn)確定肉蓯蓉苯乙醇苷類純化最佳工藝：AB-8和ADS-7型大孔樹脂串聯(lián)的方法富集有效成分，先使用AB-8型大孔樹脂富集樹脂與藥材質(zhì)量比1∶1上樣，50%乙醇洗脫液；后使用ADS-7型大孔樹脂進(jìn)行二次富集，樹脂與藥材質(zhì)量比4∶1上樣，50%乙醇洗脫。試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝溫度，更適合工業(yè)生產(chǎn)條件；同時(shí)探究既能有效富集肉蓯蓉有效成分，又能有效減少色素的大孔樹脂串聯(lián)方法。該純化工藝操作簡(jiǎn)單，周期較短，富集率高，減少雜質(zhì)，為肉蓯蓉藥食兩用的開發(fā)應(yīng)用提供可靠方向。