比色監(jiān)控在索林乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑吸光度值監(jiān)控中的應(yīng)用

王 娟，張巧琳，龔 彬，楊婷婷, 王 芳，王 成

(1. 重慶市血液中心檢驗科，重慶 400015；2. 重慶市巴南區(qū)婦幼保健院檢驗科，重慶 401320；3. 奧斯邦有限公司，山東 煙臺 264000)

近年來，隨著全自動加樣系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，微量檢測樣本漏加或重復(fù)加樣事件的發(fā)生逐漸減少，但仍未完全杜絕[1-4]。為防止全自動化檢測過程中檢測樣本漏加及加樣量不準(zhǔn)的發(fā)生，采供血機構(gòu)實驗室、設(shè)備廠家、試劑廠家都在積極地探討并采取各種措施，但仍未從根本上解決這一問題。比色法作為一種定量分析方法，可通過比較或測量有色化合物的顏色深度來確定待測組分的含量。有研究指出，利用此方法可有效監(jiān)測酶免實驗樣本及試劑的添加情況[5-6]。ELISA 是國內(nèi)采供血機構(gòu)對經(jīng)血傳播疾病進(jìn)行篩查的主要手段。索林乙肝抗原診斷試劑中添加了有色化合物，具備利用比色法來進(jìn)行添加監(jiān)測的基礎(chǔ)。我國是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染大國[7-10]。在血液篩查中加強對HBV 的篩查具有重要的意義。在本文中，筆者主要是利用比色原理進(jìn)行索林Murex HBsAg Version 3 乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑及相關(guān)樣本加樣過程的吸光度(0ptical DeInsit，OD) 值監(jiān)控，旨在杜絕漏加事件的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與工具

本中心無脂血、溶血的獻(xiàn)血標(biāo)本1406 份；3個批次的索林乙肝表面抗原診斷試劑盒，批號分別 為D803110、D845110、D866910 ；Hamilton-Star 移液工作站（Hamilton，瑞士）；全自動后處理系統(tǒng)FAME 全自動酶免分析儀（澳斯邦，瑞士）；酶免過程監(jiān)控軟件。

1.2 方法

檢測方法：嚴(yán)格按照索林乙肝表面抗原診斷試劑盒說明書進(jìn)行操作，首先計算使用足量樣品稀釋液加上樣本在570 nm/620 nm 波長下的OD值；然后取樣本稀釋液加入樣本后讀數(shù)的中值，以確保設(shè)定的范圍能夠覆蓋所有的實驗結(jié)果。將未加入樣本的孔排除。同樣的原理也適用于酶結(jié)合物的監(jiān)測階段。計算酶結(jié)合物490 nm/690 nm 波長下的OD 值及底物液在490 nm 波長下的OD 值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 樣本及試劑的比色監(jiān)控數(shù)據(jù)

3 個批次的試劑加標(biāo)本后在620 nm/690 nm波長下的平均OD 值分別為0.637、0.616、0.679，加酶后在492 nm/690 nm 波長下的平均OD 值分別為0.915、0.883、0.885，加顯色劑后在492 nm波長下的平均OD 值分別為0.145、0.147、0.145。詳見表1 ～表3。

表1 樣本及試劑的比色監(jiān)控數(shù)據(jù)（批號D803110）

表3 樣本及試劑的比色監(jiān)控數(shù)據(jù)（批號D866910）

表2 樣本及試劑的比色監(jiān)控數(shù)據(jù)（批號D845110）

2.2 樣本及試劑加樣過程比色監(jiān)控OD 值的確定

對3 個批次試劑加標(biāo)本后在620 nm/690 nm波長下的平均OD 值采用SNK-q 檢驗進(jìn)行兩兩比較的結(jié)果顯示，D845110、D803110 加標(biāo)本后在620 nm/690 nm 波長下的平均OD 值處于同一子集中，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；D866910與上述兩批次的試劑加標(biāo)本后在620 nm/690 nm波長下的平均OD 值處于不同的子集，差異有統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P＜0.05）。因 此，取D845110、D803110 兩批次試劑加標(biāo)本后在620 nm/690 nm波長下平均OD 值的中位數(shù)0.626 作為相應(yīng)的監(jiān)控OD 值。對3 個批次試劑加酶后在492 nm/690 nm波長下的平均OD 值采用SNK-q 檢驗進(jìn)行兩兩比較的結(jié)果顯示，D845110、D869110 加酶后在492 nm/690 nm 波長下的平均OD 值處于同一子集中，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；D803110 與上述兩批次的試劑加酶后在492 nm/690 nm 波長下的平均OD 值處于不同的子集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，取D845110、D869110兩批次試劑加酶后在492 nm/690 nm 波長下平均OD 值的中位數(shù)0.881 作為相應(yīng)的監(jiān)控OD 值，以確保設(shè)定的范圍能夠覆蓋所有的實驗結(jié)果。對3個批次試劑加顯色劑后在492 nm 波長下的平均OD 值采用SNK-q 檢驗進(jìn)行兩兩比較的結(jié)果顯示，3 個批次試劑加顯色劑后在492 nm 波長下的平均OD 值均處于同一子集中，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此，取3 個批次試劑加顯色劑后在492 nm 波長下平均OD 值的中位數(shù)0.145 作為相應(yīng)的監(jiān)控OD 值。

2.3 對樣本及試劑加樣過程進(jìn)行比色監(jiān)控的方法

使用監(jiān)控軟件對樣本及試劑加樣過程進(jìn)行比色監(jiān)控，如實驗過程中出現(xiàn)OD 值低于下限的情況，軟件會報警提示加樣量不足。詳見圖1。

圖1 樣本及試劑加樣過程比色監(jiān)控軟件的報警提示界面

3 討論

目前，我國現(xiàn)存HBV 感染者約有7000 萬例[11-12]。輸血傳播是一種重要的HBV 傳播途徑。進(jìn)行嚴(yán)格的血液HBV 篩查對保障輸血安全而言至關(guān)重要[13-15]。目前，大多血站都使用高靈敏度和高特異度的ELISA 試劑及全自動的儀器進(jìn)行血液HBV 篩查。但有研究發(fā)現(xiàn)，使用全自動檢測設(shè)備進(jìn)行ELISA 實驗時自動加樣系統(tǒng)受多種因素的影響可能會出現(xiàn)加樣偏差，嚴(yán)重時甚至?xí)霈F(xiàn)漏加樣現(xiàn)象[16]。有研究表明，加樣誤差可在不同程度上影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[17-20]。監(jiān)控ELISA 實驗過程中樣本及試劑加樣量的準(zhǔn)確性具有十分重要的意義。本研究創(chuàng)新性地提出利用比色法對全自動加樣儀及酶聯(lián)后處理加樣過程進(jìn)行主動監(jiān)控，這樣不僅可完全代替人員觀察，還能反映出各個酶標(biāo)板孔加樣過程中的所有情況。本實驗共收集1406 份血液標(biāo)本，根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行樣本和試劑的添加，共采用3 個批次的試劑進(jìn)行了比色驗證，得出足量樣品稀釋液加上樣本在570 nm/620 nm 波長下的OD 值應(yīng)該大于0.626（未達(dá)到表明稀釋液或樣本加樣不足），酶結(jié)合物在490 nm/690 nm 波長下的OD 值應(yīng)該大于0.881（未達(dá)到表明加酶量不足），底物液在490 nm 波長下的OD 值應(yīng)該大于0.145（未達(dá)到表明顯色液添加不足）。這與相關(guān)研究的結(jié)果相符[21-22]。本研究中不僅進(jìn)行了索林乙肝診斷試劑及樣本加樣比色驗證實驗，還創(chuàng)新性地提出通過酶標(biāo)儀比色監(jiān)測OD 值的變化，進(jìn)而對整個ELISA 實驗進(jìn)行監(jiān)控的思路，并設(shè)計了監(jiān)控軟件（軟件設(shè)計思路見圖2）。監(jiān)控軟件可對ELISA 實驗過程中的3 次比色結(jié)果進(jìn)行抓取，并與實驗得出的準(zhǔn)確值進(jìn)行比對。將其與實驗室(LIS) 系統(tǒng)相連后可將數(shù)據(jù)匯總給LIS。LIS 統(tǒng)計數(shù)據(jù)后，可對異常值進(jìn)行預(yù)警，從而可真正做到對檢測全過程進(jìn)行監(jiān)控并記錄。對于各讀數(shù)結(jié)果未達(dá)到臨界值的檢測，可自動判斷其結(jié)果無效。這對于提高血液HBV 的篩查質(zhì)量，保證輸血安全具有重要的意義。

圖2 比色監(jiān)控軟件設(shè)計思路