CRISPR/Cas9 基因編輯原理、發(fā)展及應(yīng)用

董樂，楊笑星，佟廣香，閆婷，孫志鵬，徐歡，劉天奇，匡友誼

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070 2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

自20 世紀(jì)70 年代重組DNA 技術(shù)發(fā)展以來，有關(guān)位點特異性核酸酶（Site-specific nuclease，SSN）的基礎(chǔ)理論研究取得了突破性進(jìn)展，使精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)快速普遍應(yīng)用于各個領(lǐng)域。SSN 為目的基因的精準(zhǔn)編輯提供了有效的特異性編輯方法[1,2]。較早被廣泛應(yīng)用于基因工程技術(shù)中的兩種基因編輯技術(shù)是鋅指核酸酶（Zine finger endonuclease，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALENs）。這兩種編輯方法原理相同，皆是DNA 結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶FokⅠ兩個模塊的融合，之后對特定靶序列雙鏈進(jìn)行切割。然而這兩種核酸酶存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不易操作、耗時長、易脫靶[3-6]等缺點，阻礙了其發(fā)展。隨著2012年Jinek[7]等根據(jù)細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成的成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）介導(dǎo)的位點特異性人工核酸內(nèi)切酶Cas9系統(tǒng)，在原核、真核生物的基因組編輯中取得成功而正式走進(jìn)科研人員的視野[8]。CRISPR/Cas9 作為一種全新的技術(shù)具有在基因組中定點編輯的能力，具有精準(zhǔn)、高效、制備簡單等優(yōu)勢而被廣泛發(fā)展和應(yīng)用[9]。本文綜述了CRISPR/Cas9 的歷史來源、結(jié)構(gòu)組成、作用機(jī)理、技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用等最新研究成果，旨在為初學(xué)者提供CRISPR/Cas9 基因組編輯系統(tǒng)的基礎(chǔ)知識。

1 CRISPR/Cas9 的來源

CRISPR/Cas9 自發(fā)現(xiàn)到在哺乳動物中應(yīng)用經(jīng)歷了近30 年的漫長研究過程（圖1）。1987 年Ishino等在研究大腸桿菌（Escherichia coli）的堿性磷酸酶基因時，首先發(fā)現(xiàn)CRISPR 下游有被間隔序列間隔的重復(fù)序列。后來大量的細(xì)菌基因組測序，發(fā)現(xiàn)這種序列廣泛存在于細(xì)菌與古細(xì)菌中[10]。2002 年Mojica 等[11]和Jansen 等[12]將間隔排列的串聯(lián)重復(fù)序列命名為成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR），同時也發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3 種類型的CRISPR 簇相關(guān)的Cas 蛋白，但其生物學(xué)功能未知。2005 年經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，間隔序列來源于外源入侵的DNA，推測CRISPR/Cas 可能與細(xì)菌自我保護(hù)不被外源遺傳物質(zhì)影響的免疫系統(tǒng)有關(guān)[13-15]；2007 年，Barrangou R 等[16]在嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）中證實了CRISPR/Cas 具有獲得抵抗外源噬菌體侵入的能力；2008 年Marraffini 等[17]在葡萄球菌（Staphylococcus spp.）中證明了這種獲得性抵抗外源菌體的能力。Deveau 等[18]發(fā)現(xiàn)了原間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif,PAM）為CRISPR/Cas 發(fā)揮作用提供了靶標(biāo)。這一防御系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)引起了科學(xué)家對其在基因組中定點編輯的濃厚興趣。2012 年，Sternberg 等[19]發(fā)現(xiàn)II 型CRISPR中僅需一個Cas9 蛋白即可完成靶序列的編輯，在體外使用RNA 實現(xiàn)了DNA 目的序列的識別和剪切；2013 年Cong 等[20]和Mail 等[21]首次在真核生物中成功應(yīng)用CRISPR/Cas9 進(jìn)行了基因編輯。目前，CRISPR/Cas9 已逐步應(yīng)用到了包括原核生物、真菌以及動植物的基因組精準(zhǔn)編輯，成了基因組編輯中的“明星”技術(shù)。

圖1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)研究進(jìn)展示意圖Fig.1 Schematic diagram of the research progress on the CRISPR/Cas system

2 CRISPR/Cas 結(jié)構(gòu)

從最初發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas 間隔排列的串聯(lián)重復(fù)序列[10]，并證明其廣泛存在于細(xì)菌（40%）與古細(xì)菌（90%）中[22]，到將帶有回文結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列命名為CRISPR 序列[11,12]，無一不在逐步揭開其神秘面紗。CRISPR/Cas 由CRISPR 簇和Cas 蛋白組成，CRISPR簇主要由三部分構(gòu)成（圖2）：一個前導(dǎo)序列（Leader）、數(shù)個高度保守的重復(fù)序列（Repeat）和多段間隔序列（Spacer）組成[23,24]。其中Leader 序列位于CRISPR簇的上游，是CRISPR 簇的啟動子序列[23]；Repeat 序列一般為21～48 bp，含有回文序列，故能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；Spacer 區(qū)是入侵的外源DNA 序列[25]。

圖2 CRISPR 位點結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of CRISPR structure

CRISPR 簇側(cè)翼附近是系列CRISPR 相關(guān)蛋白基因座（CRISPR-associated），即Cas 蛋白基因[22,25]，其編碼產(chǎn)物均含有與核酸作用的功能結(jié)構(gòu)，目前已發(fā)現(xiàn)有Cas1-Cas14 等多種類型[26-28]。Cas 蛋白基因與CRISPR 共同作用組成CRISPR/Cas 系統(tǒng)，完成基因的精準(zhǔn)高效編輯。根據(jù)Cas 蛋白的種類和序列，CRISPR/Cas 可分二類六型[26-31]（Ⅰ-Ⅵ），Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型需要幾個Cas 效應(yīng)蛋白組成的復(fù)合體，Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型僅需單個Cas 效應(yīng)蛋白；其中Ⅱ型CRISPR/Cas 只需一個Cas9 蛋白，便可有效切割雙鏈DNA。正是這種簡單高效的優(yōu)點給予了Ⅱ型CRISPR/Cas9 強(qiáng)有力的發(fā)展空間。

3 Ⅱ型CRISPR/Cas9 在細(xì)菌中的作用原理

Ⅱ型CRISPR/Cas9 與Ⅰ型和Ⅲ型兩種系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄、加工以及與核酸酶在剪切特定目的序列的協(xié)同作用上截然不同[16]，目前Ⅱ型系統(tǒng)的研究最為廣泛和深入。CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯主要分為三個階段（圖3）：首先獲取外源DNA，其次CRISPR位點的轉(zhuǎn)錄與加工，最后是CRISPR/Cas9 切割外源DNA[32]。

圖3 II 型CRISPR-Cas9 抵御外源噬菌體的獲得性免疫機(jī)制,引自吳言等[39]Fig.3 The process of adaptive immune mechanism of CRISPR-Cas9's II against foreign phages,from Wu Yan et al[39]

第一階段為獲取外源DNA 序列，將外源基因的原間隔序列（protospacers）整合到宿主染色體的CRISPR 序列前導(dǎo)區(qū)的近端（如第一個spacer），實現(xiàn)標(biāo)記功能。當(dāng)質(zhì)粒或噬菌體首次入侵?jǐn)y有CRISPR的個體時，在Cas1 和Cas2 的幫助下宿主首先識別入侵核酸的PAM序列，切割臨近PAM 序列的外源DNA 作為原間隔序列。臨近間隔序列3’端的3 nt較保守，稱為PAM 序列，通常為5’-NGG-3’[33,34]，同時PAM區(qū)也是該系統(tǒng)的剪切位點。第二階段，當(dāng)外源DNA 再次入侵時，在Leader 的調(diào)控下，CRISPR 位點被轉(zhuǎn)錄成RNA 前體（Pre-CRISPR RNA，pre-crRNA），同時重復(fù)序列（repeats）被轉(zhuǎn)錄成反式激活RNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA），并由Cas9 和雙鏈RNA 特異性RNase III 核酸酶對pre-crRNA 進(jìn)行加工[35]，生成僅含有一個間隔序列（入侵的外源序列）的成熟crRNA，該階段Cas9 基因也被轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在crRNA、tracrRNA 和Cas9 核酸酶形成復(fù)合體crRNP 的作用下對入侵的外源DNA 進(jìn)行剪切編輯[21,36]，起到自我免疫防護(hù)。第三階段是對外源DNA 的免疫編輯，復(fù)合體crRNP 識別并通過堿基互補配對結(jié)合到與間隔序列（crRNA）互補的DNA 鏈上，使互補鏈與crRNA 雜交，然后由Cas9中的HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切crRNA 的互補鏈，Cas9 的另一個RuvC 活性位點剪切非互補鏈，從而產(chǎn)生雙鏈DNA 斷裂（Double strand breaks，DSBs）[7]，經(jīng)細(xì)胞的非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）或同源介導(dǎo)的雙鏈修復(fù)（homology directed repair，HDR）對DNA 進(jìn)行修復(fù)[32,37]，實現(xiàn)對外源DNA 的切割。

綜上，當(dāng)使用CRISPR/Cas9 對組織、細(xì)胞或者胚胎進(jìn)行基因組編輯時（圖4），可通過體外合成單引導(dǎo)RNA（Single guide RNA,sgRNA），混合Cas9 mRNA 或蛋白直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系或組織中[38]，對目標(biāo)序列進(jìn)行雙鏈切割，經(jīng)NHEJ 和HDR 機(jī)制修復(fù)，即可實現(xiàn)基因組靶向編輯。

圖4 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯，引自沈陽坤等[ 40]和Alexander Hruscha 等[41]Fig.4 Genome editing mediated by CRISPR/Cas9 system,from Shen Yangkun,et al[ 40] and Alexander Hruscha et al[41]

4 CRISPR/Cas9 的技術(shù)發(fā)展

2012 年Jinek 等[7]將crRNA 和tracrRNA 兩者連接在一起，形成新的單引導(dǎo)RNA（Single guide RNA，sgRNA），且打靶效率與雙引導(dǎo)RNA 并無顯著改變。與野生型CRISPR/Cas9 相比，這個新型的CRISPR/Cas9 更加容易構(gòu)建，只需一個引導(dǎo)RNA 和Cas9 核酸酶mRNA 同時注入受精卵，便可快速獲得定向突變個體。該系統(tǒng)不僅可以靶向編輯單個基因，還可以多個sgRNA 共同使用完成多個位點的靶向突變，這在Yin 等[42]的研究中得到了很好的驗證。Yin 等[42]應(yīng)用多個sgRNA 在斑馬魚（Danio rerio）上獲得了酪氨酸酶和胰島素受體a 和b 的多重雙等位基因失活，得到了色素沉著和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的缺陷表型。自2013 年成功將CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)應(yīng)用到真核生物和細(xì)胞以來[20,21]，該技術(shù)取得了顯著進(jìn)展。

4.1 提高CRISPR/Cas9 特異性

相比于TALEN，CRISPR/Cas9 提高了靶向編輯特異性，但仍存在一定比率的脫靶效應(yīng)，這將妨礙其在疾病治療、基因功能研究上的應(yīng)用。主要從改進(jìn)sgRNA 和Cas9 核酸酶兩方面著手以降低其脫靶率、提高特異性。在sgRNA 的改進(jìn)上，Kim 等[43]和Fu 等[44]的研究分別顯示延長或截短2～3 個nt 的sgRNA 能降低堿基錯配率，提高靶向修飾的特異性。John 等[45,46]分析了1 841 個sgRNA 的基因編輯結(jié)果，構(gòu)建了sgRNA 活性的預(yù)測模型[45]。根據(jù)該模型創(chuàng)建了人類和小鼠全基因組CRISPR/Cas9 sgRNA文庫，在分析了數(shù)千個sgRNA 非靶標(biāo)活性的基礎(chǔ)上，開發(fā)了非靶標(biāo)位點預(yù)測模型[46]，改進(jìn)了人類和小鼠sgRNA 的設(shè)計，以提高其活性和靶點修飾的專一性。

除了sgRNA，Cas9 核酸酶的結(jié)構(gòu)也顯著影響基因編輯的準(zhǔn)確性。Cas9 蛋白通過HNH 和RuvC 兩個功能結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)雙鏈DNA 的切割，增加脫靶風(fēng)險，因此學(xué)者對Cas9 進(jìn)行了修飾。突變Cas9 兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域中的一個會產(chǎn)生缺刻Cas9（Nickase Cas9，nCas9），該核酸酶只切割一條DNA 鏈[7,33]。兩個nCas9 可以靶向相鄰的DNA 位點而引起DSBs[47]；因該過程中靶位點長度增加，產(chǎn)生的單個缺口將由高保真堿基切除修復(fù)機(jī)制修復(fù)，從而在不犧牲靶位點切割效率的前提下，將非靶標(biāo)活性降低了50～1 000 倍[47,48]。與單結(jié)構(gòu)域的失活相比，2013 年Qi 等[49]突變了Cas9 核酸酶中的兩個功能結(jié)構(gòu)域，讓其缺乏核酸酶活性而保留其DNA 結(jié)合活性，形成了Dead Cas9（dCas9）。在不切割目標(biāo)DNA 的情況下dCas9 介導(dǎo)特定位點的遺傳和表觀遺傳調(diào)控，dCas9與sgRNA 共同作用時將會抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[49,50]，進(jìn)而大幅降低脫靶率。2014 年，在dCas9 的基礎(chǔ)上開發(fā)的新型基因編輯工具提高了對目的位點編輯修飾的特異性。Guilinger 等[51]將dCas9 與Fok I 限制酶融合形成二聚體fCas9，經(jīng)一對sgRNA 引導(dǎo)進(jìn)行基因組修飾，其特異性要比野生型Cas9 高140倍以上，與雙nCas9[47]效率相似。

4.2 CRISPR/Cas9 PAM 序列修飾

與入侵DNA 序列中同crRNA 靶序列連接臨近2～5 nt 的PAM 序列決定著CRISPR/Cas9 靶點的識別，也可影響CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯的特異性[52]。現(xiàn)已知存在多種PAM序列，如化膿性鏈球菌（Pyogeniccoccus spp.）的NGG PAM[7]，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的NGGNG 和NNAGAAW PAM[32,33]及腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的NNNNGATT PAM[53]等。CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的DNA 切割依賴于PAM 的方式限制了基因組中靶位點的頻率，NGG PAM 和NAG PAM[54]在基因組中每8 個核苷酸可以找到一個靶位點，NGGNG PAM和NNAGAAW PAM，每32 個和256 個核苷酸才能找到一個靶位點。

為擴(kuò)充靶位點的數(shù)量，Nishimasu 等[55]通過基因工程方法創(chuàng)造了spCas9-NG 基因編輯器，將spCas9的PAM區(qū)序列從NGG 擴(kuò)充至NG；Hu 等[56]采用人工進(jìn)化方法，創(chuàng)建出xCas9，將spCas9 的PAM 區(qū)從NGG 擴(kuò)充至NGN、GAA 和GAT。Kim 等[57]通過大規(guī)模的靶位點評估了野生型spCas9、xCas9 和sp-Cas9-NG PAM區(qū)靶位點的兼容性、脫靶率和編輯效率，發(fā)現(xiàn)xCas9 對靶位點的錯配容忍性最低，而sp-Cas9-NG 具有最廣泛的PAM區(qū)兼容性，相對于sp-Cas9，xCas9 和spCas9-NG 可以編輯前者不能編輯的基因。他們在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化并建立了xCas9和spCas9-NG 靶位點序列活性預(yù)測模型。Walton等[58]開發(fā)了SpRY 基因編輯器，將spCas9 的PAM區(qū)進(jìn)一步擴(kuò)充至NRN 和NYN，做到了幾乎不依賴于PAM區(qū)序列進(jìn)行基因編輯。

4.3 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因敲入

CRISPR/Cas9 不僅介導(dǎo)基因敲除，同樣可以介導(dǎo)基因定向插入，CRISPR/Cas9 在產(chǎn)生DSB 后，可通過同源重組修復(fù)來精準(zhǔn)且理想的達(dá)到基因修飾等目的，因此可根據(jù)需要設(shè)計sgRNA 和同源供體，以實現(xiàn)供體的精準(zhǔn)敲入（圖4）。例如鐮刀型細(xì)胞貧血癥（Sickle-cell disease，SCD）是由于單堿基突變造成。Dewitt 等[59]結(jié)合了Cas9 與sgRNA 組成的RNP復(fù)合物和單鏈DNA 寡核苷酸供體（ssODN），替換了SCD 患者造血干細(xì)胞HBB 突變基因中的單堿基，并將體外培養(yǎng)的單堿基替換的細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)存活了16 周。CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因敲入不僅可以定點插入單堿基和小片段，還可進(jìn)行大片段的精準(zhǔn)敲入。Bai 等[60]報道了一種斑馬魚長單鏈DNA 模板（zLOST）。將300 nt 的zLOST 經(jīng)HDR 途徑敲入酪氨酸酶（Tyr）位點，結(jié)果顯示98%的白化胚中至少有一個色素沉著，超一半出現(xiàn)少量色素沉著。該方法精準(zhǔn)有效地修復(fù)了白化病癥。Shy 等[61]在小鼠胚胎干細(xì)胞Lef1 位點介導(dǎo)插入了1 974 bp 的片段，盡管只有0.4%的插入效率，但也為大片段的敲入提供了案例。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲入同樣存在脫靶問題，為了提高其精度和外源DNA 的整合效率，有研究者將sgRNA 靶位點序列加在800 bp 的同源臂兩端（圖5），建立了同源臂介導(dǎo)的末端連接（HMEJ）技術(shù)，并在小鼠胚胎及成體肝細(xì)胞中進(jìn)行同源重組修復(fù)，結(jié)果顯示HMEJ 介導(dǎo)的同源重組修復(fù)效率顯著提高[62]。

圖5 HMEJ 介導(dǎo)的基因敲入示意圖，引自Yao[62]等Fig.5 Schematic diagram of HMEJ -mediated gene knock-in，from Yao et al[62]

雖然CRISPR/Cas9 可采用同源重組的方式實現(xiàn)基因的定點敲入，但較低的同源重組效率和DNA雙鏈斷裂引起染色體易位、重排等風(fēng)險阻礙了該技術(shù)的應(yīng)用。2019 年Strecker J 等[63]在藍(lán)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了一種Tn7 轉(zhuǎn)座酶，它的三個亞基（tnsB，tnsC，tniQ）可以與CRISPR 效應(yīng)物Cas12k 關(guān)聯(lián)，形成CRISPR-associated transposase（CAST），開發(fā)了shCAST 系統(tǒng)，在大腸桿菌中實現(xiàn)了2.5kb 的DNA片段插入，且成功率高達(dá)80%，遠(yuǎn)超基于同源重組的CRISPR 方法。同時Klompe S E 等[64]也報道了CRISPR/Cas 與類Tn7 轉(zhuǎn)座子聯(lián)合介導(dǎo)的基因插入系統(tǒng)（Cascade），評估了將其應(yīng)用于基因組編輯的潛力。兩個系統(tǒng)相比，shCAST 系統(tǒng)更小并具有方向性，而Cascade 系統(tǒng)更加特異但插入是隨機(jī)的，在疾病和癌癥的治療中產(chǎn)生了不確定性。基于轉(zhuǎn)座的定向插入系統(tǒng)進(jìn)行基因修復(fù)與現(xiàn)有的利用同源重組的編輯方式相比，在安全性和效率上都更具優(yōu)勢。

4.4 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的單堿基編輯

基于CRISPR/Cas9 可實現(xiàn)基因的敲除和轉(zhuǎn)入及基因的單堿基編輯。2016 年David Liu 實驗室用具有單一切割活性的nCas9 蛋白與胞嘧啶脫氨酶構(gòu)建了單堿基編輯器CBE（Cytosine base editors，CBE）；2017 年構(gòu)建了ABE（Adenine base editor，ABE）單堿基編輯器，CBE 和ABE 可分別利用胞嘧啶脫氨酶或經(jīng)過改造的腺嘌呤脫氨酶對靶位點上一定范圍的胞嘧啶（C）或腺嘌呤（A）進(jìn)行脫氨基反應(yīng)，經(jīng)DNA 修復(fù)和復(fù)制，從而在不產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂的情況下完成C＞T（G＞A）和A＞G（T＞C）堿基的自由轉(zhuǎn)換[65,66]。哺乳動物細(xì)胞中存在尿嘧啶DNA 糖基化酶（Uracil DNA glycosylase,UDG），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的堿基錯配修復(fù)途徑（Base excision repair,BER）逆轉(zhuǎn)U·G 中間產(chǎn)物返回到C·G 堿基對（圖6）。為此，該實驗室將尿嘧啶DNA 糖基化酶抑制劑（Uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI）加在了CBE 系統(tǒng)上，以此來提高CBE 編輯器在哺乳動物中的編輯效率。在實際應(yīng)用中，Chadwick 等[67]利用CBE 編輯器在成年小鼠肝臟的PCSK9 基因中提前產(chǎn)生了終止密碼子，編輯后小鼠的PCSK9 和膽固醇水平顯著降低。隨后Ryu 等[68]將ABE mRNA 和sgRNA 顯微注射到小鼠胚胎中，在Try 基因中引入了白化病點突變，獲得了具有白化病表型的Try 突變小鼠。這兩種單堿基編輯系統(tǒng)的問世不僅是精準(zhǔn)基因編輯領(lǐng)域的重大突破，同時對治療許多點突變的遺傳病有重要的意義，為眾多遺傳疾病的治療提供了新的工具和思路。

圖6 CBE 和ABE 工作示意圖，引自宗媛和高彩霞[69]Fig.6 Working diagram of CBE and ABE，from Zong Yuan and Gao Caixia[69]

ABE 和CBE 單堿基編輯器雖然能進(jìn)行A＞G（T＞C）和C＞T（G＞A）的替換，但不能同時進(jìn)行這2種類型堿基的修飾。為解決這一問題，Zhang 等[70]將人類胞嘧啶脫氨酶hAID-腺嘌呤脫氨酶-Cas9n（SpCas9 D10A 突變體）融合在一起，形成了新型雙堿基編輯器A＆C-BEmax。它可以在靶序列上實現(xiàn)C＞T 和A＞G 的高效轉(zhuǎn)換，同時RNA 脫靶水平大幅降低，提高了C＞T 的編輯效率，而A＞G 的效率略有降低。隨后Sakata 等[71]將來源于七鰓鰻（Petromyzon marinus）的胞嘧啶脫氨酶PmCDA1 和鼠源的胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1 分別與腺苷脫氨酶（TadA）融合到nCas9 的C 端和N 端，開發(fā)了雙堿基堿基編輯器，成功在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)了A 和C 的同時突變，A 和C 的編輯效率分別高達(dá)40%和50%。最后Grünewald 等[72]采用了更短的腺苷脫氨酶（TadA）融合在N 端，將來源于七鰓鰻的胞嘧啶脫氨酶Pm-CDA1 融合到nCas9 C 端，開發(fā)了能同時編輯A 和C 的SPACE 系統(tǒng)。該堿基編輯器C＞T 平均編輯效率和單個CBE 效率相當(dāng)，A＞G 平均編輯效率與單個ABE 效率相比略有下降，但是SPACE 雙堿基編輯效率明顯高于ABE+CBE 的共同作用，與Sakata等[71]的研究結(jié)果一致。

雖然采用CRISPR/Cas 可方便、高效地進(jìn)行基因敲除、敲入和單堿基編輯，但仍不能采用單一的工具同時實現(xiàn)上述功能。2019 年哈佛大學(xué)David Liu實驗室通過將M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶融合到nCas9，開發(fā)了Prime Edit 基因編輯工具[73]，可實現(xiàn)12 種單堿基替換，最多44 bp 的插入和80 bp 的刪除；該系統(tǒng)通過在sgRNA 3’端加上一段用于逆轉(zhuǎn)錄的模板DNA，形成可編程的pegRNA。由pegRNA 引導(dǎo)融合蛋白結(jié)合到靶位點，nCas9 切割pegRNA 的非互補鏈，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將pegRNA 3’模板DNA 逆轉(zhuǎn)錄到基因組中，實現(xiàn)無需供體DNA 的堿基替換、插入和刪除。與其他基因編輯工具相比，對目的基因進(jìn)行堿基替換、小片段插入和刪除更有優(yōu)勢，該工具能使基因編輯更加高效精準(zhǔn)。

5 CRISPR/Cas9 基因編輯的應(yīng)用

CRISPR/Cas9 組成簡單、易操作和編輯精準(zhǔn)高效，使其在功能基因研究、種質(zhì)培育、生物模型構(gòu)建和基因治療等研究領(lǐng)域有無可比擬的優(yōu)勢。

5.1 CRISPR/Cas9 在功能基因研究中的應(yīng)用

隨著模式生物基因組測序的逐漸完善健全，利用CRISPR/Cas9 在基因組中同時進(jìn)行多靶位點的編輯成為可能，能通過全基因組功能篩選鑒定在目標(biāo)表型中起重要作用的基因。有研究顯示：將功能缺失突變引入不同基因的編碼外顯子中，能夠在人細(xì)胞中執(zhí)行強(qiáng)大的陰性和陽性篩選能力[74,75]。相比于早期使用RNAi 的修飾效率低下、脫靶嚴(yán)重以及僅限于轉(zhuǎn)錄而言，Cas9 和sgRNA 聯(lián)合介導(dǎo)的篩選可提供更高的篩選敏感性和專一性，并可設(shè)計為靶向幾乎任何DNA 序列[74]。Cas9-sgRNA 方法在靶基因位點產(chǎn)生Indels，能導(dǎo)致基因功能的完全喪失，而RNAi 方法只導(dǎo)致基因表達(dá)抑制。因此，當(dāng)靶向基因相同時，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可產(chǎn)生比RNAi 更明顯的表型，這更容易鑒定相關(guān)基因[76]。

現(xiàn)已證明CRISPR 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制（CRISPRinterference,CRISPRi）和激活（CRISPR-activation,CRISPRa）是篩選功能基因組的強(qiáng)大工具[77,78]。通過突變使Cas9 的HNH 和RuvC 結(jié)構(gòu)域失活，形成只擁有DNA 結(jié)合活性，而無核酸酶活性的缺陷Cas9（dCas9），dCas9 和sgRNA 組成的CRISPRi 并非通過在DNA 雙鏈斷裂后引入插入缺失來使基因失活，而是特異性地靶向啟動子區(qū)域抑制基因的轉(zhuǎn)錄[49,79,80]；而CRISPRa 采用dCas9 與不同轉(zhuǎn)錄激活域進(jìn)行融合，通過化膿性鏈球菌sgRNA 或募集額外轉(zhuǎn)錄激活域以上調(diào)靶基因表達(dá)的特殊sgRNA 定向至啟動子區(qū)域[77,81,82]，以此激活基因的表達(dá)，進(jìn)而研究基因的功能。

5.2 CRISPR/Cas9 在生物育種中的應(yīng)用

基因編輯已廣泛運用于水產(chǎn)動物、畜禽和植物的種質(zhì)創(chuàng)制上。Wargelius 等[83]通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功突變了大西洋鮭（Salmo salar）中脊椎動物生殖細(xì)胞存活的必需因子Dnd，獲得了不育的大西洋鮭，解決了鮭魚養(yǎng)殖中逃逸對野生種群遺傳干擾的問題。Ma 等[84]通過基因編輯突變了感染草魚（Ctenopharyngodon idella）出血病毒GCRV 的必需基因gcJAM-A，從而使草魚獲得了抗GCRV 的能力?；蚓庉嬕苍谵r(nóng)牧產(chǎn)品的育種中得到了廣泛應(yīng)用，肌肉生長抑制素（MSTN）基因?qū)∪馍L發(fā)育具有重要調(diào)控作用。Crispo[85]和Wang[86]兩個課題組分別利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，獲得了高產(chǎn)肉性能的MSTN 缺失羊和表現(xiàn)出“雙肌”表型的MSTN 雙等位基因敲除豬。MSTN 的基因編輯也在團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）[87]、溝鯰（Ictalurus punctatus）[88]和黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[89]中得到應(yīng)用，獲得了具有雙肌表型的新種質(zhì)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被廣泛應(yīng)用于植物領(lǐng)域的煙草（Nicotiana tabacum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays）和番茄（Solanum lycopersicum）等多種植物。Shimatani 等[90]通過將Cas9 與胞苷脫氨酶（Target-AID）進(jìn)行融合，再由sgRNA 進(jìn)行引導(dǎo)，從而在水稻中獲得多個除草劑抗性位點突變，并在番茄中形成了純合可遺傳的植株。Li 等[91]將nCas9 與tRNA 腺苷脫氨酶融合開發(fā)了植物腺嘌呤堿基編輯器，在水稻中進(jìn)行點突變產(chǎn)生耐除草劑的水稻。這兩項研究同樣證明了CRISPR/Cas9 編輯對作物改良的可行性，擴(kuò)展了植物中基因育種的工具。

5.3 CRISPR/Cas9 在動物模型構(gòu)建和基因治療中的應(yīng)用

動物模型是了解人類疾病發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新型基因治療的有效工具。CRISPR/Cas9 具有效率高、速度快、可遺傳能力強(qiáng)以及簡單經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，在動物模型和基因治療中有著廣闊發(fā)展空間。Li 等[92]通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建了Uhrf2 基因缺失小鼠和雙基因缺失大鼠、小鼠模型。Xue 等[93]研究表明CRISPR/Cas9 可以直接用于修飾體細(xì)胞組織中的抑癌基因和癌基因，為疾病模型的快速開發(fā)提供了一種新方法。2019 年Xu[94]等利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，編輯修飾了人成體造血干細(xì)胞中CCR5基因，修飾后的成體造血干細(xì)胞成功重建了人體的造血系統(tǒng)，且未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)和副作用。2020 年Stadtmauer 等[95]領(lǐng)導(dǎo)的一項多重CRISPR/Cas9 編輯改造的T 細(xì)胞治療癌癥的臨床試驗。結(jié)果表明，該療法在治療癌癥患者中的安全性和可行性，也為基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因治療中的作用添加了又一例證。2020 年4 月Lu[96]研究團(tuán)隊在《Nature Medicine》報道了使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯非小細(xì)胞肺癌患者T 細(xì)胞PD-1 基因用以治療肺癌的首個人類I 期臨床試驗結(jié)果，表明CRISPR/Cas9基因編輯的T 細(xì)胞的臨床應(yīng)用安全可行。這三項研究均在成體T 細(xì)胞上進(jìn)行，并未在體內(nèi)直接進(jìn)行編輯修飾，因此并不會對其他組織器官及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

6 總結(jié)與展望

迅速發(fā)展的CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)正在現(xiàn)代生命科學(xué)中產(chǎn)生巨大的作用。該技術(shù)可以高效、通用和簡單地進(jìn)行精確的基因組編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳修飾。毫無疑問，CRISPR 系統(tǒng)具有革新基因和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛力，最近已有CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的相關(guān)的臨床試驗[94,95]。然而，在CRISPR/Cas9 潛在的脫靶效應(yīng)、CRISPR 組分毒性作用以及Cas9 核酸酶的免疫原性上還需要更多的科學(xué)驗證。盡管可以通過不斷優(yōu)化改進(jìn)sgRNA 長度[43,44]、使用變體Cas9（nCas9[7,33]、dCas9[49]、xCas9[56]和spCas9-NG[55]）以及開發(fā)新的單堿基[65,66]和雙堿基編輯器[71-73]來提高基因修飾的效率和特異性，但是還有很多基因編輯問題有待改進(jìn)。因此，需深入研究CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)基因編輯的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制，以便其在各領(lǐng)域上得到適當(dāng)?shù)膽?yīng)用。