短鏈脂肪酸通過(guò)抑制HDAC8/9促進(jìn)PD小鼠腸道細(xì)胞炎癥反應(yīng)

喬晨萌，孫孟菲，李 陽(yáng)，徐一諾，賈雪冰，王增妹，張博枰，趙麗萍，崔 春，申延琴*

（1. 江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)退行和損傷研究室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是發(fā)病率第二的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病與年齡相關(guān)，高發(fā)人群年齡段為65～70 歲，且隨年齡增長(zhǎng)患病風(fēng)險(xiǎn)成倍增加［1］。目前認(rèn)為，PD 的發(fā)病與年齡因素、遺傳因素（α-突觸核蛋白，Parkin、DJ-1、PINK1、LRRK2等突變）和環(huán)境因素如1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahy dropyridine，MPTP）、魚藤酮、除草劑/殺蟲劑、蛋白酶體抑制劑，等密切相關(guān)，然而其具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚且缺乏行之有效的治療手段［2-3］。近年發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失衡在PD 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［4-6］，但機(jī)制尚不清楚。多項(xiàng)研究［7-8］表明腸道菌群組成變化和菌群代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）的改變與PD 的發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)相關(guān)。Sampson 等［9］發(fā)現(xiàn)給無(wú)菌小鼠喂食腸道菌群代謝物SCFA 會(huì)加劇其運(yùn)動(dòng)障礙。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，利用糞菌移植法糾正MPTP 誘導(dǎo)PD小鼠的腸道菌群紊亂的同時(shí)，伴隨其糞菌中SCFA異常升高現(xiàn)象的顯著緩解［10］。以上研究均提示SCFA可能參與影響PD疾病的進(jìn)展。

SCFA 是指碳鏈為1～6的有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸等，三者總含量約占SCFA的90%～95%。作為腸道菌群的主要代謝物之一，SCFA對(duì)腸道炎癥的調(diào)節(jié)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究［11］發(fā)現(xiàn)，SCFA 能夠調(diào)節(jié)腸道的免疫應(yīng)答，能通過(guò)抑制組蛋白乙?；福℉istone deacetylase，HDAC）調(diào)節(jié)基因表達(dá)（如抑制COLO205細(xì)胞中IL-8和巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-12等促炎因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)）［12］。2016年，Sanford和他的同事發(fā)現(xiàn)SCFA 丁酸對(duì)單核細(xì)胞中Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有抑制作用，而對(duì)角質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生則具有促進(jìn)作用，并且HDAC8 和HDAC9 控制這些促炎因子的表達(dá)［13］。以上提示SCFA 能通過(guò)HDAC 途徑參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。

越來(lái)越多的證據(jù)表明腸道炎癥會(huì)加劇PD 的進(jìn)程。Gil-Martínez 等［14］發(fā)現(xiàn)，在帕金森病嚙齒類動(dòng)物模型中，胃腸道損傷引發(fā)全身性炎癥會(huì)加劇多巴胺能神經(jīng)元的死亡。提示結(jié)腸炎癥能夠影響MPTP處理的小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性的進(jìn)展。Villumsen 等［15］針對(duì)1977至2014年的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸道疾病的患者罹患PD 的風(fēng)險(xiǎn)更高。因此，腸道炎癥與PD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

基于上述研究背景，本研究提出科學(xué)問題：腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFA 是否通過(guò)HDAC 途徑參與調(diào)節(jié)PD 模型小鼠腸道炎癥？本研究分別觀察了SCFA 對(duì)帕金森病模型小鼠的腸道炎癥以及對(duì)腸內(nèi)分泌細(xì)胞炎癥的影響，并且利用小核糖核酸干擾技術(shù)進(jìn)行作用機(jī)制的驗(yàn)證，旨在闡明SCFA 參與PD 腸道炎癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞系和試劑

本實(shí)驗(yàn)所用SPF級(jí)的7周齡C57BL/6J雄性小鼠購(gòu)于昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司。STC-1細(xì)胞系購(gòu)于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。MPTP 鹽酸鹽、乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉、多巴胺鹽酸鹽、3，4-二羥基苯乙酸（3，4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）、高香草酸（homovanillic acid，HVA）、5-羥色胺（serotonin，5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）、甲醇（HPLC 級(jí)）、乙腈（HPLC 級(jí)）購(gòu)于北京百靈威科技有限公司；0.9%無(wú)菌生理鹽水購(gòu)于華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司；高氯酸（AR 級(jí)）、多聚甲醛購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS 溶液、青鏈霉素雙抗購(gòu)于Gibco 公司；qPCR 相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa 公司；TRIzol試劑和Lipofectamine 2000購(gòu)于Thermo公司。

1.2 MPTP 誘導(dǎo)PD 小鼠模型的構(gòu)建與短鏈脂肪酸處理

1.2.1 MPTP 誘導(dǎo)的亞急性PD 小鼠模型構(gòu)建 將MPTP鹽酸鹽溶于無(wú)菌生理鹽水中，濃度為3 mg/mL。按照30 mg/kg·d 的給藥劑量對(duì)8 周齡雄性C57BL/6J小鼠連續(xù)進(jìn)行5 d 腹腔注射。對(duì)照組小鼠在同等操作下注射相同體積的無(wú)菌生理鹽水（即每10 g 小鼠體重對(duì)應(yīng)100 μL無(wú)菌生理鹽水），見圖1。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程示意圖

1.2.2 短鏈脂肪酸處理 將乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉分別溶解于無(wú)菌水中，濃度分別為150、150、100 mmol/L；混合酸溶液包含67.5 mmol/L 乙酸鈉、40 mmol/L 丙酸鈉和25.9 mmol/L 丁酸鈉［9］。所有短鏈脂肪酸溶液均現(xiàn)配現(xiàn)用。灌胃的劑量為每10 g小鼠體重對(duì)應(yīng)100 μL短鏈脂肪酸溶液，對(duì)照組為相同體積的無(wú)菌水。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)組別 將小鼠隨機(jī)分為6 組，分別為：①空白對(duì)照組小鼠：連續(xù)5 d 腹腔注射無(wú)菌生理鹽水（與MPTP 溶液等體積），之后連續(xù)7 d灌胃無(wú)菌水（與SCFA 溶液等體積）；②PD 模型組：連續(xù)5 d腹腔注射MPTP 溶液，之后連續(xù)7 d 灌胃無(wú)菌水；③乙酸處理組：連續(xù)5 d 腹腔注射MPTP 溶液，之后連續(xù)7 d灌胃乙酸鈉溶液；④丙酸鈉處理組：連續(xù)5 d腹腔注射MPTP 溶液，之后連續(xù)7 d 灌胃丙酸鈉溶液；⑤丁酸鈉處理組：連續(xù)5 d 腹腔注射MPTP 溶液，之后連續(xù)7 d 灌胃丁酸鈉溶液；⑥混合酸處理組：連續(xù)5 d腹腔注射MPTP 溶液，之后連續(xù)7 d 灌胃混合酸溶液。上述腹腔注射和灌胃給藥的體積均為每10 g小鼠體重對(duì)應(yīng)100 μL溶液。

1.3 高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)小鼠紋狀體多巴胺含量

1.3.1 HPLC 樣品準(zhǔn)備 稱重后，按照每10 mg 紋狀體加入100 μL高氯酸溶液，使用注射器進(jìn)行物理?yè)v碎，使用杯式超聲波細(xì)胞粉碎儀充分破碎組織（注意全程保持儀器腔體為冰水混合物狀態(tài)）。破碎結(jié)束后，在高速離心機(jī)中，4℃，13 000 rpm，離心10 min，所得上清液經(jīng)水性濾膜（0.22 μm）過(guò)濾后置于進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)襯管中，-80 ℃保存待檢測(cè)。

1.3.2 檢測(cè)條件 采用Waters 2 695 分離單元串聯(lián)Waters 2 475 熒光檢測(cè)器對(duì)小鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA 的含量進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：Waters Atlantis T3 色譜柱（150 mm×4.5 mm，5 μm）。流動(dòng)相：流速為0.8 mL/min，乙腈-水-0.01 mol/L PBS（pH 4.0）梯度洗脫。上樣量：20 μL。熒光檢測(cè)條件：激發(fā)與吸收波長(zhǎng)分別為280 nm和320 nm。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠STC-1 腸內(nèi)分泌細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+100 U/mL 青霉素/100 μg/mL 鏈霉素，培養(yǎng)箱條件為37 ℃，含5%CO2。

1.4.2 細(xì)胞分組 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠STC-1 腸內(nèi)分泌細(xì)胞接種于12 孔板貼壁生長(zhǎng)過(guò)夜后，隨機(jī)分為5 組：①對(duì)照組：培養(yǎng)基處理組；②乙酸鈉組：乙酸鈉溶液處理24 h；③丙酸鈉組：丙酸鈉溶液處理24 h；④丁酸鈉組：丁酸鈉溶液處理24 h；⑤混合酸組：混合酸溶液處理24 h。其中，單一酸的濃度均為1 mmol/L，混合酸為：乙酸鈉1 mmol/L、丙酸鈉1 mmol/L：丁酸鈉1 mmol/L。

1.5 細(xì)胞毒性檢測(cè)

采用MTT 檢測(cè)細(xì)胞的活力來(lái)表征不同SCFA 的細(xì)胞毒性。首先，將STC-1 細(xì)胞按照5×105細(xì)胞/孔接種于96孔板貼壁過(guò)夜生長(zhǎng)，之后向孔內(nèi)加入濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5或1 mmol/L 的乙酸鈉、丁酸鈉、丙酸鈉或混合酸（乙酸鈉∶丙酸鈉∶丁酸鈉=1∶1∶1）。在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h 后，先向孔內(nèi)各加入20 μL MTT 工作液（5 mg/mL 溶解于PBS中），繼續(xù)在培養(yǎng)箱孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）混勻。使用全功能微孔板檢測(cè)儀在490 nm 處測(cè)定吸光度，并以處理后的培養(yǎng)物與未處理的對(duì)照培養(yǎng)物的吸光度百分比來(lái)確定細(xì)胞活力。

1.6 小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染

1.6.1 siRNA 的核酸序列 HDAC8-Mus-391，正義鏈：CCAGCCACAGAAGGGAUAUTT；反義鏈：AUAUCCCUUCUGUGGCUGGTT；HDAC8-Mus-609，正義鏈：GGAUUUGGAUCUACACCAUTT；反義鏈：AUGGUGUAGAUCCAAAUCCTT；HDAC8-Mus-892，正義鏈：GCCGGAGAUCCAAUGUGUUTT；反義鏈：AACACAUUGGAUCUCCGGCTT；HDAC9-Mus-404，正義鏈：GCAACUGCAGCAAGAGUUATT；反義鏈：UAACUCUUGCUGCAGUUGCTT；HDAC9-Mus-1013，正義鏈：GCGGAAGGAUGGAAAUCUUTT；反義鏈：AAGAUUUCCAUCCUUCCGCTT；HDAC9-Mus-1576：正義鏈：GCAUUAGAGGUACCCACAATT；反義鏈：UUGUGGGUACCUCUAAUGCTT。

1.6.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將靶向沉默HDAC8 和HDAC9的siRNA分別與脂質(zhì)體載體Lipofectamine 2000混合后室溫靜置復(fù)合30 min。之后將復(fù)合物加入細(xì)胞中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4 h后棄上清換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞RNA，用于后續(xù)qPCR檢測(cè)。

1.7 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）

使用TRIzolTM試劑提取結(jié)腸組織與STC-1 細(xì)胞的總RNA［16］。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT 試劑盒）將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。使用的引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組之間的比較使用單因素方差分析，LSD事后比較或Dunnett's T3事后比較。數(shù)據(jù)以（± s）表示，P＜0.05為顯著性閾值。

2 結(jié)果

2.1 不同SCFA 對(duì)MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型小鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響

為探索不同SCFA 對(duì)MPTP誘導(dǎo)的亞急性PD 模型小鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響，本研究采用HPLC法檢測(cè)了各組小鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA 含量。如HPLC結(jié)果所示（圖2），與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠紋狀體內(nèi)DA含量顯著下降。利用不同SCFA處理后發(fā)現(xiàn)，相較于模型組小鼠，丙酸處理組和丁酸處理組小鼠紋狀體DA含量進(jìn)一步顯著下降，而乙酸處理組和混合酸處理組小鼠紋狀體內(nèi)DA 含量出現(xiàn)下降但無(wú)顯著性。提示丙酸和丁酸能加劇MPTP 誘導(dǎo)的PD小鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的丟失。

圖2 SCFA降低MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠紋狀體多巴胺

2.2 不同SCFA 對(duì)MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型小鼠結(jié)腸促炎因子的影響

為了探討SCFA 是否促進(jìn)MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠結(jié)腸炎癥因子的表達(dá)，本研究對(duì)結(jié)腸中促炎因子進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組小鼠相比，乙酸處理組和丁酸處理組小鼠結(jié)腸IFN-γ 的表達(dá)顯著上調(diào)（圖3A）；乙酸處理組和丙酸處理組小鼠結(jié)腸中促炎因子IL-4 的表達(dá)顯著上調(diào)（圖3B），提示SCFA 引起的腸道炎癥可能與神經(jīng)遞質(zhì)丟失的加劇有關(guān)。

2.3 不同SCFA 對(duì)MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型小鼠結(jié)腸HDACs的影響

多項(xiàng)研究表明，SCFA 能夠抑制HDAC 的表達(dá)［17-20］，而HDAC 與腸道炎癥之間關(guān)系密切［21］。為了探索SCFA 對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠腸道炎癥的促進(jìn)作用是否與HDAC 的表達(dá)相關(guān)，本研究觀察了小鼠結(jié)腸中HDAC8 和HDAC9 的表達(dá)。結(jié)果顯示，丙酸處理組、丁酸處理組與混合酸處理組小鼠結(jié)腸中HDAC8 和HDAC9 的表達(dá)較PD 模型組小鼠均顯著下降（圖4A 和4B）。提示SCFA 促進(jìn)MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型小鼠結(jié)腸中炎癥因子的表達(dá)可能與HDAC8和HDAC9的下調(diào)相關(guān)。

圖3 SCFA促進(jìn)MPTP誘導(dǎo)PD模型小鼠結(jié)腸IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA的表達(dá)

圖4 SCFA抑制PD模型小鼠結(jié)腸HDAC8 mRNA和HDAC9 mRNA的表達(dá)

2.4 不同SCFA對(duì)STC-1細(xì)胞毒性的影響

為了觀察SCFA 對(duì)腸道細(xì)胞的影響，本研究使用STC-1 細(xì)胞株模擬體內(nèi)腸內(nèi)分泌細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。利用MTT 法考察了不同濃度體系SCFA 對(duì)STC-1 腸內(nèi)分泌細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的單一或混合SCFA 與STC-1 共培養(yǎng)12 h和24 h后，其細(xì)胞存活率均無(wú)明顯下降（圖5A和5B），表明所選濃度SCFA對(duì)STC-1無(wú)細(xì)胞毒性。

圖5 SCFA與STC-1細(xì)胞共同培養(yǎng)12 h和24 h后的細(xì)胞活力值

2.5 不同SCFA對(duì)STC-1細(xì)胞促炎因子的影響

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸顯著促進(jìn)了IL-6的表達(dá)，IL-1β 有所升高但無(wú)顯著性；丙酸顯著促進(jìn)了IL-1β、IL-6 和IL-18 的表達(dá)；丁酸顯著促進(jìn)了IL-1β 和IL-18 的表達(dá)，IL-6 有所升高但是無(wú)顯著性；混合酸顯著促進(jìn)了IL-1β 和IL-18 的表達(dá)（圖6A-6D）。上述結(jié)果提示，不同SCFA 能顯著上調(diào)腸內(nèi)分泌細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。

圖6 不同酸處理后STC-1細(xì)胞IL-1β，IFN-γ，IL-6和IL-18 mRNA的表達(dá)

2.6 不同SCFA對(duì)STC-1細(xì)胞HDACs的影響

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，丁酸顯著抑制了HDAC8 和HDAC9 的表達(dá)（圖7）。而乙酸，丙酸和混合酸對(duì)HDAC8 的表達(dá)有抑制作用，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7A）；乙酸和丙酸對(duì)HDAC9 的表達(dá)無(wú)影響而混合酸抑制了HDAC9 的表達(dá)（圖7B）。提示丁酸可能通過(guò)抑制HDAC8 和HDAC9 的表達(dá)參與影響STC-1細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。

2.7 敲 除HDAC8 或/和HDAC9 對(duì)STC-1 細(xì) 胞 促炎因子的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證HDAC8和HDAC9參與丁酸對(duì)STC-1 細(xì)胞的促炎作用，本研究使用RNA 干擾技術(shù)（RNA interfering，RNAi）靶向沉默HDAC8和HDAC9基因后（圖8A和8B），觀察是否出現(xiàn)類似丁酸誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致，丁酸組STC-1 細(xì)胞中促炎因子IFN-γ 和IL-1β均顯著上調(diào)，而IL-6 的表達(dá)沒有變化（圖8）。當(dāng)沉默HDAC8 時(shí)（siHDAC8 組），IL-1β 的表達(dá)顯著上調(diào)，IFN-γ 表達(dá)雖略有上升但無(wú)顯著性（圖8C 和8D）；當(dāng)沉默HDAC9 時(shí)（siHDAC9 組），則顯著上調(diào)IFN-γ 和IL-1β（圖7C 和7D）；同時(shí)沉默HDAC8 和HDAC9時(shí)（siHDAC8+siHDAC9組），顯著上調(diào)IFN-γ和IL-1β 的表達(dá)（圖8C 和8D），各組細(xì)胞中IL-6 的表達(dá)與對(duì)照組均無(wú)顯著變化（圖8E）。提示，特異性沉默HDAC8 或/和HDAC9 均能有效誘導(dǎo)促炎因子的分泌。

圖7 丁酸抑制STC-1細(xì)胞中HDAC8和HDAC9 mRNA的表達(dá)

圖8 丁酸通過(guò)HDAC8和HDAC9途徑調(diào)節(jié)STC-1細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)

3 討論

近期研究表明，腸道病理參與了PD 的發(fā)病過(guò)程。Scheperjans 等發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)可能與PD 的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)［4］。Villumsen 等的調(diào)研結(jié)果顯示，患炎癥性腸道疾?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的患者其患PD 的風(fēng)險(xiǎn)比無(wú)IBD 的人群高22%［15］。Matheoud等發(fā)現(xiàn)將腸道感染模型引入到PD模型中，能夠闡明既往研究中pink1-/-小鼠因缺少炎癥性干預(yù)而未呈現(xiàn)PD 癥的原因［22］。上述研究均提示腸道炎癥與PD的病程發(fā)展密切相關(guān)。

SCFA 是腸道菌群的主要代謝物之一，腸道菌群能夠通過(guò)SCFA 參與調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答［23-24］，在腸道炎癥的調(diào)節(jié)過(guò)程中具有重要作用。因此，首先考察了SCFA 對(duì)PD模型小鼠的影響。以MPTP誘導(dǎo)的亞急性PD 模型作為PD 模型，通過(guò)考察小鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA的變化判斷SCFA對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD 小鼠的影響。HPLC 結(jié)果表明，丙酸和丁酸均顯著加劇了MPTP 誘導(dǎo)的小鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的丟失；乙酸和混合酸雖然也進(jìn)一步加劇了DA的丟失但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)觀察到，丁酸顯著上調(diào)結(jié)腸中促炎因子IFN-γ 的表達(dá)，乙酸和丙酸顯著上調(diào)促炎因子IL-4 的表達(dá)。這些結(jié)果均提示SCFA可加劇PD小鼠結(jié)腸中炎癥因子的表達(dá)。

SCFA 是HDAC 抑制劑的一類，已被報(bào)道能夠調(diào) 節(jié) 多 種 基 因 的 表 達(dá)［20，25-27］。為 了 進(jìn) 一 步 探 討SCFA是否通過(guò)HDAC途徑促進(jìn)PD小鼠腸道炎癥因子的表達(dá)，本研究觀察了不同組小鼠結(jié)腸中HDACs分子的表達(dá)。結(jié)果顯示，與PD 組小鼠相比，丙酸、丁酸均能顯著抑制HDAC8 和HDAC9 的表達(dá)；乙酸抑制HDAC9 的表達(dá)；混合酸抑制HDAC8 的表達(dá)。提示SCFA 可能通過(guò)抑制HDAC8 和HDAC9 參與促進(jìn)PD小鼠腸道促炎因子的表達(dá)。

本研究首先使用SCFA 處理腸內(nèi)分泌細(xì)胞STC-1，之后分別考察細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子、HDAC8 和HDAC9 的表達(dá)。有趣的是，體外研究中SCFA 同 樣 顯 著 抑 制HDAC8 和HDAC9 的 表 達(dá)；促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6和IL-18）的表達(dá)也顯著上調(diào)，這一結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果相一致，提示SCFA 通過(guò)抑制HDAC8 和HDAC9 促進(jìn)STC-1 促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。為了驗(yàn)證促炎因子的上調(diào)是否與HDACs 的抑制有關(guān)，我們利用siRNA 技術(shù)靶向性基因沉默STC-1 細(xì)胞中的HDAC8 和HDAC9 的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在STC-1 細(xì)胞中，與HDAC 抑制劑SCFA 的作用類似，無(wú)論抑制HDAC8 或/和HDAC9 的表達(dá)均能誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的顯著增加，提示SCFA 能通過(guò)抑制HDAC 的表達(dá)促進(jìn)腸內(nèi)分泌細(xì)胞中促炎因子的表達(dá)，這可能與腸道炎癥加劇以及PD 的發(fā)展相關(guān)。

綜上所述，本研究顯示SCFA 可能通過(guò)抑制HDAC8 和HDAC9 促進(jìn)腸道炎癥細(xì)胞因子IFN-γ，IL-4 的表達(dá)，進(jìn)而參與PD 的發(fā)展。本研究為SCFA通過(guò)HDAC 途徑促進(jìn)腸道細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)而影響PD 增加了理論依據(jù)，為開發(fā)基于干預(yù)SCFA 的PD治療新方案提供了新的思路。