蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）的研究進(jìn)展

李浩瀾，沈輝，顧偉，孟慶國，萬夕和，喬毅，范賢平，蔣葛，李吉云

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210046）

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微孢子蟲，屬于真菌界（Fungi）微孢子蟲門（Microsporidia）單倍期綱（Haplophasea）壺孢目（Chytridiopsida）腸胞蟲科（Enterocytozoonidae）腸胞蟲屬（Enterocytozoon），是導(dǎo)致斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）和南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）肝胰腺微孢子蟲?。℉epatopancreatic Microsporidiosis，HPM）的病原?；疾∥r主要表現(xiàn)出白便綜合癥（White Feces Syndrome,WFS）及生長遲緩綜合癥（Monodon Slow Growth Syndrome,MSGS）等癥狀。該病1989 年首見于馬來西亞地區(qū)半咸水土池斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中，患病斑節(jié)對蝦產(chǎn)量低下，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)一種未知病原存在于病蝦肝胰腺小管開口近端管腔[1]。2004 年Chayaburakul 等[2]在研究泰國土池養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦生長緩慢原因的過程中，在生長遲緩的斑節(jié)對蝦肝胰腺小管上皮細(xì)胞中再次發(fā)現(xiàn)了該種病原，認(rèn)為這是一種微孢子蟲，但并不認(rèn)為其與生長緩慢具有顯著相關(guān)性。直到2009年Tourtip 等[3]對患生長遲緩綜合癥的斑節(jié)對蝦進(jìn)行細(xì)胞病理、組織病理及病原分子生物學(xué)研究后，首次將該未知微孢子蟲鑒定為一微孢子蟲新種，命名為Enterocytozoon hepatopenaei sp.Nov.，中文譯為蝦肝腸胞蟲，簡稱EHP。之后全球多個(gè)對蝦養(yǎng)殖國家和地區(qū)相繼報(bào)道了該種微孢子蟲。Ha 等[4]報(bào)道了越南養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦感染EHP 后，生長緩慢，還伴有白便癥狀。Flegel 等[5]發(fā)現(xiàn)了與Ha 等[4]報(bào)導(dǎo)的相同現(xiàn)象，認(rèn)為泰國和越南養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦及南美白對蝦的白便癥狀與一種類似EHP 的病原具有一定的關(guān)系。Tangprastittipap 等[6]報(bào)道，在泰國養(yǎng)殖的患白便癥狀以及生長遲緩的南美白對蝦感染了EHP。隨后，Tang 等[7]開發(fā)了快速檢測EHP 技術(shù)，序列比對分析的結(jié)果顯示：在泰國、越南以及中國發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲的18s rRNA 基因序列與先前Tourtip 等[3]上傳到GeneBank 的EHP 相應(yīng)序列具有96%～100%的相似性，表明這些不同地區(qū)發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲分子聚類上都為EHP。由此推測，在該研究前EHP 已經(jīng)廣泛存在于亞洲多個(gè)國家和地區(qū)。自2013年起，我國浙江省舟山地區(qū)的大棚養(yǎng)殖南美白對蝦普遍出現(xiàn)生長緩慢、養(yǎng)殖成功率低的現(xiàn)象。施慧等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，EHP 感染率高達(dá)85.19%，經(jīng)研究后初步認(rèn)為EHP 就是致病原。本實(shí)驗(yàn)室于2016 年，在江蘇省20 個(gè)南美白對蝦溫室養(yǎng)殖點(diǎn)共取樣360 頭，檢測發(fā)現(xiàn)EHP 的感染率高達(dá)54.40%，且與生長遲緩有顯著的相關(guān)性[9]。目前，EHP 已在我國、馬來西亞、泰國、越南、印度尼西亞及印度等亞洲國家廣泛流行并呈一定的爆發(fā)態(tài)勢，盡管它不會(huì)引起較高的死亡率，但感染導(dǎo)致的生長遲緩造成的經(jīng)濟(jì)損失極其嚴(yán)重，因此該疾病的防治成了亟需解決的重要問題。本文簡要綜述了EHP 的最新相關(guān)研究成果，以期為EHP 的深入研究和防治提供參考。

1 病原學(xué)

1.1 病原分類學(xué)地位

2009 年，Tourtip 等[3]在對病原組織分布觀察、超微形態(tài)觀察及小亞基序列（GenBank FJ496356）比對結(jié)果的基礎(chǔ)上，將EHP 歸類為腸胞蟲屬中的一個(gè)新種，命名為Enterocytozoon hepatopenaei sp.Nov.。2013 年Tangprasittipa 等[6]在對表現(xiàn)出白便癥狀的南美白對蝦進(jìn)行病原檢測過程中提交了一段核糖體小亞基序列（KF362130）與Tourtip 等[3]提交的序列相似性達(dá)99%。隨后，GenBank 公布了來自越南（KP759285）和中國（KP027539）[7]EHP 的核糖體小亞基序列，同源性達(dá)96%～100%，表明目前分離到的EHP 為同一物種。

1.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)

Tourtip 等[3]將生長遲緩的對蝦的肝胰腺進(jìn)行涂片，H&E 染色后，在光學(xué)顯微鏡下清晰可見孢子（圖1）。EHP 孢子為專性細(xì)胞內(nèi)寄生，長徑0.9～1.3 μm，短徑0.4～0.8 μm。在透射電顯鏡下可觀察到其孢子壁由3 層結(jié)構(gòu)組成，由外向內(nèi)依次為：電子致密的孢子外壁（2 nm）、電子透明的孢子內(nèi)壁（10 nm）以及原生質(zhì)膜，原生質(zhì)膜將孢子壁與孢原質(zhì)隔開。成熟的孢子外形呈橢圓形或梨形，包含一個(gè)核，5～6 圈盤繞的極絲，一個(gè)后極泡及錨定盤，錨定盤與極絲相連（圖2）。

圖1 斑節(jié)對蝦肝小管上皮細(xì)胞中肝腸孢蟲的顯微圖像[3]Fig.1 Photomicrographs of parasite Enterocytozoon hepatopenaei in tubule epithelial cells of the hepatopancreas of tiger shrimp Penaeus monodon

圖2 EHP 孢子透射電鏡觀察結(jié)果[10]Fig.2 Transmission electron microscopy of EHP spores

2 流行病學(xué)

2.1 研究歷史和地理分布

1989 年馬來西亞首次報(bào)道了蝦生長遲緩癥，盡管在該報(bào)道中未明確該病癥的致病原，但在對肝胰腺組織病理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了一種具有典型厚壁特征的單細(xì)胞微孢子，疑似微孢子蟲[1]。21 世紀(jì)初，泰國斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖業(yè)因?qū)ξr生長遲緩綜合癥的大面積爆發(fā)遭受了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。泰國學(xué)者Chayaburakul 等[2]在表現(xiàn)出生長遲緩癥狀的對蝦體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種病原，包括病毒、細(xì)菌以及該種未知孢子，但并未討論其與生長遲緩之間的關(guān)系，認(rèn)為該病仍然是某種未知的、潛在的病原造成。直至2009 年Tourtip 等[3]對引起泰國斑節(jié)對蝦生長遲緩的病原進(jìn)行分類鑒定，初步揭開了EHP 感染引起對蝦生長緩慢的病理學(xué)及病原學(xué)機(jī)制。隨后，越南、印度和中國相繼報(bào)導(dǎo)了EHP 感染引起的斑節(jié)對蝦或南美白對蝦的生長遲緩現(xiàn)象[4,7,11]。劉珍等[12]對實(shí)驗(yàn)室保存的樣品進(jìn)行EHP 檢測，發(fā)現(xiàn)日本囊對蝦（Penaeus japonicus）、南美白對蝦以及羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）樣品中均檢測出該病原，由此推測EHP 在更早的時(shí)期就已在我國出現(xiàn)并傳播。

有研究表明，造成EHP 在東南亞對蝦主要養(yǎng)殖國家流行的主要原因有以下幾點(diǎn)：首先，全球?qū)ξr親體、苗種和成蝦的貿(mào)易日趨頻繁，造成了病原傳播與感染，在亞洲對蝦主要養(yǎng)殖國家和地區(qū)尤為突出[13]；其次，對蝦的高密度養(yǎng)殖模式增加了EHP 傳染機(jī)率；再者，EHP 的典型結(jié)構(gòu)孢子壁抗逆性強(qiáng)，能在一環(huán)境條件下休眠和萌發(fā)，具有長期傳播與流行的能力[14]。目前已研究報(bào)道的感染地區(qū)、感染品種及主要表觀現(xiàn)象如表1。

表1 EHP 流行情況的研究報(bào)道Tab.1 The reporting of prevalence of EHP

2.2 主要宿主

早期研究表明，EHP 主要感染斑節(jié)對蝦，引起對蝦生長遲緩癥，嚴(yán)重沖擊了泰國斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖業(yè)。一度在原有池塘條件下改養(yǎng)南美白對蝦，雖在當(dāng)年取得了成功，但隨后發(fā)現(xiàn)南美白對蝦同樣會(huì)感染EHP，導(dǎo)致生長緩慢。隨后開展了關(guān)于EHP 宿主的研究，發(fā)現(xiàn)除了斑節(jié)對蝦、南美白對蝦以及細(xì)角濱對蝦（Litopenaeus stylirostris）[7]外，一些如多毛類、軟體類以及鹵蟲等活體餌料中也檢測出了EHP[7,13]。劉珍等[12]用PCR 法在實(shí)驗(yàn)室保存的其他對蝦樣本中也檢測出EHP 陽性，但EHP 陽性的物種僅是攜帶EHP 孢子，還是作為宿主被其感染目前仍不明確。因此，EHP 最主要感染脅迫宿主為斑節(jié)對蝦與南美白對蝦，這一觀點(diǎn)目前被業(yè)界廣泛接受。

2.3 流行季節(jié)及傳播途徑

EHP 的孢子壁結(jié)構(gòu)使其對環(huán)境脅迫具有很強(qiáng)的耐受能力，即使離開了宿主進(jìn)入環(huán)境中也能夠存活相當(dāng)長的一段時(shí)間。有報(bào)道稱，某些微孢子蟲的孢子在不同溫度條件下，在鹽度30 的人造海水中仍能保持感染力，最短2 周，最長可達(dá)12 周[14]。當(dāng)環(huán)境條件適宜，如養(yǎng)分、溫度、pH、離子濃度的變化等，強(qiáng)光照或者過氧化物等極端的理化條件均可促使孢子萌發(fā)而具感染性[17]。本實(shí)驗(yàn)室對江蘇南美白對蝦主要養(yǎng)殖地區(qū)的實(shí)地考察（圖3）發(fā)現(xiàn)，在一年兩季，甚至因具備供暖條件而發(fā)展出的一年三季的養(yǎng)殖周期中，均存在EHP 流行，即春夏、秋冬過渡以及隆冬時(shí)節(jié)。因此，可以初步推斷，EHP 在一年中的任何季節(jié)均可爆發(fā)、流行。

圖3 江蘇地區(qū)部分南美白對蝦養(yǎng)殖區(qū)域分布[18]Fig.3 Partial cultivation areas distribution of Litopenaeus vannamei in Jiangsu province

自EHP 被發(fā)現(xiàn)以來，對其傳播方式開展了大量的研究。Tang 等[7]在EHP 原位雜交與PCR 檢測技術(shù)過程中，感染蝦的糞便與水樣均出現(xiàn)陽性結(jié)果；將陽性蝦的肝胰腺組織投喂健康蝦以及將感染蝦與健康蝦共棲，投喂及共棲后，健康蝦的檢測結(jié)果都呈陽性。由此表明，EHP 能夠經(jīng)過口飼與共棲進(jìn)行水平傳播[15]。Salachan 等[19]對共棲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一定的設(shè)計(jì)與優(yōu)化，利用塑料網(wǎng)箱將EHP 陽性蝦與健康蝦物理隔離，經(jīng)過一段時(shí)間的共棲，健康蝦轉(zhuǎn)為陽性，由此進(jìn)一步證實(shí)EHP 可以水平傳播，初步推測病蝦通過糞便從消化道將EHP 的孢子排出體外，進(jìn)入水環(huán)境，健康蝦通過攝入環(huán)境中的孢子而被感染。在垂直傳播研究中，Vu-Khac 等[20]設(shè)計(jì)了親蝦共棲感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與感染EHP 親蝦共棲的健康親蝦及其產(chǎn)出的蝦苗，PCR 檢測均呈陽性，證實(shí)了EHP 能夠水平傳播的同時(shí)，也能夠進(jìn)行親代、子代間的垂直傳播。這種傳播特性給EHP 的防控提出了更高的要求，對其監(jiān)測不能僅局限于養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，還需要覆蓋到苗種生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

微孢子蟲的發(fā)育大致歷經(jīng)三個(gè)階段：感染期、裂殖增殖期以及孢子增殖期，只有成熟孢子階段才具備感染能力[21]。關(guān)于包括EHP 在內(nèi)的微孢子蟲可能的侵染機(jī)制，目前主要有兩種假設(shè)：其一，微孢子蟲孢子萌發(fā)，極絲彈出穿刺宿主細(xì)胞質(zhì)膜后成為極管，將孢原質(zhì)注入宿主細(xì)胞中完成感染；其二，微孢子蟲孢子萌發(fā)后，將孢原質(zhì)經(jīng)過萌發(fā)而成的極管排出孢子外，孢原質(zhì)被宿主細(xì)胞吞噬完成感染。然而微孢子蟲的感染無論是以何種方式進(jìn)行，都必須首先完成孢子與宿主細(xì)胞的識別與結(jié)合，或是孢壁蛋白與宿主細(xì)胞質(zhì)膜的互作，又或是極管蛋白與宿主細(xì)胞質(zhì)膜的互作，這也是當(dāng)下微孢子蟲研究的熱點(diǎn)。目前，在微孢子蟲研究領(lǐng)域，已完成了包括兔腦炎微孢子蟲（Encephalitozoon cuniculi）、腸道腦炎微孢子蟲（Encephalitozoon intestinalis）、海倫腦炎微孢子蟲（Encephalitozoon hellem）以及家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）在內(nèi)的多種微孢子蟲的多種孢壁蛋白以及極管蛋白的鑒定[22]。目前已在EHP 中鑒定出一種孢壁蛋白EhSWP1[23]。上述這些已鑒定的孢壁蛋白與極管蛋白，其中一部分的大致結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)確定，但是包括EhSWP1 在內(nèi)的新近鑒定的孢壁蛋白、極管蛋白在微孢子蟲的侵染過程中的作用機(jī)制還不清楚，還有待于進(jìn)一步研究與探索。

3 病理學(xué)

3.1 發(fā)病癥狀與潛伏感染

對蝦感染EHP 后不會(huì)引起明顯的死亡，患病對蝦消化吸收功能受阻，攝食減少，甚至停止攝食，終致生長遲緩甚至停滯，甲殼軟化，品質(zhì)遠(yuǎn)低于正常對蝦。EHP 感染還會(huì)導(dǎo)致對蝦免疫力下降而繼發(fā)感染其他病原。如感染EHP 的對蝦更容易感染桿菌、弧菌等病原及對蝦急性肝胰腺壞死?。ˋcute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND）、敗血性肝胰腺壞死?。⊿eptic hepatopancreatic necrosis,SHPN）等疾病[3,24,25]。Ha 等[4]在研究南美白對蝦感染EHP 時(shí)發(fā)現(xiàn)，對蝦出現(xiàn)白便現(xiàn)象。隨后，Tangprastittipap等[6]從排白便的南美白對蝦中也檢測出EHP，但通過巢式PCR 及原位雜交實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間并沒有顯著的相關(guān)性。Sriurairatana 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，患急性肝胰腺壞死綜合癥（AHPND）的南美白對蝦同樣也會(huì)出現(xiàn)白便癥狀，即白便并不是EHP 感染的特有癥狀。光學(xué)及電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，白便細(xì)微結(jié)構(gòu)呈蠕蟲狀，是肝胰腺小管上皮微絨毛脫落、折疊并聚集之后形成的。EHP 同其他細(xì)胞內(nèi)寄生病原一樣，繁殖過程中會(huì)導(dǎo)致宿主靶細(xì)胞裂解，靶組織壞死脫落，脫落的肝小管上皮細(xì)胞進(jìn)入消化道隨糞便排出體外，外觀呈白色，其主要組分實(shí)際是壞死脫落的細(xì)胞與組織。EHP 的感染還具有潛伏性。本實(shí)驗(yàn)室于2015—2017 年對江蘇近3 000 份南美白對蝦苗種樣品進(jìn)行EHP 的檢測后發(fā)現(xiàn)，其感染率約為18.90%，表明南美白對蝦苗種階段已達(dá)到較高的EHP 感染率（尚未發(fā)表）。養(yǎng)殖初始，EHP 陽性的蝦苗未表現(xiàn)出明顯癥狀，25 d 后開始厭食、肝胰腺顏色變淺、健康狀態(tài)惡化以及生長緩慢[7]，表明EHP的感染具有一定的潛伏期。

3.2 病理變化

Tourtip 等[3]首次研究了感染EHP 斑節(jié)對蝦的組織學(xué)及細(xì)胞病理學(xué)，發(fā)現(xiàn)EHP 孢子呈嗜酸性結(jié)構(gòu)且限定在肝胰腺小管上皮中的R、B 及E 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，包括孢原質(zhì)、裂殖體、孢子母細(xì)胞及成熟孢子這幾個(gè)不同的發(fā)育階段。同屬腸孢蟲屬的畢氏腸孢蟲（Enterocytozoon bieneusi）為感染寄生人類等脊椎動(dòng)物消化道上皮細(xì)胞的微孢子蟲，能引起宿主的嚴(yán)重腹瀉，與EHP 的孢子一樣，均存在于細(xì)胞質(zhì)中并與之直接接觸，導(dǎo)致上皮細(xì)胞壞死脫落，影響宿主消化吸收，造成宿主營養(yǎng)不良、生長緩慢、消瘦等病癥[9,27]。EHP 的寄生表現(xiàn)出一定的組織特異性，目前大多數(shù)研究報(bào)道稱僅在肝胰腺中發(fā)現(xiàn)。但Tang等[15]通過組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，南美白對蝦的中腸上皮細(xì)胞也可被EHP 感染，是EHP 首次感染非肝胰腺組織的報(bào)道。駱云慧等[28]利用分子生物學(xué)方法在患病對蝦的肝胰腺及腸道中檢測到EHP 陽性。Santhoshkumar 等[29]利用分子生物學(xué)方法在感染了EHP 并表現(xiàn)出明顯生長遲緩的南美白對蝦肝胰腺、心臟與腸道中檢測出了明顯的陽性條帶，在血淋巴與鰓中有輕微的條帶，在腹部與尾部的肌肉中有非常模糊的條帶，但組織病理學(xué)分析只在肝胰腺與腸道中發(fā)現(xiàn)了EHP 孢子，孢子在上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)出嗜堿性結(jié)構(gòu)以及不同的發(fā)育階段。Biju 等[30]研究了印度感染EHP 的斑節(jié)對蝦的組織病理學(xué)，發(fā)現(xiàn)孢子同樣呈現(xiàn)嗜酸性結(jié)構(gòu)且限定在細(xì)胞液泡內(nèi)，但在中腸或后腸的上皮細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)孢子。

EHP 主要感染南美白對蝦肝胰腺，在肝小管上皮細(xì)胞中呈嗜堿性結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)主要分布在肝胰腺遠(yuǎn)端的肝小管內(nèi)，呈現(xiàn)出孢原質(zhì)、裂殖體、孢子母細(xì)胞及成熟孢子等發(fā)育階段及形態(tài)[7]，且此區(qū)域內(nèi)的小管上皮細(xì)胞基底膜分離，血竇增大。在多數(shù)情況下，感染EHP 早期，對蝦組織及細(xì)胞不表現(xiàn)出明顯的病理變化，甚至在分子生物學(xué)檢測為嚴(yán)重感染的情況下，病蝦的肝胰腺組織也未出現(xiàn)顯著的病理變化。EHP 的病原變化特征與寄生于三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）肌細(xì)胞中的梭子蟹肌孢蟲（Ameson portunus）的病理變化差異明顯，隨感染時(shí)間的延長，梭子蟹肌細(xì)胞白濁變化肉眼可辨，且伴隨著白色點(diǎn)狀病灶的出現(xiàn)[31]。

4 檢測

4.1 組織病理學(xué)

EHP 寄生的靶組織為肝胰腺，在相差顯微鏡下涂片可以直接觀察到EHP 孢子[3]。為了更直觀地觀察孢子，涂片后可進(jìn)行H&E、吉姆薩或甲苯胺藍(lán)等染色。喬毅等[10]使用熒光增白劑染色，能快速、清晰地辨別涂片樣本中是否存在孢子。組織病理學(xué)檢測可以觀察到EHP 孢原質(zhì)體、裂殖體、成孢子母細(xì)胞、成熟孢子等各個(gè)發(fā)育階段的形態(tài)，可以直觀地展示出EHP 侵染及組織病理變化。Gao 等[32]使用熒光增白劑及吖啶橙雙染色，能夠顯著區(qū)分不同發(fā)育階段的EHP，在孢子染色過程中吖啶橙呈橙紅色還能表明此階段的孢子細(xì)胞具有轉(zhuǎn)錄活性。Salachan 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，核酸擴(kuò)增或原位雜交檢測為強(qiáng)陽性時(shí)，組織病理學(xué)觀察卻未發(fā)現(xiàn)明顯的變化或未見孢子感染。這主要是因?yàn)榻M織病理學(xué)的操作過程繁瑣、操作周期長且檢測靈敏度低，容易出現(xiàn)漏檢，目前僅作為基礎(chǔ)性的檢測手段。

4.2 分子生物學(xué)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）應(yīng)用范圍廣泛，靈敏度和特異性良好。該技術(shù)及其延伸技術(shù)是病原檢測的常用手段。自Tourtip 等[3]以畢氏腸胞蟲核糖小亞基序列設(shè)計(jì)了一對引物，擴(kuò)增出一段848 bp 的序列片段并提交至Genbank（FJ496356）以來，研究者們相繼設(shè)計(jì)了一系列的引物來擴(kuò)增EHP 的目的基因（表2）。Tangprasittipap等[6]研究發(fā)現(xiàn)，原位雜交顯示為輕度感染的情況下，巢式PCR 表現(xiàn)出更強(qiáng)的檢測靈敏性?，F(xiàn)已報(bào)道的分子檢測方法中，主要以SSU 18S rRNA 基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物。Jaroonlak 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，針對SSU 18S rRNA 基因設(shè)計(jì)的引物容易與其他能夠感染水生動(dòng)物且與EHP 親緣關(guān)系較近的微孢子蟲的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)，造成假陽性，因此提出了以EHP 的孢壁蛋白（SWP）為模板設(shè)計(jì)的巢式PCR 引物，具有更高的靈敏度與更好的特異性。Han 等[34]根據(jù)生物進(jìn)化過程中極具保守性的β 微管蛋白設(shè)計(jì)的EHP-β-tubulin 巢式PCR 引物，同樣比SSU 巢式PCR 具有更高的靈敏度與特異性。

表2 擴(kuò)增EHP 目的基因的引物序列Tab.2 The primer sequence for amplifying EHP target genes

為了進(jìn)一步探索EHP 與生長緩慢之間的擬合關(guān)系，進(jìn)行了EHP 基因的定量技術(shù)研發(fā)。劉珍等[12]建立了SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法，其檢測靈敏度比巢式PCR 高4 倍以上。還發(fā)現(xiàn)EHP 的載量與對蝦生長速率呈顯著負(fù)相關(guān)性，初步證實(shí)了EHP 的感染確實(shí)會(huì)導(dǎo)致對蝦生長緩慢。駱云慧等[28]建立了TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的檢測方法，其靈敏度與特異性表現(xiàn)較優(yōu)于SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

近年來，基于快速、低成本，簡便易操作性的原則，也開發(fā)了多種檢測手段，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）。孫妍等[35]根據(jù)EHP SSU 18S rRNA 基因基因序列設(shè)計(jì)了6 對引物，成功建立了EHP-LAMP 檢測方法。該方法最低檢測限度為3.71 個(gè)質(zhì)?？截?μL，不會(huì)與對蝦其他常見病原發(fā)生交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的靈敏度與特異性。陳進(jìn)會(huì)等[36]根據(jù)EHP SSU 18S rRNA基因保守序列設(shè)計(jì)了4 對引物，建立了LAPM檢測方法，再不與其他對蝦病原交叉反應(yīng)的同時(shí)最低可檢測出10 fg/μL 的質(zhì)粒DNA，同樣具有良好的靈敏度與特異性，反應(yīng)裝置要求低，操作與結(jié)果觀察簡單，非常適合生產(chǎn)一線使用。在此基礎(chǔ)之上，也有其他研究者建立了各有特色的LAMP 技術(shù)。Suebsing 等[37]將LAMP 與納米金顆粒結(jié)合增強(qiáng)了反應(yīng)結(jié)果的可視化特性，僅通過肉眼觀察顏色的變化即可判斷檢測的結(jié)果。Kumar 等[38]將LAMP 與SYBR Green I 熒光染料結(jié)合，在紫外光照下可散發(fā)出熒光，增加特異性的同時(shí)也兼顧了結(jié)果的可視性。

重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid-amplification，RAA）也是近年來新興的一種檢測手段，在能保證良好的靈敏度與特異性基礎(chǔ)上，除了具有的操作簡單快速、成本低廉的特點(diǎn)外，節(jié)能、便攜是其亮點(diǎn)。黃紀(jì)徽等[39]根據(jù)EHP SSU 18S rRNA 基因保守序列設(shè)計(jì)并合成了引物和探針，建立了在37℃下快速檢測EHP 的RAA 恒溫?zé)晒鈾z測方法，不需要高溫循環(huán)，檢測的最低限為10 個(gè)質(zhì)?？截?μL，且不與其他蝦病病原交叉互反，靈敏度與特異性表現(xiàn)良好。

4.3 原位雜交

原位雜交（In situ hybridization,ISH）在EHP 研究中常為一種輔助手段，以進(jìn)一步確認(rèn)組織切片和PCR 檢測的結(jié)果。Tangprasittipap 等[6]研發(fā)了地高辛標(biāo)記探針檢測EHP 的方法，在具有白便癥狀的對蝦肝胰腺常規(guī)組織病理檢測未顯示孢子的情況下，利用地高辛標(biāo)記的探針檢測發(fā)現(xiàn)了大量EHP 孢子，表明該方法具有更好的靈敏度。Tang 等[7]應(yīng)用地高辛標(biāo)記探針處理感染EHP 的南美白對蝦、細(xì)角濱對蝦和患有“棉花蝦病”的斑節(jié)對蝦的組織切片行。結(jié)果表明該探針不與引起棉花蝦病的微孢子蟲發(fā)生反應(yīng)，也不與一些水生動(dòng)物的基因組DNA 反應(yīng)，特異性表現(xiàn)不俗。Biju 等[30]及Rajendran 等[11]以ENF 779F/ENF779R 為引物探針，檢測了PCR 陽性樣品的組織切片，該引物探針同樣表現(xiàn)出較好的靈敏度與特異性。Ahmed 等[41]利用原位雜交技術(shù)成功檢測出了以往難以發(fā)現(xiàn)和確診的金頭鯛（Sparus aurata）腸道粘孢子蟲（Enterospora nucleophila），結(jié)合卡爾科弗盧爾熒光增白劑（Calcofluor White Stain），清晰地顯示了腸道粘孢子蟲的發(fā)育階段與侵染組織，說明原位雜交技術(shù)良好的靈敏度與特異性能夠在組織層面直觀展示病原感染的位置與程度，也能揭示出病原侵染的具體路徑。截止目前，研究EHP 感染的組織分布主要都集中在對蝦肝胰腺，EHP 在對蝦體內(nèi)其他組織是否也有分布，或是否存在一個(gè)具體的感染路徑，相關(guān)研究還較為缺乏，甚至還未見有報(bào)道。

5 防治措施

EHP 具有幾丁質(zhì)的孢子壁，抗逆性較強(qiáng)，常規(guī)藥物很難穿透孢子壁殺滅孢子，截止目前未見有明確藥物可殺滅EHP 的報(bào)道。Tang 等[15]發(fā)現(xiàn)對控制微孢子蟲有一定作用的煙曲霉素?zé)o法消除或削弱EHP 感染。目前，主要從增強(qiáng)免疫調(diào)控、環(huán)境等角度來探索EHP 的防治措施。Palanikumar 等[42]利用從檸檬、大蒜、生姜、糖棕以及黑吉豆等植物中提取的物質(zhì)如維生素C、蒜素、生姜素、棕櫚糖及黑吉豆粉以輔助強(qiáng)化南美白對蝦的體質(zhì)，增強(qiáng)其消化吸收、抗氧化、抗菌、抗炎癥能力，在一定程度上抵消EHP感染帶來的不利影響。徐勝威等[43,44]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氨氮濃度在9 mg/L 時(shí)，相較于空白對照組以及實(shí)驗(yàn)組6 mg/L，對蝦增長率最高，小蝦比例明顯下降；亞硝酸鹽濃度在10 mg/L 時(shí)，相較于空白對照組以及實(shí)驗(yàn)組20 mg/L，感染對蝦的生長率有所增加，EHP 攜帶量顯著降低，表明一定濃度的氨氮與亞硝酸鹽的脅迫，能抑制EHP 的感染，推測是EHP 孢子生長發(fā)育所需ATP 直接來源于對蝦肝胰腺組織細(xì)胞，氨氮與亞硝酸鹽的脅迫在一定程度上損傷對蝦肝胰腺，減少EHP 孢子生長發(fā)育所需ATP 的獲得量，一定程度上抑制了其感染與傳播。

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，無論是添加植物提取物佐劑，還是采用環(huán)境脅迫的方式，雖然能產(chǎn)生一定的效果，但是仍然無法完全排除對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中EHP 感染的影響，治標(biāo)不治本。鑒于目前尚無有效的治療藥物及手段，EHP 的防治措施重心將長期偏向防控，而病原檢疫則是防控的關(guān)鍵。檢疫能夠盡早發(fā)現(xiàn)EHP，最大限度減少EHP 感染造成的損失，檢測對象應(yīng)包括親蝦、蝦苗、飼料以及養(yǎng)殖環(huán)境。從整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈條來看，首先，從源頭進(jìn)行把控，應(yīng)選擇無特定病原（Specific pathogen free,SPF）親蝦，防止EHP垂直傳染給苗種。其次，做好苗種檢疫，苗種檢疫以確保無EHP 攜帶防止水平傳播[13]。再者，切斷傳播途徑，對養(yǎng)殖環(huán)境消毒與檢測，包括養(yǎng)殖設(shè)施、養(yǎng)殖用具、養(yǎng)殖水等，以防止環(huán)境中EHP 孢子殘留造成的水平傳播。而后，還不能忽視餌料可能存在的問題。有報(bào)道指出，從養(yǎng)殖用的如鹵蟲、多毛類、軟體類等生物餌料中檢出EHP[7,13,15]，因此使用前應(yīng)做好病原檢測，避免使用EHP 感染或污染的生物餌料。EHP 的孢子會(huì)隨蝦的糞便排出體外，進(jìn)入水體并沉積到養(yǎng)殖池底質(zhì)中[15]，需要有效清理、消毒和檢測養(yǎng)殖水、底質(zhì)，養(yǎng)殖尾水同樣需要消毒后檢測以確保其安全無污染才可進(jìn)行排放。本實(shí)驗(yàn)室于2019年調(diào)查研究了江蘇主要養(yǎng)殖地區(qū)EHP 的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)溫室養(yǎng)殖模式對EHP 傳播的限制作用強(qiáng)于傳統(tǒng)的土池養(yǎng)殖模式。溫室養(yǎng)殖單獨(dú)成棚的特性在一定程度上限制了EHP 的水平傳播，且能單獨(dú)配給水源，管理用水循環(huán)，模塊化的養(yǎng)殖特點(diǎn)也避免了病原感染一損俱損的惡性局面[18]。

EHP 的滅活長期以來一直是生產(chǎn)實(shí)踐中的難題，常規(guī)手段效果有限。Aldama-Cano 等[17]在研究理化因素對EHP 活力影響的過程中，發(fā)現(xiàn)EHP 孢子對極端低溫非常敏感，-20℃冷凍2 h 以上可完全抑制EHP 孢子的萌發(fā)；使用40 mg/L 65%的活性氯、15 mg/L KMnO4以及20%的乙醇分別處理15 min 以上均可100%抑制EHP 的活性。上述條件在生產(chǎn)實(shí)踐中具有非常好的應(yīng)用前景，可以用來消毒具有化學(xué)惰性表面的養(yǎng)殖設(shè)施及用具。低溫冷凍則可以用于鮮活餌料的EHP 滅活，采用-20℃以下且持續(xù)24 h 以上的冷凍處理鮮活餌料可以滅活包括EHP在內(nèi)的大部分病原[17,45]。還可以將餌料冷凍后進(jìn)行放射性射線照射殺滅病原，這更適用于大規(guī)模的現(xiàn)代化養(yǎng)殖[13]。最后，由于EHP 在感染對蝦前是否存在其他中間宿主目前仍不清楚，參考引起斑節(jié)對蝦“棉花蝦”病的對蝦八孢蟲（Agmaosma penaei）的應(yīng)對方式，應(yīng)避免對蝦與其他水生動(dòng)物混養(yǎng)，從根本上排除這個(gè)可能性[13]。

6 展望

目前EHP 生理結(jié)構(gòu)、組織病理、傳播機(jī)制以及檢測防控技術(shù)等已有一定的研究，但是，對EHP 生活史、詳細(xì)侵染機(jī)制等還未作詳細(xì)闡釋。后續(xù)的研究焦點(diǎn)應(yīng)主要集中在以下方面：（一）EHP 生活史，闡釋其發(fā)育生理學(xué)特點(diǎn)；（二）EHP 侵染的分子機(jī)制，探索其孢壁蛋白、極管蛋白與宿主細(xì)胞識別相關(guān)的作用機(jī)制；（三）EHP 與關(guān)鍵環(huán)境因子之間的互作關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)其重要作用因子，為EHP 的防治提供技術(shù)支撐。