手十二井穴放血激活TRPV1通道保護心臟驟停后綜合征大鼠中樞神經(jīng)損傷

鐘曉芃,郭 義

(1.天津市人民醫(yī)院，天津 300122；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617)

心臟驟停后綜合征(Post-cardiac arrest syndrome,PCAS)是心臟驟停后，機體在非自然狀態(tài)下(人工心肺復(fù)蘇)自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后出現(xiàn)的一種特殊病理生理狀態(tài)[1]。在我國，每年約有54.4萬人發(fā)生心搏驟停，僅有1.4 %的患者在心肺復(fù)蘇成功后腦功能完全恢復(fù)[2]。根據(jù)2018美國心臟協(xié)會(AHA)公布的心肺腦復(fù)蘇(CPCR)與心血管急救(ECC)指南[3]，呼吸心跳停止患者復(fù)蘇的成功標志已不再是單純的心肺功能恢復(fù)，而是腦的存活與功能恢復(fù)，因此心肺復(fù)蘇成敗的關(guān)鍵在于腦復(fù)蘇。

亞低溫是目前被臨床實踐大量證實能改善心搏驟停患者存活率、神經(jīng)功能預(yù)后的臨床治療措施[3]。但亞低溫操作復(fù)雜，易引起寒戰(zhàn)、免疫抑制和感染等并發(fā)癥并限制了亞低溫的應(yīng)用和推廣[4]。那么臨床上是否能夠找到一種應(yīng)用簡便、安全的治療方法是當務(wù)之急。

在中國古代，將十二井穴刺絡(luò)放血用做各種緊急情況中的急救措施，已有3 000多年的歷史了。目前大量研究證明了井穴放血對中樞神經(jīng)損傷具有保護作用，井穴放血治療卒中[5]、顱腦外傷[6]和CO中毒[6]這些疾病可以減少腦損傷和神經(jīng)功能障礙。井穴放血可降低大鼠腦缺血后腦組織NO含量及NOS活性，保護腦組織免受自由基的損傷[7-8]；可明顯上調(diào)缺血區(qū)皮層腦組織HSP70的表達水平，增強腦修復(fù)能力[9]；可通過快速提高缺血區(qū)c-fos蛋白的含量改善神經(jīng)細胞的應(yīng)激能力[10]。然而井穴放血對于心臟驟停后綜合征腦損傷的保護作用及其機制未見報道。

TRPV1是存在于細胞膜或胞內(nèi)細胞器膜上的一類與多種感受功能有關(guān)的非選擇性陽離子通道蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛的表達，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的功能[6]。本課題組前期研究顯示二氫辣椒素可以通過激活TRPV1通道減少凋亡因子的表達，在一定程度上抑制神經(jīng)細胞的凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[11]。早期的研究證實十二井穴刺絡(luò)的治療作用與放血、疼痛刺激和腧穴3個因素密切相關(guān)[12]，筆者推測辣椒素受體(Transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1)作為在神經(jīng)末梢及中樞神經(jīng)廣泛分布的傷害性刺激感受器，可能在十二井穴刺絡(luò)放血治療中起到重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠年齡49～60 d，體質(zhì)量222～373 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司許可證號SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于天津易生源生物科技有限公司動物實驗室。本實驗經(jīng)天津市人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批同意。

1.2 試劑與儀器

辣椒平(廠家：阿拉丁，貨號：C126558-10mg lot#A1908148);腎上腺素(廠家：天津金耀藥業(yè)有限公司國藥準字H12020526規(guī)格：1 mL∶1 mg);SIEMENS Siredoc220多功能生理監(jiān)測儀(Siemens，Inc.，Berlin，Germany);普朗DNM-9602酶標儀;Rabbit Anti-TRPV1(公司：武漢博士德,貨號：44556B12J10);Anti-Caspase-3(公司：abcam,貨號：Ab4051);Bcl-2 Antibody(武漢艾美捷科技有限公司,貨號：3195-100);Rat S100A1 Calcium Binding protein(S100A1)(公司：武漢艾美捷科技有限公司,貨號EK16495);β-Actin(公司：SAB,貨號：21338);Goat Anti-Rabbit IgG(公司：武漢博士德，貨號SAB1494);原位細胞凋亡檢測試劑盒(美國ROCHE公司);光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11)。

1.3 十二井穴放血

在心肺復(fù)蘇的模型建立1 h后，將一個21型號規(guī)格的采血針(中國江蘇省蘇州施泰瑞醫(yī)療設(shè)備有限公司)垂直插入皮膚，兩側(cè)取穴的末端深度為1 mm，以少商、商陽、中沖、關(guān)沖、少沖和少澤的順序。參考人體解剖學(xué)穴位，將比較解剖學(xué)用于穴位選擇[13]。為了使每個穴位出血15～20 μL，分別將其擠壓3～5次，然后用棉球壓縮。在24 h、48 h分別進行放血操作。假手術(shù)組和模型組的大鼠以相同的強度抓握，而穴位不刺血。

1.4 造模方法

SD大鼠術(shù)前禁食但不禁水，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔內(nèi)麻醉，備皮，仰臥位固定。經(jīng)口直視插入14號氣管鞘管。左股動脈置入23號PE-50聚乙烯管，并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理監(jiān)測儀(Siemens，Inc.，Berlin，Germany)監(jiān)測動脈血壓、心電圖和直腸溫度。手術(shù)完成后，待大鼠生理參數(shù)穩(wěn)定開始夾閉氣管插管，觀察大鼠呼吸、心搏和血壓，心搏停止以動脈收縮壓<20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)作為心臟驟停標準。心搏驟停后開始進行心肺復(fù)蘇頻率為200次/min的胸外按壓和100次/min的同步機械通氣，按壓深度為胸廓前后徑的1/3，吸入氧濃度100%。按壓2 min后，予腎上腺素0.025 mg/kg靜脈注射，持續(xù)按壓通氣10 min，期間如出現(xiàn)室顫，立即給予2 J的雙向波除顫，如自主循環(huán)恢復(fù)(Restoration of sponta-neous circulation，ROSC)則停止按壓，10 min未恢復(fù)自主循環(huán)宣布復(fù)蘇失敗。ROSC定義為恢復(fù)室上性心律，平均動脈壓(MAP)>60 mmHg，維持5 min以上。復(fù)蘇成功的動物連續(xù)監(jiān)測血流動力學(xué)1 h，術(shù)畢拔除所有插管，蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)，使用自制保溫設(shè)備使動物肛溫保持在36.5 ℃左右。

1.5 分組

24只健康雄性Sprague Dawley大鼠(體質(zhì)量222～373 g;年齡49～60 d)由中國科學(xué)院放射學(xué)研究所動物中心提供。隨機分配到4組。

1.5.1 假手術(shù)組(Control組，6只) 只行氣管插管，不誘導(dǎo)心臟驟停和進行心肺復(fù)蘇(CPR)。

1.5.2 模型組(Model組，6只) 氣管夾閉窒息法誘導(dǎo)心臟驟停后進行常規(guī)CPR。

1.5.3 手十二井穴放血組(HTWP組，6只) 氣管夾閉窒息法誘導(dǎo)心臟驟停后進行常規(guī)CPR，復(fù)蘇后1 h、24 h和48 h分別進行手十二井穴放血。

1.5.4 辣椒平組(CPZ組，6只) CPZ組大鼠于氣管夾閉窒息法誘導(dǎo)心臟驟停前45 min經(jīng)腹腔注射辣椒平20 mg/kg。心臟驟停后進行常規(guī)CPR，復(fù)蘇后1 h、24 h和48 h分別進行手十二井穴放血。

72 h后按倫理學(xué)要求處死動物，取大腦海馬組織。-80 ℃凍存,用于分子生物學(xué)研究。

1.6 觀測指標

1.6.1 紙帶移除實驗 評估復(fù)蘇后大鼠的感覺運動功能,在行復(fù)蘇術(shù)的前3 d開始對大鼠進行適應(yīng)性訓(xùn)練，并由專人負責(zé)測試并記錄時間[14]。在復(fù)蘇后72 h處死前進行正式測試、計時，取3次測試結(jié)果的均數(shù)作為測試成績。設(shè)定180 s為觀察終點，達到或超過180 s者均計為180 s。

1.6.2 神經(jīng)缺陷分數(shù)(NDS) 神經(jīng)功能通過確定神經(jīng)缺陷分數(shù)，在動物在復(fù)蘇后72 h被處死之前進行評估。神經(jīng)缺陷評分(NDS)[15]，范圍從0～80(80表示正常大腦功能)，是基于喚醒神經(jīng)系統(tǒng)反射，運動功能和簡單行為反射的測試。每組大鼠由兩名助手獨立評分，取平均值，獲得最終的神經(jīng)缺陷分數(shù)。

1.6.3 尼氏染色 將5 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。用移液器在組織上滴加適量Nissl染液,染色8 min,然后用ddH2O洗滌2次,30 s/次。再將切片進行脫水、透明,分別于95%乙醇I、95%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2、2、5、5 min,最后滴加中性樹膠、用蓋玻片封片。待自然風(fēng)干后在光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.6.4 TUNEL法檢測大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡 復(fù)蘇成功后72 h斷頭處死大鼠,取海馬組織CA1區(qū)，在4 %甲醛溶液固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，按照過氧化物酶標記的原位細胞凋亡檢測試劑盒(羅氏)說明書行TUNEL檢測。每組大鼠取5張切片，100倍顯微鏡(Olympus,CX41)下觀察大腦皮層神經(jīng)元的形態(tài)，胞核成深棕色的細胞即為凋亡細胞。

1.6.5 Western blot檢測大鼠海馬CAl區(qū)TRPV1、Caspase3及Blc-2表達 復(fù)蘇成功后72 h斷頭處死大鼠，取大鼠CA1區(qū)腦組織，冰浴勻漿，4 ℃離心(12 000 r·min-1，30 min)兩次，取上清。進行蛋白定量后，電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，加兔抗大鼠TRPV1、Caspase3及Blc-2單克隆抗體(1∶1 000)，二抗為羊抗兔IgG，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像圖像分析系統(tǒng)分析。對照選用抗β肌動蛋白抗體(β-actin)。目的蛋白與相應(yīng)β-actin蛋白的灰度比值作為該目的蛋白的相對表達量。

1.6.6 血清S100β水平檢測 麻醉后摘眼球取血3～6 mL,室溫血液自然凝固,3 000 r/min離心10 min,取上清液,-20 ℃冷藏。采用ELISA法檢測血清S100β水平。嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行操作,最后用普朗DNM-9602酶標儀進行檢測,以空白孔調(diào)零450 nm波長測每孔OD值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組紙帶移除實驗比較

Control組用時少于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),HTWP組用時少于Model組及CPZ組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠紙帶移除實驗、神經(jīng)缺陷評分

2.2 各組神經(jīng)缺陷分數(shù)(NDS)比較

Control組評分多于其他3組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),HTWP組評分多于Model組及CPZ組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 各組尼氏染色比較

甲苯胺藍染色顯示,Control組大鼠海馬神經(jīng)元細胞、胞質(zhì)內(nèi)可見深藍色斑塊狀或虎斑樣尼氏體,細胞核大,核仁明顯,無膠質(zhì)細胞增生和膠質(zhì)瘢痕形成;Model組與CPZ組大鼠海馬神經(jīng)元細胞胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體固縮壞死,溶解、液化后形成空泡樣結(jié)構(gòu);與模型組CPZ組比較,HTWP組大鼠腦組織神經(jīng)元水腫較輕,神經(jīng)元形態(tài)較好,僅見少量空泡樣改變,有部分神經(jīng)元細胞核腫大,核仁消失。見圖1。

2.4 各組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡情況比較

Control組大鼠TUNEL陽性細胞較少。心臟驟停后綜合征使大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡，而HTWP組細胞凋亡計數(shù)較Model組、CPZ組更少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2和表2。

表2 各組大鼠凋亡細胞計數(shù)

2.5 各組海馬CA1區(qū)TRPV1、Caspase3及Blc-2表達比較

HTWP組的TRPV1和Blc-2表達明顯高于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Control組與HTWP組的Caspase-3表達相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HTWP組的Caspase-3表達明顯低于Model組和CPZ組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 大鼠海馬神經(jīng)細胞Caspase-3、TRPV1及Bcl-2蛋白表達

2.6 各組血清S100β水平比較

Control組雖然低于HTWP組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.2195)。HTWP組的血清S100β水平低于Model組和CPZ組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清S100β水平

3 討論

十二井穴刺絡(luò)放血用于急救在我國有著悠久的歷史，其簡捷、高效、長于院外急救、自救及他救，彌補了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不足。心臟驟停在中醫(yī)學(xué)屬于“厥證”范疇，基本病機為氣血陰陽不相順接、陰陽離決。經(jīng)心肺復(fù)蘇呼吸循環(huán)恢復(fù)后，患者氣血陰陽初復(fù)，氣血運行無力，易出現(xiàn)瘀血痰濁上蒙清竅，故仍昏迷不醒。此時應(yīng)用手十二井穴刺絡(luò)放血可續(xù)接陰陽、活血祛瘀和化痰開竅促進病人蘇醒?！鹅`樞·九針十二原》篇曰:“病在臟者，取之井”。明代朱權(quán)所撰《乾坤生意》云：“凡中風(fēng)跌倒，卒暴昏沉、痰涎壅滯、不省人事、牙關(guān)緊閉和藥水不下，急以三棱針，刺手十指十二井穴，當去惡血，治一切暴死惡侯，不省人事，及絞腸痧，乃起死回生妙訣”，《醫(yī)宗金鑒·刺灸心法要訣》中指出：“商陽主刺卒中風(fēng)，暴仆昏沉痰涎壅，少商、中沖、關(guān)沖、少澤、商陽，使氣血流行，乃起死回生救急之妙穴”。

本研究筆者發(fā)現(xiàn)：在復(fù)蘇后綜合征發(fā)生的72 h內(nèi)，手十二井穴放血可以減少心臟驟停動物模型海馬神經(jīng)凋亡，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，但這種作用會被TRPV1受體特異性阻斷劑辣椒平所拮抗。

心搏驟停復(fù)蘇后幸存的患者往往遺留程度不等的神經(jīng)功能缺陷。準確判斷神經(jīng)功能損傷程度，對于病情觀察及治療效果的判斷有很大幫助。目前，對復(fù)蘇后大鼠神經(jīng)功能缺損的評價多采用NDS量表進行[15]。而紙帶移除實驗則是操作簡單且能比較精確評價大鼠感覺運動綜合能力的指標[14]。本研究可知：不論是NDS評分還是紙帶移除實驗，十二井穴放血組大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)程度明顯好于模型組。

尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一,其大小及數(shù)量多少能反映神經(jīng)細胞合成蛋白質(zhì)功能的程度[16],當尼氏體染色變淡,甚至溶解消失時,說明神經(jīng)元細胞正在遭受損傷，本實驗可知十二井穴放血具有較好的神經(jīng)細胞保護作用。

心臟驟停后綜合征是由缺血再灌注損傷引起的全身多組織器官的多器官功能障礙，患者的預(yù)后取決于神經(jīng)功能障礙恢復(fù)的程度[17]。腦缺血再灌注后會啟動一系列的生理改變，包括氧自由基增多、鈣超載、炎性因子釋放、BCL-2表達減少和Caspase-3等過表達，這些可引起神經(jīng)細胞凋亡[18-19]。本實驗中模型組海馬神經(jīng)A1區(qū)細胞出現(xiàn)大量凋亡，十二井穴放血組可減少神經(jīng)細胞凋亡，但這種作用會被TRPV1受體拮抗劑辣椒平阻斷。

S100蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的含量比其他組織多，是神經(jīng)系統(tǒng)的特異性蛋白，它作為腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞完整性的特異標志物被廣泛研究。S100β蛋白可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的早期標志物[20]。本研究顯示十二井穴放血組血清S100β蛋白含量低于模型組和DHC組，反應(yīng)了井穴放血對中樞神經(jīng)細胞損傷的保護作用。

眾所周知Bcl-2和Caspase-3是參與調(diào)節(jié)細胞凋亡的兩個重要蛋白。Bcl-2能夠維持和保護線粒體膜的穩(wěn)定性，因此被稱為膜穩(wěn)定蛋白，并且可以抑制自由基產(chǎn)生、維持細胞核內(nèi)鈣離子濃度和抑制caspase-3激活等，可抑制細胞凋亡早期階段[21-22]。Sueur S等[23]研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2在心肌氧化應(yīng)激損傷模型中可以特異性地抑制心肌細胞凋亡，升高胞內(nèi)Blc-2含量,可以降低心肌細胞的缺血再灌注損傷。與模型組相比井穴放血組Bcl-2表達升高、Caspase-3表達降低和凋亡細胞減少。

TRPV1是配體門控的非選擇性陽離子通道，被認為是各種疼痛刺激(如內(nèi)源性脂質(zhì)，辣椒素，熱和低pH)的重要整合劑。除了在周圍神經(jīng)中表達外，TRPV1還在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達。大量研究證實TRPV1對于缺血再灌注器官損傷具有保護作用,其機制涉及減少促凋亡因子的釋放抑制凋亡、改善線粒體功能和修復(fù)血腦屏障等各個方面[11,24-26]。

本課題組早期的研究表明激活神經(jīng)中樞TRPV1通道可以治療大鼠心臟驟停綜合征腦損傷[11]。最近有研究表明TRPV1是小鼠外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中針灸操作的響應(yīng)通道[27]。本研究也表明手十二井穴放血組TRPV1在神馬神經(jīng)的表達高于模型組，而當使用TRPV1特異性阻滯劑辣椒平預(yù)處理后手十二井穴的神經(jīng)保護作用減弱，與手十二井穴組相比其神經(jīng)功能評分下降，Bcl-2蛋白表達減少，Caspase-3蛋白表達增加，海馬凋亡細胞增多,進一步證明了TRPV1通道在井穴放血治療中的特異性。

總之，本研究結(jié)果表明，手十二井穴的放血可有效減輕心臟驟停綜合征大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡，TRPV1通道在其中起到了關(guān)鍵作用。其作用機制可能與上調(diào)Bcl-2蛋白、減少凋亡因子Caspase-3的表達和減少因缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。手十二井穴放血應(yīng)用簡便，易于推廣，療效確切，今后手十二井穴放血在復(fù)蘇后綜合征患者的神經(jīng)功能恢復(fù)的治療中將起到重要作用。