腹腔感染致膿毒癥實驗動物模型建立方法的研究進展

何振華，李永成，朱高勇

（賀州市人民醫(yī)院，廣西 賀州 542800）

膿毒癥是人體對感染反應失調所導致的一種全身炎癥反應綜合征。此病可引發(fā)全身炎癥反應，是導致人類死亡的重要疾病之一[1]。在臨床ICU，腹腔感染所致膿毒癥的發(fā)生率較高，達到40% 左右，其致死率約為36%[2-3]。近年來隨著我國醫(yī)療技術的提高，臨床上對于膿毒癥的治療取得了一定進展，但其發(fā)病率和致死率仍較高[4]。腹腔感染是腹部外科的常見病，多繼發(fā)于消化道穿孔、闌尾炎、腸梗阻、腸壞死等腹部疾病或腹部手術后并發(fā)癥（如胃腸道瘺）[5]。腹腔感染若處理不及時，易發(fā)展為膿毒癥。膿毒癥發(fā)病十分迅速，且病情兇險，臨床治療的難度較大，患者的預后差。人類膿毒癥的發(fā)病過程首先是急性促炎因子的爆發(fā)，然后是代償性抗炎階段，最后是免疫抑制階段[6-7]。膿毒癥動物模型的建立有利于本病的研究，能夠為膿毒癥發(fā)生機制的研究提供新思路。但實際上，由于膿毒癥動物模型存在引發(fā)劑性質不同、疾病發(fā)展時間不同、膿毒癥發(fā)展過程中有無合并癥及缺乏在人類膿毒癥治療中常用的支持治療（如液體復蘇、使用血管活性藥物、呼吸機等）等問題，導致膿毒癥動物模型受到部分研究者的質疑[8]。未來膿毒癥動物模型的研究可集中在減少這些變異因素方面，以便更接近人類膿毒癥模型。腹腔感染模型是目前最常采用的膿毒癥動物模型，近年來受到許多研究者的關注。本文主要是對腹腔感染致膿毒癥實驗動物模型建立方法的研究進展進行綜述。

1 膿毒癥實驗動物模型的選擇

實驗動物模型的應用克服了在人身上研究的限制，避免了對人體進行臨床試驗所帶來的風險及倫理學問題。通常來說，臨床上的膿毒癥是十分復雜的，許多膿毒癥患者本身就伴有其他嚴重的非相關性疾?。ㄈ缧呐K病、呼吸系統(tǒng)疾病等），這會對膿毒癥的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生較大的影響，往往難以判斷患者的發(fā)病時間及具體病情[9]。應用膿毒癥動物模型則排除了臨床研究過程中其他因素的干擾，且可以從性別、年齡、體重、遺傳等方面控制實驗動物，能更客觀地反應膿毒癥的發(fā)病過程[10]。當前可用于建立膿毒癥模型的動物品種較多，各類動物又有其不同的特點，可用于不同目的的研究[11]。到目前為止，小型哺乳動物如大鼠、小鼠仍然是最好的動物模型，應用最為廣泛，原因是可以建立大量性別、年齡相同、遺傳相似度高的實驗模型，且其價格低，易于管理。Sato[12]等利用特定基因敲除小鼠研究其在膿毒癥期間發(fā)生的免疫功能變化，從而對膿毒癥的發(fā)生機制進行了研究。在選擇膿毒癥動物模型時，需結合其年齡、性別、品系等因素。Zellweger 等[13]首次報道不同性別膿毒癥小鼠模型的差異，他們建模后發(fā)現(xiàn)雄性小鼠的10 d 存活率低于雌性小鼠，其脾細胞增殖能力及白細胞介素-2（interleukin，IL-2）、IL-3 的釋放量明顯降低，但與雌性膿毒癥小鼠無明顯差異。有研究報道，與年輕膿毒癥小鼠相比，老齡膿毒癥小鼠的死亡率更高，且建模后24 h 其血IL-6 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）的水平均較高，對抗生素治療更為敏感[14]。宋景春等[15]選用BALB/c 小鼠和昆明（KM）小鼠建立膿毒癥模型進行研究，發(fā)現(xiàn)BALB/c 小鼠對膿毒癥盲腸結扎模型的敏感度更高，說明不同品系的動物能夠對膿毒癥模型造成影響。因此，研究者可結合自己的研究目的，選擇適宜的實驗動物。

2 常用腹腔感染致膿毒癥動物模型的建立方法

目前，腹腔感染致膿毒癥動物模型的建立方法有注射法和外科手術法，其中注射法包括腹腔注射內毒素、細菌或糞便顆粒等，而通過外科手術建立的腹腔感染致膿毒癥動物模型則多為盲腸結扎穿孔模型（cecal Ligation and Puncture，CLP）和腹腔持續(xù)置管引流模型（colon Ascendens Stent Peritonitis，CASP）。

2.1 注射法

2.1.1 內毒素注射模型 內毒素廣泛存在于革蘭陰性菌細胞壁的外膜中，屬于一種脂多糖成分，其廣泛用于臨床研究中，如通過內毒素血癥模型研究炎癥相關機制和細胞因子譜。相關的研究指出，通過給志愿者注射少量的內毒素，可引起較多的輕微癥狀，如體溫升高、頭痛等，但以上癥狀在數(shù)小時后均可消退[16]。在人體實驗中，內毒素所致敗血癥的特點是通過增加循環(huán)血漿中宿主炎性反應介質（如TNF-α、IL-6、IL-10 等）的濃度，使炎性細胞因子的表達逐漸及長期升高[17]。通過腹腔注射內毒素能引起小鼠膿毒癥樣癥狀，將類似于某些爆發(fā)的人類革蘭陰性菌感染的病理生理變化充分表現(xiàn)出來，而大劑量注射內毒素通常會引起促炎細胞因子急性且短暫的升高[18]。有研究報道，內毒素可損害心肌的收縮能力，并增加循環(huán)中TNF-α、IL-6 的濃度[19]。與人類相比，小鼠對脂多糖毒性或致死效應的敏感性要低得多，因此，它們需要更高劑量的脂多糖來顯示這種效應。由此可見，脂多糖誘導的膿毒癥小鼠模型不能準確反映人類膿毒癥的特點，有一定的局限性。

2.1.2 特定的細菌接種模型 特定的細菌接種模型是指將已知數(shù)量的細菌及輔助物質混合接種于腹腔內所建立的腹腔感染致膿毒癥動物模型[20]。此類動物模型的死亡率取決于注射細菌的數(shù)量及所使用的液體和抗生素[7]。雖然此類動物模型是可控、可復制的，但如果注射劑量掌握不好，就會導致細菌不會在宿主體內定植，也不能繁殖，反而會立即被機體的補體系統(tǒng)裂解，使其被包裹，進而形成局部膿腫，難以引起腹腔感染及膿毒癥[19]。故細菌接種模型的應用受到一定限制。

2.1.3 糞便顆粒模型 糞便顆粒模型一般是指通過向動物的腹腔內注射含有糞便及輔助物顆粒所建立的腹腔感染致膿毒癥動物模型。建立此類動物模型的操作較為簡單，但首先需要初步制備樣品，并對其細菌的組成進行標準化[21]。與經(jīng)典的膿毒癥動物模型不同的是，通過向腹腔注射糞便顆粒建立的膿毒癥動物模型可能會出現(xiàn)強烈的免疫反應，導致其早期死亡，難以再現(xiàn)膿毒癥的血流動力學和代謝的改變[22]。此類動物模型膿毒癥的動態(tài)變化是通過改變糞便顆粒內容物的量來調控的，由于某些細菌在樣品制備過程中死亡，因此可在一定程度上影響實驗效果。此外，糞便顆粒提供了腹膜炎后腹腔膿腫的模型，而不是腹腔敗血癥模型。因此，該模型是難以控制和復制的，現(xiàn)已逐漸被其他模型所取代。

2.2 外科手術法

2.2.1 盲腸結扎穿孔（CLP）模型 建立CLP 模型的操作方法較多，經(jīng)典方法是[23]：首先對大鼠進行麻醉，在無菌條件下用手術刀在其腹壁作一長約2 cm 的切口，經(jīng)切口進入腹腔，尋找盲腸，采用無菌絲線將盲腸的遠端結扎，并選擇相應的無菌針頭在已經(jīng)結扎的盲腸端進行貫通穿刺，將少量的盲腸內容物擠出，以保證穿刺孔的通暢。之后將盲腸推回腹腔內，將腹腔關閉，最后進行逐層縫合操作。CLP 模型的建立主要是通過外科手術的方式，將一定量含有混合細菌的糞便漏入腹腔內，且腹腔內存在失活組織（結扎的盲腸），從而導致腹腔感染并引起腹膜炎，出現(xiàn)膿毒癥的臨床癥狀（如發(fā)熱、食欲不振、嗜睡等），最后導致實驗動物因膿毒癥休克而死亡，其病理生理變化過程與臨床情況十分接近，且能對臨床上的闌尾炎或憩室炎穿孔的特點進行模擬。有學者通過對內毒素攻擊模型和CLP 模型的病理生理反應進行比較，發(fā)現(xiàn)二者在細胞因子反應的數(shù)量上存在明顯差異，從而可充分反映高代謝和晚期低動力循環(huán)的血流動力學變化過程及臨床膿毒癥患者的早期高動力循環(huán)情況[24]。近年來，許多學者利用CLP模型進行抗感染、代謝、凋亡、細胞因子和免疫功能等方面的研究，均取得了一定成效[25]。CLP模型具有諸多優(yōu)勢，如易于標準、操作簡單，且具有較好的可重復性，能夠將不同的變量因素引入，包括動物的性別、年齡、種類、盲腸結扎長度、穿刺孔數(shù)目、穿刺孔大小、術后液體復蘇及抗生素的應用等[26]。在決定模型死亡率和炎癥反應程度的重要因素中，盲腸結扎長度、穿刺孔大小及數(shù)目所占的比例較高。但該模型也有一定的缺點，如在建立模型后，難以估計流入腹腔內腸內容物的量，有時腸內容物會被包裹，表現(xiàn)為局限性炎癥，難以發(fā)展為膿毒癥。因此，今后還需通過更深入的研究來改進和完善CLP 模型，使之更加標準化。

2.2.2 腹腔持續(xù)置管引流（CASP）模型 Traeger等[27]報道，CASP 模型的建立方法較多，其中經(jīng)典方法是：首先按照建立CLP 模型的方法將大鼠的腹腔打開，尋找盲腸，將用靜脈輸液BD 針制作的支架固定在距離回盲部1 ～1.5 cm 處的升結腸壁，使腸腔與腹腔相通，并采用棉簽進行輕輕按壓，從而保證腸內容物能夠從置管中溢出。完成上述操作后，將適量的生理鹽水置入腹腔內，最后關閉腹腔，逐層縫合傷口。與CLP 模型相比，CASP 模型是一種新型的膿毒癥動物模型，其建模原理是：通過在升結腸壁置入用靜脈輸液BD針制作的支架，使腸腔與腹腔相通，導致腸內容物持續(xù)滲漏至腹腔內，從而引起腹腔感染，隨著病程的不斷進展，最終可發(fā)展為膿毒癥和多器官衰竭。上述病理變化與腸瘺的病理變化十分相似。研究發(fā)現(xiàn)，建模成功后，CASP 模型炎性細胞因子的水平會逐漸升高。以往的研究表明，CASP 模型中不同管徑的支架與動物血清細胞因子水平的變化、生存率之間存在密切的相關性，即支架的管徑越大，動物的生存率越低，其變化幅度與CLP模型相比更加顯著[28-29]。用小支架建立的CASP模型適合長期研究和輕- 中度膿毒癥的研究[30]。由此可見，通過對置入支架管徑的大小進行改變，可對膿毒癥動物模型的炎癥程度進行控制。有學者通過對小鼠的體溫進行研究，將CASP 小鼠模型分為兩組，即輕癥組（體溫＜32℃）和重癥組（體溫≥32℃），結果發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠在血清細胞因子、外周血白細胞計數(shù)、生存率等方面存在明顯的差異性，提示通過監(jiān)測體溫能夠對膿毒癥動物模型的嚴重程度進行早期預測[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，CASP 大鼠模型在手術18 h 后其肝、腎、肺和心臟的代謝組學及病理生理變化均較大，說明建模后時間點的選擇對判斷膿毒癥很重要[32]。與CLP模型相比，CASP 模型的炎性細胞因子水平會持續(xù)升高，原因是隨著時間的推移，CASP 模型的腸內容物會持續(xù)滲漏。而在CLP 模型中，由于早期腸粘連的形成，病灶被包裹，炎癥較為局限。CASP模型的缺點是建模相對復雜，存在差異性，另外糞便內的細菌會持續(xù)進入動物的腹腔，無法控制。對于CLP 模型而言，其研究的重點是局限性腹腔膿腫形成的病理變化；對于CASP 模型而言，其主要用于研究彌漫性腹膜炎的臨床病程。

3 小結

本研究中分析了腹腔感染致膿毒癥實驗動物模型建立的幾種常用類型及常用方式。由于動物發(fā)生膿毒癥的病理生理過程與人類有所不同，因此需選擇適宜的動物模型用于實驗研究，并保證研究具有可重復性，同時應盡量與臨床的膿毒癥實驗動物模型接近，以達到順利完成實驗、提高實驗質量的目的。