水相法合成磷脂酰絲氨酸體系的優(yōu)化研究

李令星，吳 寅，李富堅

（翁源廣業(yè)清怡食品科技有限公司，廣東韶關(guān) 512000）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）具有提高大腦認(rèn)知[1]、修復(fù)大腦損傷[2-3]等功能，在食品、保健品、醫(yī)藥等多個行業(yè)被廣泛應(yīng)用[4-5]。隨著對PS功效應(yīng)用的研究的不斷深入，其市場需求也日益增長。在PS眾多生產(chǎn)方法中，酶法反應(yīng)因條件溫和、易控、高效簡單而成為生產(chǎn)主流。酶法反應(yīng)將絲氨酸溶于水，磷脂酰膽堿（1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine，PC）溶于有機(jī)溶劑，兩相反應(yīng)。隨著人們對食品安全的愈發(fā)重視，溶劑殘留也愈發(fā)受到關(guān)注。本文研究了磷脂酰膽堿在純水相中合成磷脂酰絲氨酸的關(guān)鍵變量，為磷脂酰絲氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)中提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

正己烷，異丙醇均為色譜純；乙酸、三乙胺、三氯甲烷均為分析純；大豆磷脂（哈爾濱九三，PC含量≥55.0%）；絲氨酸（浙江普洛）；磷脂酶D，公司自產(chǎn)發(fā)酵制備；PS標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）；PC標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）。

Agilent 1260液相色譜儀配ELSD檢測器（安捷倫）；分析天平BSA224S（賽多利斯）；高速離心機(jī)（湖北湘儀）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱Lichrospher 100 dio（l100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A（正己烷∶異丙醇∶乙酸∶三乙胺=820∶170∶10∶0.8）；流動相B（異丙醇∶水∶乙酸∶三乙胺=850∶140∶10∶0.8），A、B兩相梯度洗脫：0～8.5 min，5%→36% B；8.5～12 min，36%→38% B；12～15 min，38%→100% B；15～15.5 min，100%→5% B；15.5～20 min，95% B；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測器漂移管溫 度：85 ℃；氣體流速：2.5 L/min；柱溫：35 ℃[6]。

1.2.2 分析方法

分別精確稱取PS、PC標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用三氯甲烷定容至25 mL，混合均勻，制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。用移液管準(zhǔn)確吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL和9 mL 儲備液，用三氯甲烷定容至10 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取10 mg樣品，用三氯甲烷定容至25 mL，搖勻，制成樣品溶液，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線分析樣品的PS和PC含量。在選定色譜條件下，以PS、PC峰面積（W）為縱坐標(biāo)，PS、PC濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為W（PS）= 74.55C+24.68，R=0.999 62；W（PC）=52.61C+ 72.36，R=0.999 29，表明PS和PC在選定濃度下具有良好的線性關(guān)系。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

稱取100 g PC和100 g絲氨酸，加入500 mL水和25 mL酶液，37 ℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后離心分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測定產(chǎn)品PS和PC含量。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定純水相法反應(yīng)PS的最適條件。

（1）物料比對PC合成PS的影響。按表1稱取物料，加入25 mL酶液，37 ℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束，離心、分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測定產(chǎn)品中PS和PC含量，確定最適物料比。

表1 PC合成PS的物料比

（2）酶液添加量對PC合成PS的影響。稱取100 g PC和80 g絲氨酸，加入300 mL水，按PC添加量的5%、10%、15%、20%和25%，分別加入5 mL、10 mL、15 mL、20 mL和25 mL酶液，37 ℃反應(yīng) 4 h，反應(yīng)結(jié)束離心、分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測定產(chǎn)品中PS和PC含量，確定最適酶液添加量。

（3）反應(yīng)時間對PC合成PS的影響。稱取100 g PC和80 g絲氨酸，加入300 mL水和20 mL酶液，37 ℃分別反應(yīng)2 h、4 h、6 h、8 h和10 h，反應(yīng)結(jié)束，離心分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測定產(chǎn)品中PS和PC含量，確定最適反應(yīng)時間。

（4）反應(yīng)溫度對PC合成PS的影響。稱取100 g PC和80 g絲氨酸，加入300 mL水和20 mL酶液，分別在28 ℃、37 ℃、42 ℃、45 ℃和50 ℃反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束，離心分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測定產(chǎn)品中PS和PC含量，確定最適反應(yīng)溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)品圖譜

經(jīng)HPLC檢測及圖譜分析（圖1），產(chǎn)品中PS含量為54.52%（保留時間9.891 min），反應(yīng)前原料中PC含量為58.35%，反應(yīng)結(jié)束后，PC含量為4.33%（保留時間8.384 min），PC轉(zhuǎn)化率為93.40%。

圖1 產(chǎn)品圖譜

2.2 物料比對PC合成PS的影響

由 表2可 知，當(dāng) 水∶PC=1∶1（mL∶g）時，水量不足，物料混合不充分，PS生成率不高；水∶PC=3∶1（mL∶g）時，水量剛好合適，物料混合充分，反應(yīng)效能達(dá)到最高；水∶PC=5∶1（mL∶g）時，水量過多，PC有更多活動空間，PC逐漸凝聚成團(tuán)，減少了與絲氨酸接觸的機(jī)會，導(dǎo)致PS合成反而降低，因而水∶PC=3∶1（mL∶g）為宜。當(dāng)絲氨酸∶PC=0.5∶1（g∶g）時，絲氨酸添加量較少，無法與PC充分接觸，反應(yīng)不充分；絲氨酸∶PC=0.8∶1（g∶g）時，絲氨酸添加量正好合適，與PC充分接觸，反應(yīng)效能達(dá)到最高；絲氨酸∶PC=1∶1（g∶g）時，絲氨酸已過量，但PS合成也不會繼續(xù)加大，且前期絲氨酸用量加大，后期則需要更多純水洗去多余的絲氨酸，因而絲氨酸∶PC=0.8∶1（g∶g）最適宜。綜合考慮。水、PC和絲氨酸的比例為3∶1∶0.8（mL∶g∶g）時最合適。

表2 物料比對PC合成PS的影響

2.3 酶液添加量對PC合成PS的影響

由表3可知，隨著酶用量逐漸增大，PS合成率逐漸增加，當(dāng)酶液添加量為PC的20%時，PS合成效能最大，當(dāng)酶添加量超過PC的20%后，PS合成反而降低。在酶添加量較少時，活性因子不能充分接觸底物，因而PS合成率不高，當(dāng)酶添加量超出最適添加量后，磷脂酶將本已合成的PS分解成為磷脂酸（PA），導(dǎo)致PS合成率降低。綜合考慮，最適酶液添加量為PC的20%。

表3 酶添加量對PC合成PS的影響

2.4 反應(yīng)時間對PC合成PS的影響

由表4可知，隨著反應(yīng)時間的增加，PS合成率逐漸加大，當(dāng)反應(yīng)時間為6 h時，PS合成效能最大，繼續(xù)反應(yīng)，磷脂酶開始反作用于PS，使PS分解，導(dǎo)致PS合成率降低。綜合考慮，反應(yīng)時間為6 h最 適宜。

表4 反應(yīng)時間對PC合成PS的影響

2.5 反應(yīng)溫度對PC合成PS的影響

由表5可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，PS合成率逐漸增大。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到45 ℃時，PS合成效能最大，繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，磷脂酶逐漸失活，失去作用。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到50 ℃時，磷脂酶完全失去活性，無法催化PC合成PS，因而選定反應(yīng)溫度為45 ℃。

表5 反應(yīng)溫度對PC合成PS的影響

3 結(jié)論

本文通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了水相法合成磷脂酰絲氨酸在工業(yè)生產(chǎn)中的關(guān)鍵變量，結(jié)果表明，最適用水量∶大豆磷脂∶L-絲氨酸的比例為3∶1∶0.8（mL∶g∶g）、酶液添加量為PC的20%、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時間6 h。在最適反應(yīng)條件下獲得PS含量為54.52%，符合新資源食品質(zhì)量要求，PC轉(zhuǎn)化率為93.40%。為無溶劑合成PS在工業(yè)化生產(chǎn)中提供重要依據(jù)。