miRNA-1305 靶向硫氧還蛋白還原酶1 對三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響△

王雨珂，田程，許新華

三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（宜昌市中心人民醫(yī)院）腫瘤科，湖北 宜昌 443000

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一種特殊類型的乳腺癌，雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2 表達(dá)皆為陰性。TNBC 是目前唯一一類無法行靶向治療的乳腺癌亞型，預(yù)后差。TNBC 多發(fā)于40 歲以下未絕經(jīng)年輕女性，占乳腺癌患者的15%～20%[1]。與其他亞型相比，TNBC 患者生存時(shí)間更短，確診后前5年的病死率達(dá)40%。TNBC 侵襲性高，約46%的患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后中位生存時(shí)間僅為13.3個(gè)月，術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)25%。非TNBC 患者平均復(fù)發(fā)時(shí)間為35～67個(gè)月，而TNBC患者則為19～40個(gè)月。TNBC 患者在復(fù)發(fā)后3 個(gè)月內(nèi)病死率達(dá)到75%[2]。由于TNBC 對內(nèi)分泌治療和靶向治療均不敏感，所以化療是其主要系統(tǒng)治療方法，但術(shù)后輔助放化療效果并不好。貝伐珠單抗在一些國家與化療藥物聯(lián)合治療TNBC，患者的生存時(shí)間未顯著延長[3]。因此，研究TNBC 的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)更多治療TNBC的有效方法。miRNA是具有19～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，可以改變基因的表達(dá)豐度，包括降低基因的表達(dá)，少數(shù)miRNA 可以誘導(dǎo)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-1305 在肺癌、肝癌及TNBC 中表達(dá)下調(diào)[4-6]。但是miRNA-1305 在TNBC發(fā)生、發(fā)展中的作用及對硫氧還蛋白還原酶1（thioredoxin reductase 1，TXNRD1）表達(dá)的影響未見報(bào)道。TXNRD1 是吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白及NADPH組成了硫氧還蛋白系統(tǒng)，在氧化還原平衡中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TXNRD1 在TNBC 中表達(dá)顯著上調(diào)[7]。本研究主要探究miRNA-1305 在TNBC 細(xì)胞MDAMB-231 中的表達(dá)水平及其上調(diào)后對TXNRD1 表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 購自協(xié)和細(xì)胞資源中心。DMEM/F12 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司，馬血清購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司，miRNA-1305 mimic 購自上海瑞基生物科技有限公司，B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）鼠單克隆抗體、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）鼠單克隆抗體、cleaved caspase 3 鼠單克隆抗體、TXNRD1 兔單克隆抗體、GAPDH 鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記抗鼠抗兔抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司。胰蛋白酶、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液、5×loading buffer、SYBR Green Ⅰ及電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）超敏發(fā)光液均購自北京索萊寶科技有限公司，CCK8 試劑盒、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將MDA-MB-231 細(xì)胞隨機(jī)分為3 組：Con 組（對照組）、miRNA NC 組（陰性對照組）和miRNA-1305 mimic 組。使用Lipofectamine 2000 將miRNA-1305 mimic 和NC 轉(zhuǎn) 染至MDA-MB-231 細(xì)胞，Con 組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。MDA-MB-231 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行處理。

1.2.2 CCK8 檢測細(xì)胞活力 MDA-MB-231 細(xì)胞按上述方法轉(zhuǎn)染處理后以104/孔密度接種到96 孔板。放至孵育箱培養(yǎng)24 h 后，加入CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，在450 nm 處測定光密度（optical density，OD）值。細(xì)胞活力=（OD實(shí)驗(yàn)-OD對照）/OD對照×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取均值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將MDA-MB-231 細(xì)胞接種至6 孔板，105/孔，然后按1.2.1 中的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收集各組細(xì)胞。細(xì)胞用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）漂洗，然后加入1×binding buffer 重懸細(xì)胞。加入Annexin V-FITC 和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液各5 μl 混勻，室溫避光孵育10 min。細(xì)胞在1 h 內(nèi)使用BD Accuri C6 流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)。

1.2.4 Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白 收集Con組、miRNA NC 組和miRNA-1305 mimic 組的MDAMB-231細(xì)胞，使用加入蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞提取蛋白，使用BCA 法測定提取的蛋白濃度，提取蛋白液加入loading buffer 后95 ℃處理變性。取30 μg 蛋白樣本進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate- polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）后，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，使用5%脫脂牛奶（1×TBST）室溫封閉1 h，加入Bcl-2、cleaved caspase 3、BAX、TXNRD1、β-actin 抗體4 ℃孵育過夜。用1×TBST洗滌3 次后再加入二抗室溫孵育2 h，加入ECL 超敏發(fā)光液后用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miRNA-1305 基因表達(dá) 使用miRcute miRNA 提取分離試劑盒提取miRNA-1305，然后使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈。用SYBR Green ⅠPCR 試劑在ABI Stepone Plus Real-time PCR 儀器中進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-1305在細(xì)胞中的相對表達(dá)量。引物序列：miRNA-1305正向，5′-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3′，反向，5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；U6正向，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，反向，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。

1.2.6 Kaplan-Meier 生存分析 采用KM Plot 數(shù)據(jù) 庫（https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service）收集203 例TNBC 患者基因表達(dá)譜及預(yù)后生存信息，輸入目的基因miRNA-1305，dataset 選擇METABRIC（n=1262），依據(jù)cut-off=6.54 將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，輸出與目的基因相關(guān)的總生存期及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 3 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-1305 相對表達(dá)量的比較及對TNBC患者總生存期的影響

TNBC 細(xì) 胞MDA-MB-231 轉(zhuǎn) 染 后，miRNA-1305 mimic 組miRNA-1305 相對表達(dá)量明顯高于Con 組和miRNA NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。利用KM Plot 數(shù)據(jù)庫對203 例TNBC患者進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-1305 低表達(dá)的TNBC 患者總生存期短于miRNA-1305 高表達(dá)患者（HR=0.59，95%CI：0.37～0.96，P=0.032）（圖1）。

表1 3組MDA-MB-231細(xì)胞中miRNA-1305相對表達(dá)量的比較（±s）

注：*與miRNA-1305 mimic組比較，P＜0.01

圖1 miRNA-1305低表達(dá)（n=51）與高表達(dá)（n=152）TNBC患者的生存曲線

2.2 MDA-MB-231 細(xì)胞活力的比較

miRNA-1305 mimic 組MDA-MB-231 細(xì) 胞 的OD 值明顯低于miRNA NC 組和Con 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 3 組MDA-MB-231 細(xì)胞OD 值的比較（±s）

注：*與miRNA-1305 mimic組比較，P＜0.01

組別Con組miRNA NC組miRNA-1305 mimic組OD值100.00±4.36*100.00±4.00*53.00±7.56

2.3 MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的比較

miRNA-1305 mimic 組MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡率 高 于Con 組 和miRNA NC 組，miRNA NC 組MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡率與Con 組相比，無顯著差異。（圖2）

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測3組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況

2.4 Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3 和TXNRD1蛋白表達(dá)的比較

miRNA-1305 mimic 組細(xì)胞中Bcl-2、TXNRD1蛋白相對表達(dá)量明顯低于Con 組和miRNA NC 組，BAX 和cleaved caspase 3 蛋白相對表達(dá)量明顯高于Con組和miRNA NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；miRNA NC 組與Con 組細(xì)胞中Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3 和TXNRD1 蛋白相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖3、表3）

表3 3 組MDA-MB-231 細(xì)胞中Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3 和TXNRD1 蛋白表達(dá)的比較（±s）

表3 3 組MDA-MB-231 細(xì)胞中Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3 和TXNRD1 蛋白表達(dá)的比較（±s）

注：*與miRNA-1305 mimic組比較，P＜0.01

組別Con組miRNA NC組miRNA-1305 mimic組Bcl-2 0.81±0.19*0.79±0.23*0.35±0.17 BAX 0.41±0.17*0.38±0.16*0.78±0.22 cleaved caspase 3 0.51±0.16*0.59±0.19*1.01±0.20 TXNRD1 0.78±0.22*0.83±0.20*0.28±0.17

圖3 Western blot法檢測3組MDA-MB-231細(xì)胞中Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3和TXNRD1蛋白表達(dá)情況

3 討論

2015 年miRNA-1305 首次被報(bào)道能破壞吸煙者的牙周膜干細(xì)胞[8]。在非小細(xì)胞肺癌中miRNA-1305 下調(diào)后加快腫瘤的轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后更差[8]。此外，miRNA-1305 通過競爭性結(jié)合泛素結(jié)合酶E2T 抑制蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路激活進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖[5]。這說明miRNA-1305 具有抑癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1305 可以抑制TNBC 細(xì)胞MDA-MB-231 活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，延長TNBC患者生存期。

硫氧還蛋白系統(tǒng)是一個(gè)重要的抗氧化系統(tǒng)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)和放療敏感性。該系統(tǒng)包括硫氧還蛋白、TXNRD1、NADPH、內(nèi)源性硫氧還蛋白抑制劑和硫氧還蛋白相關(guān)蛋白[9]。TXNRD1 是細(xì)胞主要的氧化還原調(diào)節(jié)因子，腫瘤細(xì)胞通常高表達(dá)硫氧還蛋白和TXNRD1 以應(yīng)對活性氧的升高，抑制TXNRD1能夠使活性氧升高從而增加乳腺癌細(xì)胞對放療的敏感性[10]。硫氧還蛋白水平升高促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長及對化療藥物的抗性[11]。TNBC 患者TXNRD1 表達(dá)水平顯著上調(diào)，抑制TXNRD1 促進(jìn)了TNBC 細(xì)胞的凋亡[12]。沉默TXNRD1及TXNRD1 抑制劑auranofin 均能引起活性氧升高，增強(qiáng)賴氨酰氧化酶對MDA-MB-231 細(xì)胞的殺傷作用[13]。TXNRD1 是miRNA-1305 的靶蛋白之一[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miRNA-1305 表達(dá)抑制了TXNRD1 蛋白的表達(dá)。

細(xì)胞凋亡主要受死亡受體和線粒體通路調(diào)控，二者均可激活起始caspase 并激活效應(yīng)caspase（caspase 3）。Bcl-2 家族蛋白通過線粒體通路介導(dǎo)細(xì)胞色素C 等物質(zhì)的釋放而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，miRNA-1305 通過下調(diào)Bcl-2，上調(diào)BAX、cleaved caspase 3 蛋白的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，miRNA-1305 通過調(diào)節(jié)TXNRD1的表達(dá)影響MDA-MB-231 細(xì)胞的凋亡，這為以miRNA-1305 為靶點(diǎn)治療TNBC 提供了新的依據(jù)和方向。