運動誘導(dǎo)的miR-126對糖尿病小鼠心肌的保護作用及機制研究

柳 華，孫 靜，于曉涵，楊 翼

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是在糖尿病患者中存在的一類異常心臟結(jié)構(gòu)和功能的心肌病變，其最主要的病理改變表現(xiàn)為心肌微血管管腔變窄，心肌發(fā)生缺血缺氧，造成心肌退行變性和廣泛小灶性壞死，最終導(dǎo)致心功能減退、各種心律失常和心衰，甚至是心源性死亡。數(shù)據(jù)顯示，65歲以上糖尿病患者的死亡人數(shù)中約有70%死于心臟并發(fā)癥，是非糖尿病患者心臟病死亡率的2～4倍（Benjamin et al.，2019）。DCM是一種嚴(yán)重的糖尿病心臟病并發(fā)癥，是引起心源性病變和死亡率的重要原因之一。因此，延緩DCM發(fā)展對預(yù)防糖尿病心源性死亡有重要意義。

運動干預(yù)不僅可以有效控制血糖，還能增加最大攝氧量，提高左心室射血分?jǐn)?shù)、心排血量和左室舒張功能（Rodrigues et al.，2012），與心血管疾病死亡率之間呈反比關(guān)系（Sluik et al.，2012）。美國糖尿病學(xué)會倡導(dǎo)運動作為糖尿病心臟病并發(fā)癥患者的一種非藥物干預(yù)方式，但是目前運動改善DCM的機制還不清楚。本研究通過對糖尿病db/db小鼠進行小、中、大強度的運動干預(yù)，觀察血壓（blood pressure，BP）、心率（heart rate，HR）、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、空腹血清胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）、活 性 氧（reactive oxygen species，ROS）、心肌肥大面積、心肌血管密度等指標(biāo)，檢測血清cmiR-126和心肌m-miR-126表達(dá)量以及心肌核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、Sprouty相關(guān)EVH1域含蛋白1（recombinant human sprouty-related EVH1，SPRED1）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表達(dá)量，以探討 miR-126/NF-κB 和miR-126/SPRED1/VEGF通路在運動保護糖尿病心肌中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

16周齡雄性db/db小鼠24只，m/m小鼠6只（購自江蘇卡文斯公司，合格證號：No.32002200000166）。飼養(yǎng)于武漢體育學(xué)院動物實驗中心SPF級實驗動物房，分籠飼養(yǎng)。實驗期間自由進食和飲水。

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑

透射電鏡（日本HITACHI）、全自動酶標(biāo)儀Multiskan MK3（賽默飛世爾科技公司）、無創(chuàng)血壓儀BP-2010A（北京軟隆生物技術(shù)有限公司）、正置熒光顯微鏡（日本尼康）、垂直電泳槽及電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）、實時熒光定量PCR儀QuantStudio6（ABI）、Nano-100微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）、ZS-PT小動物實驗跑臺（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）。

PCR試劑購于TIANGEN和VAZYME公司，DHE染液（SIGMA），主要抗體包括 α-SMA（CST）、SPRED1（SANTA GRUZ）、NF-κB（CST）、GAPDH（CST）、VEGF（SANTA GRUZ），二抗購于CST等。

1.3 實驗分組

在實驗進行前，所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，db/db小鼠隨機分為4組，每組6只。分別為：空白對照組（NC組），小強度運動組（LE組），中強度運動組（ME組），大強度運動組（HE組）。另取同周齡m/m小鼠對照組（sham組，6只）。

1.4 實驗方案

Sham組和NC組不進行干預(yù)，正常喂養(yǎng)。LE組、ME組和HE組在平臺跑步機上進行8周跑臺運動。每周訓(xùn)練5次，每天 1次，每次30 min，訓(xùn)練時間為20：00－21：00，周四和周日休息。運動強度分別為：LE組5 m/min（Liu et al.，2018），ME 組 10 m/min（Veeranki et al.，2016），HE組 15 m/min（Lee et al.，2011），坡度均為0。正式干預(yù)之前，由5 m/min運動強度開始進行一周強度遞增適應(yīng)性跑臺運動。

1.5 動物取材

最后一次運動后24 h，取血清和心肌組織。取材前禁食不禁水12 h，測BP、HR和FBG；眼眶取血，分離血清，酶聯(lián)免疫分析ELISA試劑盒檢測血清FINS水平；取心肌組織，用于電鏡、染色、PCR和Western Blot檢測。電鏡標(biāo)本用生理鹽水沖洗后，固定于電鏡固定液中，其余石蠟包埋和置于液氮中凍存。

1.6 測量BP和HR

采用尾部袖帶容積描記測壓法。小鼠用塑料通氣管道固定于加熱袋，測量血壓的傳感器套在小鼠尾部，通過系統(tǒng)自動充起和放氣對其尾動脈進行血流信號的檢測，得出收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）和HR。

1.7 檢測FBG和FINS

測血糖之前禁食10 h，每2周定點檢測，小鼠尾靜脈取血，使用羅氏血糖測試儀及相配套試紙測小鼠FBG。運動8周后，眼眶取血，室溫靜置30 min后，4℃離心機3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA試劑盒測定FINS的濃度。

1.8 冰凍切片DHE熒光染色

新鮮組織冰凍切片復(fù)溫，DHE在避光條件下37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI室溫避光染核10 min，PBS洗滌3次后封片拍照。

1.9 WGA-AF488染色

石蠟切片脫蠟至水后WGA染液染色，避光恒溫箱37℃孵育30 min。DAPI染液，避光室溫孵育10 min。PBS洗滌3次后封片切片于拍照。

1.10 α-SMA染色

石蠟切片脫蠟至水，組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 9.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。加α-SMA一抗，于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，洗滌3次，每次5 min。加二抗，避光室溫孵育50 min。DAPI室溫避光染核10 min，PBS洗滌3次后封片拍照。

1.11 實時熒光定量PCR

取血清和心肌組織測量血清miR-126（c-miR-126）和心肌 miR-126（m-miR-126）表達(dá)量。Trizol法提取總RNA，用微量分光光度計測定總RNA的純度和濃度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：25℃5 min，50℃15 min，85℃ 5 min，4 ℃ 10 min。Mmu-miR-216 Loop primer（5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACCGCATTAT-3’）。用熒光定量PCR儀擴增cDNA和檢測，反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃30 s，60℃ 30 s，40 cycles。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。

1.12 Western Blot

將心肌組織剪碎后，RAPI裂解勻漿，提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取100 μl蛋白與2×Loading buffer上樣緩沖液100 μl混勻后。100℃恒溫加熱器加熱10 min，冷卻后-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。制?0%分離膠和12%濃縮膠。常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件350 mA下，90～120 min。用5%的脫脂奶粉對膜進行封閉，室溫緩慢搖蕩1～2 h。TBST洗滌。兔抗和鼠抗分別用5%的脫脂牛奶稀釋（1∶2 000），4℃冰箱過夜。TBST洗滌后加入用5%BSA稀釋的二抗（1∶500），室溫緩慢搖蕩2 h。TBST洗膜后進行ECL顯影、曝光。Image J 11.0軟件進行條帶灰度值分析。內(nèi)參為GAPDH。

1.13 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（M±SD）。組間差異比較采用單因素方差分析，以P＜0.05作為具有顯著性差異，P＜0.01具有非常顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 8周有氧運動后小鼠BP、HR、FBG水平和FINS水平的變化

NC組小鼠SBP和DBP在8周時均顯著高于sham組（P＜0.01），LE組、ME組和HE組小鼠跑臺訓(xùn)練8周后SBP和 DBP均顯著低于 NC組（P＜0.05或P＜0.01，圖1A）。

圖1 8周有氧運動后小鼠血壓、心率、空腹血糖水平和空腹血清胰島素水平的變化Figure 1.Variations of BP，HR，F(xiàn)BG Level and FINS Level in Mice after 8 Weeks ofAerobic Endurance Exercise

NC組小鼠安靜心率8周時均顯著高于sham組（P＜0.01）。8周運動干預(yù)后LE組、ME組和HE組安靜HR顯著低于NC組（P＜0.01，圖1B）。

NC組FBG在8周時顯著高于sham組（P＜0.01）。8周運動干預(yù)后，LE組、ME組和HE組FBG顯著低于NC組（P＜0.01，圖1C）。8周后，NC組的血清FINS顯著高于sham組（P＜0.01）；LE組、ME組和HE組顯著低于NC組（P＜0.05或P＜0.01，圖1D）。

2.2 8周有氧運動后電鏡觀察結(jié)果

NC組心肌細(xì)胞線粒體腫脹變性明顯且排列紊亂，體積增大，空泡變性，大部分嵴出現(xiàn)融合、斷裂的改變，表明糖尿病小鼠心肌細(xì)胞受損。LE、ME和HE組運動后心肌組織出現(xiàn)不同程度的改變，其中ME組改善明顯，可見心肌細(xì)胞的纖維結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常且排列有規(guī)律，線粒體輕度腫脹，嵴形態(tài)基本正常（圖2A）。

圖2 8周有氧運動后小鼠心肌組織電鏡、DHE染色、WGA-AF488染色和α-SMA染色結(jié)果Figure 2.Results of Electron Microscopy，and DHE，WGA-AF488 and Alpha-SMA Fluorescence Staining in Myocardial Tissue of Mice after 8 Weeks of Aerobic Endurance Exercise

2.3 8周有氧運動后心肌組織DHE染色結(jié)果

NC組ROS熒光強度顯著高于sham組（P＜0.01）；LE組和ME組顯著低于NC組（P＜0.01，圖2B，圖2E）。表明糖尿病小鼠心肌ROS產(chǎn)生增多，8周運動干預(yù)后的LE、ME組db/db小鼠中ROS產(chǎn)生較低。

2.4 8周有氧運動后心肌組織WGA-AF488染色結(jié)果

NC組小鼠心肌細(xì)胞面積顯著高于sham組（P＜0.01），8周訓(xùn)練后各運動組心肌細(xì)胞平均面積顯著低于NC組（P＜0.01，圖2C，圖2F）。實驗表明，WGA-AF488染色發(fā)現(xiàn)db/db小鼠心肌肥大，8周有氧運動干預(yù)后得到了明顯改善。

2.5 8周有氧運動后心肌組織α-SMA染色結(jié)果

NC組心肌血管密度顯著低于sham組（P＜0.01），各運動組心肌血管密度顯著高于NC組（P＜0.05或P＜0.01，圖2C，圖2G）。表明8周有氧運動有助于心肌血管的生成。

2.6 8周有氧運動后血清和心肌組織中c-miR-126和m-miR-126表達(dá)量的變化

8周后NC組c-miR-126和m-miR-126表達(dá)量顯著低于sham組（P＜0.01），LE組、ME組和HE組血清miR-126和心肌miR-126表達(dá)量顯著高于NC組（P＜0.01，圖3A、圖3B）。說明db/db小鼠的循環(huán)和心肌miR-126表達(dá)下調(diào)，8 周有氧運動可以顯著上調(diào)循環(huán)和心肌miR-126表達(dá)。

圖3 8周有氧運動后小鼠血清和心肌c-miR-126和m-miR-126及心肌中NF-κB、SPRED1和VEGF蛋白表達(dá)量的變化Figure 3.Expression levels of c-miR-126 and m-miR-126 in Serum and Myocardium，and NF-κB，SPRED1 and VEGF in Myocardium of Mice after 8 Weeks of Aerobic Endurance Exercise

2.7 8周有氧運動后心肌中NF-κB、SPRED1和VEGF蛋白

結(jié)果顯示，8周運動干預(yù)后NC組NF-κB蛋白表達(dá)量顯著高于sham組（P＜0.01），LE組、ME組NF-κB蛋白表達(dá)的灰度值顯著低于NC組（P＜0.05或P＜0.01，圖3C、圖3D）。說明運動可減輕心肌的炎性反應(yīng)。NC組SPRED1蛋白表達(dá)的灰度值顯著高于sham組（P＜0.01），VEGF蛋白表達(dá)的灰度值顯著低于sham組（P＜0.01），而8周運動干預(yù)后ME組SPRED1蛋白表達(dá)的灰度值顯著低于NC組（P＜0.01），LE組、ME組和HE組VEGF蛋白表達(dá)的灰度值顯著高于NC組（P＜0.01，圖3C、圖3E、圖3F）。說明中等強度的運動顯著提高SPRED1和VEGF蛋白表達(dá)量。

3 討論與分析

3.1 運動改善糖尿病小鼠的BP、HR、FBG和FINS

在糖尿病患者中，約有80%患者患有高血壓，而血壓和心率升高可顯著增加與糖尿病相關(guān)的心血管疾病的風(fēng)險（Fritz et al.，2006；Hillis et al.，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠的血壓明顯高于m/m小鼠。長期運動可以降低db/db小鼠的舒張壓和收縮壓。雖然DCM可獨立于高血壓癥狀發(fā)病，但是有氧運動對血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)和微循環(huán)的改善，可使心臟負(fù)荷降低，延緩DCM的發(fā)展。長期有規(guī)律的運動可使心臟總體積指數(shù)提高，增加心臟容量、心室壁厚度以及副交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性，降低靜息心率（Collier et al.，2008）。本實驗結(jié)果表明，長期運動能明顯降低糖尿病小鼠心率水平。

高血糖是導(dǎo)致2型糖尿病患者造成血管損傷的原因之一。實驗發(fā)現(xiàn)，db/db模型小鼠FBG和FINS明顯升高，而8周有氧耐力運動干預(yù)明顯下降各運動組的血糖和胰島素水平?？刂蒲呛透咭葝u素對調(diào)節(jié)心率有重要作用，可以減少心血管事件及微血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展。Samuelsson等（2006）發(fā)現(xiàn)，對大鼠進行7周的胰島素處理形成高胰島素后，左心室質(zhì)量和心室壁相對厚度增加，心排血量和每搏輸出量減少，心肌細(xì)胞肥大。本實驗發(fā)現(xiàn)小強度運動組的血清FINS水平降低不明顯，通過長期中等或大強度運動更為明顯。同時還發(fā)現(xiàn)，WGA-AF488染色顯示糖尿病小鼠心肌肥大，8周有氧運動干預(yù)的db/db小鼠心肌肥大得到了明顯改善。

3.2 運動通過miR-126/NF-κB減少心肌炎癥反應(yīng)

高血糖可引起蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)，增加ROS的產(chǎn)生（Luczak et al.，2014），促進心肌炎癥和纖維化（Jia et al.，2016）。運動可以改善心臟線粒體代謝，減少線粒體活性氧物質(zhì)釋放（Campos et al.，2017），恢復(fù)線粒體功能。實驗發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠心肌組織ROS水平明顯增高（圖2B）。ROS可進一步激活核因子NF-κB（Shi et al.，2017）。NF-κB是糖尿病心肌病發(fā)病的關(guān)鍵細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)大量的免疫應(yīng)答、應(yīng)激、表面受體、細(xì)胞存活和增殖。NF-κB通過炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞凋亡、心肌纖維化等機制參與了糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展（Wang et al.，2009）。在本實驗中檢測了心肌組織中NF-κB的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，db/db小鼠心肌NF-κB表達(dá)量明顯增加。但是經(jīng)過8周有氧運動后，小強度、中強度運動組db/db小鼠心肌ROS水平、NF-κB表達(dá)量均明顯降低，提示，小強度、中強度運動組可減少氧化應(yīng)激對心肌的炎癥刺激，從而減少心肌損傷。

MiRNA是一種長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄后通過mRNA降解或抑制翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。MiRNA可以釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，參與各種生理和病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-126的循環(huán)水平在糖尿病及心臟病患者中被下調(diào)（Zhang et al.，2015）。本實驗有相似結(jié)果，與m/m小鼠相比，db/db小鼠循環(huán)和心肌miR-126表達(dá)量顯著下降。而8周的有氧運動使db/db小鼠循環(huán)和心肌miR-126的表達(dá)量增加，其中以中等強度有氧運動最為明顯。

MiR-126通過與多個靶基因作用參與炎癥過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可通過降低靶基因血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1的表達(dá)，減少白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，減少炎癥反應(yīng)（Sell et al.，2006）。MiR-126還可以調(diào)節(jié)趨化因子（CC基序）配體2（CCL2）的表達(dá)，參與炎癥細(xì)胞募集和胰島素抵抗（Arner et al.，2012）。Feng等（2012）發(fā)現(xiàn)，抑制miR-126表達(dá)后，可提高靶基因IκBα基因的表達(dá)，進而抑制炎癥細(xì)胞NF-κB的活化。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-126在運動組心肌中表達(dá)量增加，同時ROS水平、NF-κB的表達(dá)下降，說明長期有氧運動可能通過miR-126/NF-κB通路減少糖尿病心臟的炎癥反應(yīng)。

3.3 運動通過miR-126/SPRED1/VEGF通路刺激心肌血管再生

MiR-126與血管的再生關(guān)系密切。MiR-126的循環(huán)水平在患有2型糖尿病及其心臟并發(fā)癥的患者中被下調(diào)（Liu et al.，2014），參與微血管和大血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程（Meng et al.，2012）。Naderi等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，高血糖降低了糖尿病大鼠心臟miR-126的表達(dá)量和血管生成，經(jīng)過運動以后心肌miR-126的表達(dá)量增加。宋偉等（2017）對心梗大鼠進行持續(xù)運動和間歇運動8周后發(fā)現(xiàn)，間歇運動可以顯著促進心臟梗死邊緣區(qū)血管新生，上調(diào)心肌miR-126，改善心功能，與兩組均能顯著提高miR-126靶基因SPRED1和VEGF基因表達(dá)有關(guān)。SPRED1蛋白表達(dá)上調(diào)可能是運動刺激心肌血管再生的機制之一。

目前已明確SPRED1在造血過程具有調(diào)節(jié)作用。VEGF是血管生成過程中組織生長和器官修復(fù)過程中的關(guān)鍵因子。心肌中的VEGF表達(dá)上調(diào)可顯著改善心肌灌注，增加側(cè)支形成，減少缺血事件和改善左心功能（Choi et al.，2006）。SPRED家族蛋白抑制Raf、Ras/ERK激酶，影響VEGF的活性（Park-Windhol et al.，2017）。SPRED1基因是miR-126的靶基因，因此，當(dāng)miR-126上調(diào)可抑制靶基因SPRED1的mRNA表達(dá)，解除對Raf、Ras抑制，提高VEGF的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者中內(nèi)皮細(xì)胞釋放的內(nèi)皮微粒miR-126降低，并在體外實驗發(fā)現(xiàn)SPRED1表達(dá)量增加，血管生成和血管完整性缺失，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙（Jansen et al.，2013）。本實驗α-SMA染色顯示與sham組比較，db/db小鼠心肌血管密度下降，8周中等強度有氧運動顯著增加心肌血管密度，同時心肌SPRED1表達(dá)量下降，促進VEGF的表達(dá)。由此可見，中等強度有氧運動可能通過miR-126/SPRED1/VEGF信號通路增加糖尿病心肌血管密度，從而提高供血供氧，保護心肌組織。

4 結(jié)論

8周有氧耐力運動可明顯改善糖尿病db/db小鼠的血糖和胰島素水平，減少心肌炎癥反應(yīng)，提高心肌血管再生，其中以中等強度運動組的效果最為顯著，其保護機制與miR-126/NF-κB和miR-126/SPRED1/VEGF信號通路相關(guān)。