非小細(xì)胞肺癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-2α、基質(zhì)金屬蛋白酶7 的表達(dá)及臨床意義

段會娟，王希，陳嵐

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 洛陽 471000

晚期肺癌患者預(yù)后較差，5 年生存率僅為15%，但對于早期肺癌患者，其治愈率和5 年生存率均可達(dá)到80%[1-2]。非小細(xì)胞肺癌占全部肺癌的80%，多數(shù)患者就診時已錯過最佳治療時間，5 年生存率較低[3]。早期肺癌患者可通過手術(shù)清除腫瘤細(xì)胞，在適合手術(shù)切除時，應(yīng)首選手術(shù)治療。隨著臨床對非小細(xì)胞肺癌研究的不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)，有效的分子靶向治療藥物能夠提高患者的生存率。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是人體普遍存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，其中HIF-2α能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力，提高其侵襲性和轉(zhuǎn)移性，還能夠在肺中參與誘導(dǎo)腫瘤新生血管生成，同時促進(jìn)凋亡基因產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[4-5]。HIF-2α因參與腫瘤的發(fā)展而成為肺癌精準(zhǔn)治療的研究熱點(diǎn)。基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程，在多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá)。本研究旨在探討非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α、MMP7 的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020 年1 月至2021 年1 月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的非小細(xì)胞肺癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為非小細(xì)胞肺癌；②臨床資料完整；③未發(fā)現(xiàn)其他部位轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重感染；②合并心肝腎功能異常；③合并嚴(yán)重軀體性疾病；④存在活動性細(xì)菌或真菌感染。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入90 例患者。其中，男50 例，女40 例；年齡35～75歲，平均（45.22±5.12）歲；體重指數(shù)16～26 kg/m2，平均（22.35±2.25）kg/m2；腫 瘤 直 徑2～6 cm，平 均（4.25±0.22）cm。收集90 例患者的非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色方法

1.2.1 HIF-2α檢測 ①脫蠟水化。將組織蠟塊連續(xù)切片，使用烤箱烤2 h，將干燥后的切片置于二甲苯中浸泡20 min，采用96%、70%、40%梯度乙醇水化。②抗原修復(fù)。滴加3%過氧化物酶，室溫孵育10 min，設(shè)置微波溫度為98 ℃，進(jìn)行加熱，將切片置于耐高溫切片架中，于沸騰的檸檬酸緩沖液中加熱并浸泡30 min，次日采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3 min，共3 次。③取出切片，甩干。滴加150 μl山羊血清封閉液，1 h后洗去，滴加HIF-2α單克隆抗體工作液，置于4 ℃冰箱中過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，PBS沖洗3 min，鹽酸乙醇分化，滴加顯色劑二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB），蘇木素復(fù)染5 min，中性樹膠封片。

1.2.2 MMP7 檢測 全部標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，連續(xù)切片，常規(guī)石蠟包埋，二甲苯脫蠟5 min，無水乙醇浸泡1 min，PBS 沖洗4 次，滴加MMP7 單克隆抗體，恒溫孵育1 h，PBS 沖洗4 次，加入DAB 顯色劑顯色，依次使用醋、鹽酸沖洗，中性樹膠封片。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定

由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師對切片位點(diǎn)的染色結(jié)果進(jìn)行判定，在高倍鏡下（×400）觀察各個位點(diǎn)的50 個細(xì)胞，記錄染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例。染色強(qiáng)度評分：棕褐色為3 分，棕黃色為2 分，淡黃色為1 分，無色為0 分。陽性細(xì)胞比例評分：陽性細(xì)胞比例＞75%為3 分，25%～75%為2 分，＜25%為1分，無陽性細(xì)胞為0分。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞比例評分相乘，＞2分為陽性，≤2分為陰性。

1.4 觀察指標(biāo)

比較非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中HIF-2α和MMP7 陽性表達(dá)率，比較不同臨床特征非小細(xì)胞肺癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α和MMP7陽性表達(dá)率，分析HIF-2α與MMP7 表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；HIF-2α、MMP7 的相關(guān)性采用Spearman 等級相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中HIF-2α和MMP7 陽性表達(dá)率的比較

HIF-2α和MMP7 均主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α陽性表達(dá)率為55.56%（50/90），高于癌旁組織的12.22%（11/90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.716，P＜0.05）；非小細(xì)胞肺癌組織中MMP7 陽性表達(dá)率為57.78%（52/90），高于癌旁組織的8.89%（8/90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=54.955，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征非小細(xì)胞肺癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α和MMP7 表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、腫瘤類型非小細(xì)胞肺癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α和MMP7 陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腺癌、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α陽性表達(dá)率分別明顯高于鱗狀細(xì)胞癌、中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=35.583、23.223、9.720、22.952，P＜0.01）。腺癌、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中MMP7 陽性表達(dá)率分別明顯高于鱗狀細(xì)胞癌、中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.080、27.537、15.043、22.773，P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征非小細(xì)胞肺癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α和MMP7的表達(dá)情況

2.3 HIF-2α和MMP7 表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman 等級相關(guān)性分析，HIF-2α與MMP7表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.348，P＜0.05）。（表2）

表2 非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α和MMP7 的表達(dá)情況

3 討論

肺癌主要是原癌基因激活和抑癌基因失活的病理過程引起的，其臨床癥狀主要為咳嗽、發(fā)熱等。僅20%的肺癌患者在疾病早期能夠有效切除病灶，因此，對肺癌患者進(jìn)行準(zhǔn)確的病理分期可為治療策略制訂及預(yù)后評估提供依據(jù)[6-9]。肺癌的早期診斷率較低，病死率較高，手術(shù)切除是治療肺癌的主要方式，但術(shù)后患者的5 年生存率較低，死亡原因多數(shù)為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，提示手術(shù)切除并不能有效根治肺癌[10]。分析肺癌的生物學(xué)機(jī)制，選擇合適的分子標(biāo)志物，有助于患者治療和預(yù)后判斷。隨著近年來分子生物學(xué)和免疫學(xué)的不斷發(fā)展，非小細(xì)胞肺癌的研究逐漸受到臨床關(guān)注，但目前關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的分子生物學(xué)機(jī)制尚處于探索階段，其診斷及預(yù)后指標(biāo)較多，且各有特點(diǎn)[11-12]。

缺氧是腫瘤惡性增殖過程中的普遍現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞能夠通過活化HIF 對缺氧產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[13]。HIF 對腫瘤細(xì)胞增殖的影響涉及細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝等生物學(xué)過程。MMP7 可作用于細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[14]。既往有研究顯示，MMP7 在外周血、骨髓、成纖維細(xì)胞中不表達(dá)，僅在上皮起源的腫瘤中表達(dá)，因此可通過檢測患者的外周血、骨髓中MMP7 水平判斷是否發(fā)生轉(zhuǎn)移[15-16]。本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α和MMP7 陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，HIF-2α和MMP7 陽性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期密切相關(guān)，且HIF-2α與MMP7 表達(dá)呈正相關(guān)，表明HIF-2α和MMP7 在非小細(xì)胞肺癌中的異常表達(dá)與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)，聯(lián)合檢測有助于判斷患者預(yù)后。本研究中，HIF-2α主要表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞質(zhì)中，其在腫瘤壞死周圍均呈高表達(dá)，HIF-2α高表達(dá)反映其在缺氧調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[17-18]。在缺氧環(huán)境下，HIF-2α可增強(qiáng)腫瘤供血能力，增加無氧糖酵解以適應(yīng)缺氧，同時HIF-2α可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，提高化療耐受閾值[19-20]。MMP7 可減弱細(xì)胞外基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞的連接，加快腫瘤轉(zhuǎn)移，其在結(jié)直腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，研究MMP7 在肺癌中的表達(dá)及臨床意義有助于判斷肺癌患者的預(yù)后[21-22]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，是否形成轉(zhuǎn)移灶受機(jī)體免疫狀況、局部微循環(huán)等多個方面的影響，因此需要對參與研究的患者進(jìn)行長期隨訪，明確HIF-2α和MMP7 與腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)系，尋找更科學(xué)有效的治療方案，在微轉(zhuǎn)移時給予針對性治療，扼殺早期的腫瘤細(xì)胞，爭取良好預(yù)后[23-24]。然而，本研究的樣本量較少，未進(jìn)行長期隨訪，后續(xù)需要進(jìn)行多中心、大樣本量的深入研究。

綜上所述，HIF-2α和MMP7 在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，其異常表達(dá)與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。