桂枝茯苓丸對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)大鼠子宮組織NF-κB/COX-2/PGF_2α通路的影響

劉燦紋 唐標(biāo)

〔摘要〕 目的 觀察桂枝茯苓丸對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)（primary dysmenorrhea， PD）大鼠子宮組織核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）/環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）/前列腺素F2α（prostaglandin F2α， PGF2α）通路的影響，探討桂枝茯苓丸干預(yù)PD的機(jī)制。方法 SD雌性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、桂枝茯苓丸組、布洛芬組，每組10只。采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素建立PD大鼠模型。桂枝茯苓丸組、布洛芬組分別灌胃桂枝茯苓丸310 mg/kg、布洛芬1 mg/只;正常組、模型組均灌胃生理鹽水10 mL/kg。灌胃10 d后，第11天記錄各組大鼠扭體次數(shù)和潛伏期;觀察子宮形態(tài)改變;ELISA法檢測(cè)子宮組織中PGF2α含量;Western blot檢測(cè)子宮組織COX-2、NF-κB和磷酸化的NF-κB的水平。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)，扭體次數(shù)顯著增多（P<0.01），扭體潛伏期顯著延長（P<0.01），子宮內(nèi)膜大范圍剝脫并有較嚴(yán)重的水腫，子宮組織PGF2α含量以及COX-2、NF-κB以及磷酸化的NF-κB水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，桂枝茯苓丸組大鼠扭體次數(shù)顯著減少（P<0.01），扭體潛伏期顯著延長（P<0.01），子宮內(nèi)膜剝脫少見且水腫程度較輕，子宮組織PGF2α含量、COX-2和磷酸化的NF-κB水平顯著降低（P<0.01）。結(jié)論 桂枝茯苓丸能有效干預(yù)PD大鼠，其作用機(jī)制可能與抑制PD大鼠子宮組織NF-κB/COX-2/PGF2α通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 桂枝茯苓丸;原發(fā)性痛經(jīng);前列腺素F2α;核因子κB;環(huán)氧化酶-2

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.001

Effect of Guizhi Fuling Pill on NF-κB/COX-2/PGF2α pathway in

uterine tissue of rats with primary dysmenorrhea

LIU Canwen， TANG Biao*

（Medical School， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Guzhi Fuling Pill on nuclear factor-κB （NF-κB）/cyclooxygenase-2 （COX-2）/prostaglandin F2α （PGF2α） pathway in uterine tissue of rats with primary dysmenorrhea （PD）， so as to explore the mechanism of Guzhi Fuling Pill on PD. Methods SD female rats were randomly divided into normal group， model group， Guzhi Fuling Pill group， and ibuprofen group， with ten rats in each group. The PD rats model was established by estradiol benzoate and oxytocin. Guzhi Fuling Pill group and ibuprofen group were gavaged with Guizhi Fuling Pill 310 mg/kg， ibuprofen 1 mg/rat; normal group and model group were ?gavaged with normal saline 10 mL/kg. After 10 days of intragastric administration of Guizhi Fuiling Pill for 10 days， the number of writhing and latency of rats in each group were recorded on the 11th day; the changes of rat uterus were observed; the level of PGF2α was detected by ELISA; the levels of COX-2， NF-κB and phosphorylated NF-κB were analyzed by Western blot. Results Compared with normal group， rats in model group showed writhing reaction， the number of writhing of rats was significantly increased （P<0.01）， and the writhing latency was significantly prolonged （P<0.01）， extensive endometrium peeling and severe edema， and the content of PGF2α， COX-2， NF-κB and phosphorylated NF-κB in uterine tissue of rats was significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， the number of writhing of rats in Guizhi Fuling Pill group was significantly reduced （P<0.01）， and the writhing latency was significantly prolonged （P<0.01）， endometrial exfoliation was less frequent and edema was less severe， and the content of PGF2α， COX-2 and phosphorylated NF-κB in uterine tissue was significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Guizhi Fuiling Pill has a significant effect on the intervention of PD rats， and mechanism of action may be related to the inhibition of NF-κB/COX-2/PGF2α pathway in PD rats uterine tissue.159D5A1F-9B27-4AC8-8438-D29BA0CFF545

〔Keywords〕 Guizhi Fuling Pill; primary dysmenorrhea; prostaglandin F2α; nuclear factor κ-B; cyclooxygenase-2

原發(fā)性痛經(jīng)（primary dysmenorrhea， PD）是一種以行經(jīng)前或行經(jīng)期劇烈下腹疼痛為主要癥狀的婦科疾病，嚴(yán)重影響患者的日常學(xué)習(xí)、工作和生活[1]。前列腺素（prostaglandin， PG）過多的合成和釋放是PD的主要發(fā)病機(jī)制，其中前列腺素F2α（prostaglandin F2α， PGF2α）的釋放導(dǎo)致子宮強(qiáng)烈收縮，造成組織缺血缺氧，引起疼痛[2-3]。環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）在PG合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，其可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)換為PG，加劇子宮組織收縮，誘發(fā)疼痛[4-5]。核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）是調(diào)控COX-2生成的關(guān)鍵因子，NF-κB被磷酸化激活后轉(zhuǎn)位入核，調(diào)控COX-2的表達(dá)，研究表明NF-κB/COX-2通路是調(diào)控PG合成的關(guān)鍵通路，在PD中發(fā)揮了重要作用[6-7]。

桂枝茯苓丸出自醫(yī)圣張仲景所著《金匱要略》，是治療婦科疾病的經(jīng)典方劑，由桂枝、桃仁、茯苓、牡丹皮、赤芍組成，治療痛經(jīng)療效確切[8-10]，但是其治療PD的機(jī)制還不明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立PD大鼠模型，在桂枝茯苓丸的干預(yù)下，觀察大鼠子宮組織中NF-κB、COX-2、PGF2α的變化，從NF-κB/COX-2/PGF2α通路探討桂枝茯苓丸干預(yù)PD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑

1.1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ?成年雌性SPF級(jí)SD大鼠40只，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，2～3月齡，體質(zhì)量（220±20） g。方案獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（LL2020041208）。

1.1.2 ?藥品、主要試劑與儀器 ?桂枝茯苓丸（國藥準(zhǔn)字：Z20027562，批號(hào)：170103，成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司）;布洛芬（國藥準(zhǔn)字：H10900089，批號(hào)：13050442，天津史克制藥有限公司）;苯甲酸雌二醇（國藥準(zhǔn)字H12020529，批號(hào)：08070710，天津金耀藥業(yè)有限公司）;縮宮素（批號(hào)：A605015，生工生物工程股份有限公司）;NF-κB抗體（批號(hào)：#4746）、磷酸化的NF-κB抗體（批號(hào)：#3033）、COX-2抗體（批號(hào)：12282）均購自美國Cell Signaling Technology公司;β-actin鼠抗單克隆抗體（批號(hào)：A5316，美國Sigma公司）;PVDF膜（批號(hào)：ISEQ00010）、山羊抗兔二抗（批號(hào)：AP132P）、山羊抗鼠二抗（批號(hào)：AP124P）均購自德國Merck Millipore公司;PGF2α試劑盒（批號(hào)：516011，美國Cayman Chemical公司）;TGL20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）;BioTek Cytation 5細(xì)胞成像多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ?實(shí)驗(yàn)分組、模型制備及給藥 ?采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、布洛芬組和桂枝茯苓丸組，10只/組。參照前期研究[11]通過注射苯甲酸雌二醇和縮宮素構(gòu)建PD大鼠模型。苯甲酸雌二醇采用股部皮下注射，第1天0.5 mg/只，第2～9天0.2 mg/只，第10天0.5 mg/只，共持續(xù)10 d。第11天腹腔注射縮宮素2 U/只。正常組注射生理鹽水?？s宮素注射后出現(xiàn)扭體反應(yīng)為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)[3-4，11]。桂枝茯苓丸組和布洛芬組均采用灌胃給藥，從第1天開始，每天1次，連續(xù)10 d，其中桂枝茯苓丸劑量為成人臨床用量的等效劑量（310 mg/kg），布洛芬給藥劑量參照前期研究為1 mg/只[4，7]。正常組及模型組灌胃10 mL/kg生理鹽水。

1.2.2 ?扭體反應(yīng)觀察 ?縮宮素注射后，觀察30 min內(nèi)的扭體反應(yīng)，記錄扭體次數(shù)和潛伏期。腹部內(nèi)凹收縮，后肢伸直為出現(xiàn)扭體反應(yīng);從縮宮素注射到開始出現(xiàn)扭體反應(yīng)之間的間隔時(shí)間為扭體潛伏期[3-4，7]。

1.2.3 ?HE染色法觀察子宮組織病理變化 ?參照前期研究[3-4，7]，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后，在冰盤上迅速取出各組大鼠子宮組織，取各組大鼠同側(cè)同位段子宮組織，4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片后進(jìn)行HE染色，封片后于顯微鏡下拍照并觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)的改變。

1.2.4 ?ELISA法檢測(cè)子宮組織中PGF2α含量 ?按照試劑盒說明書操作，參照前期研究[3-4，7]，檢測(cè)各組子宮勻漿上清中PGF2α的濃度和各組子宮勻漿上清蛋白的濃度，并以子宮勻漿上清的PGF2α含量與BCA蛋白定量子宮勻漿上清的蛋白含量的比值表示PGF2α的相對(duì)含量。

1.2.5 ?Western blot檢測(cè)子宮組織COX-2、磷酸化的NF-κB和NF-κB水平 ?參照前期研究[3-4，7]，每組隨機(jī)抽取5只大鼠，提取各組子宮組織蛋白，蛋白定量后配平，蛋白變性后，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。將膜與一抗抗體磷酸化的NF-κB（1∶1000）、NF-κB（1：1000）、COX-2（1∶1000）、β-actin（1∶5000）于4 ℃孵育過夜，洗膜后，與二抗（1∶10 000）于室溫?fù)u床上孵育60 min。ECL顯色曝光，磷酸化的NF-κB p65、NF-κB p65、COX-2蛋白以β-actin為內(nèi)參蛋白，用Quantity One1-D（4.6.7）軟件測(cè)定光密度（optical density， OD）值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白OD的比值，以此表示蛋白相對(duì)含量。159D5A1F-9B27-4AC8-8438-D29BA0CFF545

1.3 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以“x±s”表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢測(cè)，若符合正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間的比較采用單因素方法分析;對(duì)于不符合正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)的，兩樣本均數(shù)間的比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間的比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?桂枝茯苓丸對(duì)PD大鼠扭體反應(yīng)的影響

正常組大鼠無扭體反應(yīng)。與正常組比較，模型組出現(xiàn)扭體反應(yīng)，且扭體次數(shù)增多，潛伏期延長（P<0.01）;桂枝茯苓丸組和布洛芬組大鼠扭體次數(shù)顯著減少，扭體潛伏期延長（P<0.01）;桂枝茯苓丸組與布洛芬組大鼠扭體次數(shù)和扭體潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見圖1。

2.2 ?桂枝茯苓丸對(duì)PD大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)的影響

正常組大鼠子宮內(nèi)膜完整，無水腫等病理形態(tài)改變;模型組大鼠子宮有大范圍內(nèi)膜剝脫和水腫;桂枝茯苓丸組和布洛芬組大鼠子宮內(nèi)膜剝脫和水腫程度較輕。詳見圖2。

2.3 ?桂枝茯苓丸對(duì)PD大鼠子宮PGF2α含量的影響

與正常組相比，模型組大鼠子宮PGF2α含量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，桂枝茯苓丸組和布洛芬組大鼠子宮PGF2α含量顯著降低（P<0.01）;桂枝茯苓丸組與布洛芬組大鼠子宮PGF2α含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見圖3。

2.4 ?桂枝茯苓丸對(duì)PD大鼠子宮COX-2水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠子宮COX-2水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，桂枝茯苓丸組和布洛芬組大鼠子宮組織COX-2水平顯著降低（P<0.01）;桂枝茯苓丸組與布洛芬組大鼠子宮組織COX-2水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見圖4。

2.5 ?桂枝茯苓丸對(duì)PD大鼠子宮磷酸化的NF-κB和NF-κB水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠子宮磷酸化的NF-κB和NF-κB水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，桂枝茯苓丸組大鼠子宮磷酸化的NF-κB水平顯著降低（P<0.01），而NF-κB水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較，布洛芬組大鼠子宮NF-κB和磷酸化的NF-κB水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見圖5。

3 討論

桂枝茯苓丸為經(jīng)典名方，具有活血化瘀、緩消癥塊之功，使瘀化癥消，諸癥皆愈，治療婦科疾病以及PD臨床療效確切[8，12]。桂枝為君藥，溫通血脈;桃仁為臣藥，活血祛瘀;牡丹皮、赤芍和茯苓為佐藥，牡丹皮和赤芍可涼血和活血散瘀，茯苓健脾益胃、滲濕祛痰，以扶正氣[12]。本研究采用人臨床用量等效劑量的桂枝茯苓丸干預(yù)PD大鼠，結(jié)果顯示，桂枝茯苓丸的干預(yù)能減少PD大鼠扭體次數(shù)，延長扭體潛伏期，并能改善子宮組織病理損傷，且其效應(yīng)與布洛芬相當(dāng)，表明該劑量的桂枝茯苓丸能有效干預(yù)PD大鼠。

有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，桂枝茯苓丸干預(yù)PD的機(jī)制與抑制子宮組織過度收縮以及抗炎等機(jī)制有關(guān)[13-15]。已有研究揭示，PGF2α可引起子宮肌過度收縮，加重PD的疼痛，抑制PGF2α的合成和釋放能減輕PD疼痛[16]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，桂枝茯苓丸和布洛芬的干預(yù)均能降低PD大鼠子宮組織PGF2α的含量，提示調(diào)控PGF2α的合成、降低子宮組織PGF2α的含量可能為桂枝茯苓丸干預(yù)PD的重要機(jī)制。

COX-2為PG合成過程中的關(guān)鍵限速酶。已有研究揭示，正常情況下，組織中COX-2的含量較低，在月經(jīng)期前COX-2的表達(dá)明顯增加并同時(shí)催化花生四烯酸合成PG，繼而產(chǎn)生痙攣性疼痛，布洛芬等非甾類抗炎藥可以抑制COX-2的活化，降低PG的水平，在PD中發(fā)揮有效的干預(yù)作用[17-19]。本研究揭示，正常大鼠子宮COX-2水平很低，而PD模型大鼠子宮COX-2水平較正常大鼠顯著升高，桂枝茯苓丸和布洛芬干預(yù)能顯著降低子宮COX-2水平，這表明桂枝茯苓丸和布洛芬可能通過降低PD大鼠子宮COX-2的水平來減少PGF2α的合成和釋放。

NF-κB是一種調(diào)控COX-2合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，已有研究揭示，在PD中存在NF-κB的活化，并且NF-κB的活化可以進(jìn)一步促進(jìn)COX-2的表達(dá)[20]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，PD大鼠子宮組織中磷酸化的NF-κB和NF-κB水平顯著升高，表明存在NF-κB的活化;桂枝茯苓丸組大鼠子宮磷酸化的NF-κB水平降低，提示桂枝茯苓丸可抑制NF-κB的磷酸化，抑制NF-κB活化。

綜上所述，桂枝茯苓丸能有效改善PD，其機(jī)制可能與抑制NF-κB磷酸化、降低COX-2水平，從而有效調(diào)節(jié)PGF2α水平有關(guān)。

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