• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei)的研究進展

    2022-07-01 02:52:12李浩瀾沈輝顧偉孟慶國萬夕和喬毅范賢平蔣葛李吉云
    水產(chǎn)學(xué)雜志 2022年3期
    關(guān)鍵詞:生長檢測

    李浩瀾,沈輝,顧偉,孟慶國,萬夕和,喬毅,范賢平,蔣葛,李吉云

    (1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所,江蘇 南通 226007;2.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 210046)

    蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是一種專性細胞內(nèi)寄生的微孢子蟲,屬于真菌界(Fungi)微孢子蟲門(Microsporidia)單倍期綱(Haplophasea)壺孢目(Chytridiopsida)腸胞蟲科(Enterocytozoonidae)腸胞蟲屬(Enterocytozoon),是導(dǎo)致斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)和南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)肝胰腺微孢子蟲病(Hepatopancreatic Microsporidiosis,HPM)的病原。患病蝦主要表現(xiàn)出白便綜合癥(White Feces Syndrome,WFS)及生長遲緩綜合癥(Monodon Slow Growth Syndrome,MSGS)等癥狀。該病1989 年首見于馬來西亞地區(qū)半咸水土池斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中,患病斑節(jié)對蝦產(chǎn)量低下,組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)一種未知病原存在于病蝦肝胰腺小管開口近端管腔[1]。2004 年Chayaburakul 等[2]在研究泰國土池養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦生長緩慢原因的過程中,在生長遲緩的斑節(jié)對蝦肝胰腺小管上皮細胞中再次發(fā)現(xiàn)了該種病原,認為這是一種微孢子蟲,但并不認為其與生長緩慢具有顯著相關(guān)性。直到2009年Tourtip 等[3]對患生長遲緩綜合癥的斑節(jié)對蝦進行細胞病理、組織病理及病原分子生物學(xué)研究后,首次將該未知微孢子蟲鑒定為一微孢子蟲新種,命名為Enterocytozoon hepatopenaei sp.Nov.,中文譯為蝦肝腸胞蟲,簡稱EHP。之后全球多個對蝦養(yǎng)殖國家和地區(qū)相繼報道了該種微孢子蟲。Ha 等[4]報道了越南養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦感染EHP 后,生長緩慢,還伴有白便癥狀。Flegel 等[5]發(fā)現(xiàn)了與Ha 等[4]報導(dǎo)的相同現(xiàn)象,認為泰國和越南養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦及南美白對蝦的白便癥狀與一種類似EHP 的病原具有一定的關(guān)系。Tangprastittipap 等[6]報道,在泰國養(yǎng)殖的患白便癥狀以及生長遲緩的南美白對蝦感染了EHP。隨后,Tang 等[7]開發(fā)了快速檢測EHP 技術(shù),序列比對分析的結(jié)果顯示:在泰國、越南以及中國發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲的18s rRNA 基因序列與先前Tourtip 等[3]上傳到GeneBank 的EHP 相應(yīng)序列具有96%~100%的相似性,表明這些不同地區(qū)發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲分子聚類上都為EHP。由此推測,在該研究前EHP 已經(jīng)廣泛存在于亞洲多個國家和地區(qū)。自2013年起,我國浙江省舟山地區(qū)的大棚養(yǎng)殖南美白對蝦普遍出現(xiàn)生長緩慢、養(yǎng)殖成功率低的現(xiàn)象。施慧等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn),EHP 感染率高達85.19%,經(jīng)研究后初步認為EHP 就是致病原。本實驗室于2016 年,在江蘇省20 個南美白對蝦溫室養(yǎng)殖點共取樣360 頭,檢測發(fā)現(xiàn)EHP 的感染率高達54.40%,且與生長遲緩有顯著的相關(guān)性[9]。目前,EHP 已在我國、馬來西亞、泰國、越南、印度尼西亞及印度等亞洲國家廣泛流行并呈一定的爆發(fā)態(tài)勢,盡管它不會引起較高的死亡率,但感染導(dǎo)致的生長遲緩造成的經(jīng)濟損失極其嚴重,因此該疾病的防治成了亟需解決的重要問題。本文簡要綜述了EHP 的最新相關(guān)研究成果,以期為EHP 的深入研究和防治提供參考。

    1 病原學(xué)

    1.1 病原分類學(xué)地位

    2009 年,Tourtip 等[3]在對病原組織分布觀察、超微形態(tài)觀察及小亞基序列(GenBank FJ496356)比對結(jié)果的基礎(chǔ)上,將EHP 歸類為腸胞蟲屬中的一個新種,命名為Enterocytozoon hepatopenaei sp.Nov.。2013 年Tangprasittipa 等[6]在對表現(xiàn)出白便癥狀的南美白對蝦進行病原檢測過程中提交了一段核糖體小亞基序列(KF362130)與Tourtip 等[3]提交的序列相似性達99%。隨后,GenBank 公布了來自越南(KP759285)和中國(KP027539)[7]EHP 的核糖體小亞基序列,同源性達96%~100%,表明目前分離到的EHP 為同一物種。

    1.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)

    Tourtip 等[3]將生長遲緩的對蝦的肝胰腺進行涂片,H&E 染色后,在光學(xué)顯微鏡下清晰可見孢子(圖1)。EHP 孢子為專性細胞內(nèi)寄生,長徑0.9~1.3 μm,短徑0.4~0.8 μm。在透射電顯鏡下可觀察到其孢子壁由3 層結(jié)構(gòu)組成,由外向內(nèi)依次為:電子致密的孢子外壁(2 nm)、電子透明的孢子內(nèi)壁(10 nm)以及原生質(zhì)膜,原生質(zhì)膜將孢子壁與孢原質(zhì)隔開。成熟的孢子外形呈橢圓形或梨形,包含一個核,5~6 圈盤繞的極絲,一個后極泡及錨定盤,錨定盤與極絲相連(圖2)。

    圖1 斑節(jié)對蝦肝小管上皮細胞中肝腸孢蟲的顯微圖像[3]Fig.1 Photomicrographs of parasite Enterocytozoon hepatopenaei in tubule epithelial cells of the hepatopancreas of tiger shrimp Penaeus monodon

    圖2 EHP 孢子透射電鏡觀察結(jié)果[10]Fig.2 Transmission electron microscopy of EHP spores

    2 流行病學(xué)

    2.1 研究歷史和地理分布

    1989 年馬來西亞首次報道了蝦生長遲緩癥,盡管在該報道中未明確該病癥的致病原,但在對肝胰腺組織病理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了一種具有典型厚壁特征的單細胞微孢子,疑似微孢子蟲[1]。21 世紀初,泰國斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖業(yè)因?qū)ξr生長遲緩綜合癥的大面積爆發(fā)遭受了嚴重的經(jīng)濟損失。泰國學(xué)者Chayaburakul 等[2]在表現(xiàn)出生長遲緩癥狀的對蝦體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種病原,包括病毒、細菌以及該種未知孢子,但并未討論其與生長遲緩之間的關(guān)系,認為該病仍然是某種未知的、潛在的病原造成。直至2009 年Tourtip 等[3]對引起泰國斑節(jié)對蝦生長遲緩的病原進行分類鑒定,初步揭開了EHP 感染引起對蝦生長緩慢的病理學(xué)及病原學(xué)機制。隨后,越南、印度和中國相繼報導(dǎo)了EHP 感染引起的斑節(jié)對蝦或南美白對蝦的生長遲緩現(xiàn)象[4,7,11]。劉珍等[12]對實驗室保存的樣品進行EHP 檢測,發(fā)現(xiàn)日本囊對蝦(Penaeus japonicus)、南美白對蝦以及羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)樣品中均檢測出該病原,由此推測EHP 在更早的時期就已在我國出現(xiàn)并傳播。

    有研究表明,造成EHP 在東南亞對蝦主要養(yǎng)殖國家流行的主要原因有以下幾點:首先,全球?qū)ξr親體、苗種和成蝦的貿(mào)易日趨頻繁,造成了病原傳播與感染,在亞洲對蝦主要養(yǎng)殖國家和地區(qū)尤為突出[13];其次,對蝦的高密度養(yǎng)殖模式增加了EHP 傳染機率;再者,EHP 的典型結(jié)構(gòu)孢子壁抗逆性強,能在一環(huán)境條件下休眠和萌發(fā),具有長期傳播與流行的能力[14]。目前已研究報道的感染地區(qū)、感染品種及主要表觀現(xiàn)象如表1。

    表1 EHP 流行情況的研究報道Tab.1 The reporting of prevalence of EHP

    2.2 主要宿主

    早期研究表明,EHP 主要感染斑節(jié)對蝦,引起對蝦生長遲緩癥,嚴重沖擊了泰國斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖業(yè)。一度在原有池塘條件下改養(yǎng)南美白對蝦,雖在當年取得了成功,但隨后發(fā)現(xiàn)南美白對蝦同樣會感染EHP,導(dǎo)致生長緩慢。隨后開展了關(guān)于EHP 宿主的研究,發(fā)現(xiàn)除了斑節(jié)對蝦、南美白對蝦以及細角濱對蝦(Litopenaeus stylirostris)[7]外,一些如多毛類、軟體類以及鹵蟲等活體餌料中也檢測出了EHP[7,13]。劉珍等[12]用PCR 法在實驗室保存的其他對蝦樣本中也檢測出EHP 陽性,但EHP 陽性的物種僅是攜帶EHP 孢子,還是作為宿主被其感染目前仍不明確。因此,EHP 最主要感染脅迫宿主為斑節(jié)對蝦與南美白對蝦,這一觀點目前被業(yè)界廣泛接受。

    2.3 流行季節(jié)及傳播途徑

    EHP 的孢子壁結(jié)構(gòu)使其對環(huán)境脅迫具有很強的耐受能力,即使離開了宿主進入環(huán)境中也能夠存活相當長的一段時間。有報道稱,某些微孢子蟲的孢子在不同溫度條件下,在鹽度30 的人造海水中仍能保持感染力,最短2 周,最長可達12 周[14]。當環(huán)境條件適宜,如養(yǎng)分、溫度、pH、離子濃度的變化等,強光照或者過氧化物等極端的理化條件均可促使孢子萌發(fā)而具感染性[17]。本實驗室對江蘇南美白對蝦主要養(yǎng)殖地區(qū)的實地考察(圖3)發(fā)現(xiàn),在一年兩季,甚至因具備供暖條件而發(fā)展出的一年三季的養(yǎng)殖周期中,均存在EHP 流行,即春夏、秋冬過渡以及隆冬時節(jié)。因此,可以初步推斷,EHP 在一年中的任何季節(jié)均可爆發(fā)、流行。

    圖3 江蘇地區(qū)部分南美白對蝦養(yǎng)殖區(qū)域分布[18]Fig.3 Partial cultivation areas distribution of Litopenaeus vannamei in Jiangsu province

    自EHP 被發(fā)現(xiàn)以來,對其傳播方式開展了大量的研究。Tang 等[7]在EHP 原位雜交與PCR 檢測技術(shù)過程中,感染蝦的糞便與水樣均出現(xiàn)陽性結(jié)果;將陽性蝦的肝胰腺組織投喂健康蝦以及將感染蝦與健康蝦共棲,投喂及共棲后,健康蝦的檢測結(jié)果都呈陽性。由此表明,EHP 能夠經(jīng)過口飼與共棲進行水平傳播[15]。Salachan 等[19]對共棲實驗進行了一定的設(shè)計與優(yōu)化,利用塑料網(wǎng)箱將EHP 陽性蝦與健康蝦物理隔離,經(jīng)過一段時間的共棲,健康蝦轉(zhuǎn)為陽性,由此進一步證實EHP 可以水平傳播,初步推測病蝦通過糞便從消化道將EHP 的孢子排出體外,進入水環(huán)境,健康蝦通過攝入環(huán)境中的孢子而被感染。在垂直傳播研究中,Vu-Khac 等[20]設(shè)計了親蝦共棲感染實驗,發(fā)現(xiàn)與感染EHP 親蝦共棲的健康親蝦及其產(chǎn)出的蝦苗,PCR 檢測均呈陽性,證實了EHP 能夠水平傳播的同時,也能夠進行親代、子代間的垂直傳播。這種傳播特性給EHP 的防控提出了更高的要求,對其監(jiān)測不能僅局限于養(yǎng)殖環(huán)節(jié),還需要覆蓋到苗種生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

    微孢子蟲的發(fā)育大致歷經(jīng)三個階段:感染期、裂殖增殖期以及孢子增殖期,只有成熟孢子階段才具備感染能力[21]。關(guān)于包括EHP 在內(nèi)的微孢子蟲可能的侵染機制,目前主要有兩種假設(shè):其一,微孢子蟲孢子萌發(fā),極絲彈出穿刺宿主細胞質(zhì)膜后成為極管,將孢原質(zhì)注入宿主細胞中完成感染;其二,微孢子蟲孢子萌發(fā)后,將孢原質(zhì)經(jīng)過萌發(fā)而成的極管排出孢子外,孢原質(zhì)被宿主細胞吞噬完成感染。然而微孢子蟲的感染無論是以何種方式進行,都必須首先完成孢子與宿主細胞的識別與結(jié)合,或是孢壁蛋白與宿主細胞質(zhì)膜的互作,又或是極管蛋白與宿主細胞質(zhì)膜的互作,這也是當下微孢子蟲研究的熱點。目前,在微孢子蟲研究領(lǐng)域,已完成了包括兔腦炎微孢子蟲(Encephalitozoon cuniculi)、腸道腦炎微孢子蟲(Encephalitozoon intestinalis)、海倫腦炎微孢子蟲(Encephalitozoon hellem)以及家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)在內(nèi)的多種微孢子蟲的多種孢壁蛋白以及極管蛋白的鑒定[22]。目前已在EHP 中鑒定出一種孢壁蛋白EhSWP1[23]。上述這些已鑒定的孢壁蛋白與極管蛋白,其中一部分的大致結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)確定,但是包括EhSWP1 在內(nèi)的新近鑒定的孢壁蛋白、極管蛋白在微孢子蟲的侵染過程中的作用機制還不清楚,還有待于進一步研究與探索。

    3 病理學(xué)

    3.1 發(fā)病癥狀與潛伏感染

    對蝦感染EHP 后不會引起明顯的死亡,患病對蝦消化吸收功能受阻,攝食減少,甚至停止攝食,終致生長遲緩甚至停滯,甲殼軟化,品質(zhì)遠低于正常對蝦。EHP 感染還會導(dǎo)致對蝦免疫力下降而繼發(fā)感染其他病原。如感染EHP 的對蝦更容易感染桿菌、弧菌等病原及對蝦急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)、敗血性肝胰腺壞死?。⊿eptic hepatopancreatic necrosis,SHPN)等疾病[3,24,25]。Ha 等[4]在研究南美白對蝦感染EHP 時發(fā)現(xiàn),對蝦出現(xiàn)白便現(xiàn)象。隨后,Tangprastittipap等[6]從排白便的南美白對蝦中也檢測出EHP,但通過巢式PCR 及原位雜交實驗分析發(fā)現(xiàn),兩者之間并沒有顯著的相關(guān)性。Sriurairatana 等[26]研究發(fā)現(xiàn),患急性肝胰腺壞死綜合癥(AHPND)的南美白對蝦同樣也會出現(xiàn)白便癥狀,即白便并不是EHP 感染的特有癥狀。光學(xué)及電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),白便細微結(jié)構(gòu)呈蠕蟲狀,是肝胰腺小管上皮微絨毛脫落、折疊并聚集之后形成的。EHP 同其他細胞內(nèi)寄生病原一樣,繁殖過程中會導(dǎo)致宿主靶細胞裂解,靶組織壞死脫落,脫落的肝小管上皮細胞進入消化道隨糞便排出體外,外觀呈白色,其主要組分實際是壞死脫落的細胞與組織。EHP 的感染還具有潛伏性。本實驗室于2015—2017 年對江蘇近3 000 份南美白對蝦苗種樣品進行EHP 的檢測后發(fā)現(xiàn),其感染率約為18.90%,表明南美白對蝦苗種階段已達到較高的EHP 感染率(尚未發(fā)表)。養(yǎng)殖初始,EHP 陽性的蝦苗未表現(xiàn)出明顯癥狀,25 d 后開始厭食、肝胰腺顏色變淺、健康狀態(tài)惡化以及生長緩慢[7],表明EHP的感染具有一定的潛伏期。

    3.2 病理變化

    Tourtip 等[3]首次研究了感染EHP 斑節(jié)對蝦的組織學(xué)及細胞病理學(xué),發(fā)現(xiàn)EHP 孢子呈嗜酸性結(jié)構(gòu)且限定在肝胰腺小管上皮中的R、B 及E 細胞的細胞質(zhì)中,包括孢原質(zhì)、裂殖體、孢子母細胞及成熟孢子這幾個不同的發(fā)育階段。同屬腸孢蟲屬的畢氏腸孢蟲(Enterocytozoon bieneusi)為感染寄生人類等脊椎動物消化道上皮細胞的微孢子蟲,能引起宿主的嚴重腹瀉,與EHP 的孢子一樣,均存在于細胞質(zhì)中并與之直接接觸,導(dǎo)致上皮細胞壞死脫落,影響宿主消化吸收,造成宿主營養(yǎng)不良、生長緩慢、消瘦等病癥[9,27]。EHP 的寄生表現(xiàn)出一定的組織特異性,目前大多數(shù)研究報道稱僅在肝胰腺中發(fā)現(xiàn)。但Tang等[15]通過組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),南美白對蝦的中腸上皮細胞也可被EHP 感染,是EHP 首次感染非肝胰腺組織的報道。駱云慧等[28]利用分子生物學(xué)方法在患病對蝦的肝胰腺及腸道中檢測到EHP 陽性。Santhoshkumar 等[29]利用分子生物學(xué)方法在感染了EHP 并表現(xiàn)出明顯生長遲緩的南美白對蝦肝胰腺、心臟與腸道中檢測出了明顯的陽性條帶,在血淋巴與鰓中有輕微的條帶,在腹部與尾部的肌肉中有非常模糊的條帶,但組織病理學(xué)分析只在肝胰腺與腸道中發(fā)現(xiàn)了EHP 孢子,孢子在上皮細胞的細胞質(zhì)中呈現(xiàn)出嗜堿性結(jié)構(gòu)以及不同的發(fā)育階段。Biju 等[30]研究了印度感染EHP 的斑節(jié)對蝦的組織病理學(xué),發(fā)現(xiàn)孢子同樣呈現(xiàn)嗜酸性結(jié)構(gòu)且限定在細胞液泡內(nèi),但在中腸或后腸的上皮細胞中未發(fā)現(xiàn)孢子。

    EHP 主要感染南美白對蝦肝胰腺,在肝小管上皮細胞中呈嗜堿性結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)主要分布在肝胰腺遠端的肝小管內(nèi),呈現(xiàn)出孢原質(zhì)、裂殖體、孢子母細胞及成熟孢子等發(fā)育階段及形態(tài)[7],且此區(qū)域內(nèi)的小管上皮細胞基底膜分離,血竇增大。在多數(shù)情況下,感染EHP 早期,對蝦組織及細胞不表現(xiàn)出明顯的病理變化,甚至在分子生物學(xué)檢測為嚴重感染的情況下,病蝦的肝胰腺組織也未出現(xiàn)顯著的病理變化。EHP 的病原變化特征與寄生于三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)肌細胞中的梭子蟹肌孢蟲(Ameson portunus)的病理變化差異明顯,隨感染時間的延長,梭子蟹肌細胞白濁變化肉眼可辨,且伴隨著白色點狀病灶的出現(xiàn)[31]。

    4 檢測

    4.1 組織病理學(xué)

    EHP 寄生的靶組織為肝胰腺,在相差顯微鏡下涂片可以直接觀察到EHP 孢子[3]。為了更直觀地觀察孢子,涂片后可進行H&E、吉姆薩或甲苯胺藍等染色。喬毅等[10]使用熒光增白劑染色,能快速、清晰地辨別涂片樣本中是否存在孢子。組織病理學(xué)檢測可以觀察到EHP 孢原質(zhì)體、裂殖體、成孢子母細胞、成熟孢子等各個發(fā)育階段的形態(tài),可以直觀地展示出EHP 侵染及組織病理變化。Gao 等[32]使用熒光增白劑及吖啶橙雙染色,能夠顯著區(qū)分不同發(fā)育階段的EHP,在孢子染色過程中吖啶橙呈橙紅色還能表明此階段的孢子細胞具有轉(zhuǎn)錄活性。Salachan 等[19]研究發(fā)現(xiàn),核酸擴增或原位雜交檢測為強陽性時,組織病理學(xué)觀察卻未發(fā)現(xiàn)明顯的變化或未見孢子感染。這主要是因為組織病理學(xué)的操作過程繁瑣、操作周期長且檢測靈敏度低,容易出現(xiàn)漏檢,目前僅作為基礎(chǔ)性的檢測手段。

    4.2 分子生物學(xué)

    聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)應(yīng)用范圍廣泛,靈敏度和特異性良好。該技術(shù)及其延伸技術(shù)是病原檢測的常用手段。自Tourtip 等[3]以畢氏腸胞蟲核糖小亞基序列設(shè)計了一對引物,擴增出一段848 bp 的序列片段并提交至Genbank(FJ496356)以來,研究者們相繼設(shè)計了一系列的引物來擴增EHP 的目的基因(表2)。Tangprasittipap等[6]研究發(fā)現(xiàn),原位雜交顯示為輕度感染的情況下,巢式PCR 表現(xiàn)出更強的檢測靈敏性?,F(xiàn)已報道的分子檢測方法中,主要以SSU 18S rRNA 基因為目的基因設(shè)計引物。Jaroonlak 等[33]研究發(fā)現(xiàn),針對SSU 18S rRNA 基因設(shè)計的引物容易與其他能夠感染水生動物且與EHP 親緣關(guān)系較近的微孢子蟲的DNA發(fā)生交叉反應(yīng),造成假陽性,因此提出了以EHP 的孢壁蛋白(SWP)為模板設(shè)計的巢式PCR 引物,具有更高的靈敏度與更好的特異性。Han 等[34]根據(jù)生物進化過程中極具保守性的β 微管蛋白設(shè)計的EHP-β-tubulin 巢式PCR 引物,同樣比SSU 巢式PCR 具有更高的靈敏度與特異性。

    表2 擴增EHP 目的基因的引物序列Tab.2 The primer sequence for amplifying EHP target genes

    為了進一步探索EHP 與生長緩慢之間的擬合關(guān)系,進行了EHP 基因的定量技術(shù)研發(fā)。劉珍等[12]建立了SYBR Green I 實時熒光定量PCR 檢測方法,其檢測靈敏度比巢式PCR 高4 倍以上。還發(fā)現(xiàn)EHP 的載量與對蝦生長速率呈顯著負相關(guān)性,初步證實了EHP 的感染確實會導(dǎo)致對蝦生長緩慢。駱云慧等[28]建立了TaqMan 實時熒光定量PCR 的檢測方法,其靈敏度與特異性表現(xiàn)較優(yōu)于SYBR Green I實時熒光定量PCR。

    近年來,基于快速、低成本,簡便易操作性的原則,也開發(fā)了多種檢測手段,如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。孫妍等[35]根據(jù)EHP SSU 18S rRNA 基因基因序列設(shè)計了6 對引物,成功建立了EHP-LAMP 檢測方法。該方法最低檢測限度為3.71 個質(zhì)??截?μL,不會與對蝦其他常見病原發(fā)生交叉反應(yīng),表現(xiàn)出良好的靈敏度與特異性。陳進會等[36]根據(jù)EHP SSU 18S rRNA基因保守序列設(shè)計了4 對引物,建立了LAPM檢測方法,再不與其他對蝦病原交叉反應(yīng)的同時最低可檢測出10 fg/μL 的質(zhì)粒DNA,同樣具有良好的靈敏度與特異性,反應(yīng)裝置要求低,操作與結(jié)果觀察簡單,非常適合生產(chǎn)一線使用。在此基礎(chǔ)之上,也有其他研究者建立了各有特色的LAMP 技術(shù)。Suebsing 等[37]將LAMP 與納米金顆粒結(jié)合增強了反應(yīng)結(jié)果的可視化特性,僅通過肉眼觀察顏色的變化即可判斷檢測的結(jié)果。Kumar 等[38]將LAMP 與SYBR Green I 熒光染料結(jié)合,在紫外光照下可散發(fā)出熒光,增加特異性的同時也兼顧了結(jié)果的可視性。

    重組酶介導(dǎo)核酸擴增(Recombinase-aid-amplification,RAA)也是近年來新興的一種檢測手段,在能保證良好的靈敏度與特異性基礎(chǔ)上,除了具有的操作簡單快速、成本低廉的特點外,節(jié)能、便攜是其亮點。黃紀徽等[39]根據(jù)EHP SSU 18S rRNA 基因保守序列設(shè)計并合成了引物和探針,建立了在37℃下快速檢測EHP 的RAA 恒溫熒光檢測方法,不需要高溫循環(huán),檢測的最低限為10 個質(zhì)粒拷貝/μL,且不與其他蝦病病原交叉互反,靈敏度與特異性表現(xiàn)良好。

    4.3 原位雜交

    原位雜交(In situ hybridization,ISH)在EHP 研究中常為一種輔助手段,以進一步確認組織切片和PCR 檢測的結(jié)果。Tangprasittipap 等[6]研發(fā)了地高辛標記探針檢測EHP 的方法,在具有白便癥狀的對蝦肝胰腺常規(guī)組織病理檢測未顯示孢子的情況下,利用地高辛標記的探針檢測發(fā)現(xiàn)了大量EHP 孢子,表明該方法具有更好的靈敏度。Tang 等[7]應(yīng)用地高辛標記探針處理感染EHP 的南美白對蝦、細角濱對蝦和患有“棉花蝦病”的斑節(jié)對蝦的組織切片行。結(jié)果表明該探針不與引起棉花蝦病的微孢子蟲發(fā)生反應(yīng),也不與一些水生動物的基因組DNA 反應(yīng),特異性表現(xiàn)不俗。Biju 等[30]及Rajendran 等[11]以ENF 779F/ENF779R 為引物探針,檢測了PCR 陽性樣品的組織切片,該引物探針同樣表現(xiàn)出較好的靈敏度與特異性。Ahmed 等[41]利用原位雜交技術(shù)成功檢測出了以往難以發(fā)現(xiàn)和確診的金頭鯛(Sparus aurata)腸道粘孢子蟲(Enterospora nucleophila),結(jié)合卡爾科弗盧爾熒光增白劑(Calcofluor White Stain),清晰地顯示了腸道粘孢子蟲的發(fā)育階段與侵染組織,說明原位雜交技術(shù)良好的靈敏度與特異性能夠在組織層面直觀展示病原感染的位置與程度,也能揭示出病原侵染的具體路徑。截止目前,研究EHP 感染的組織分布主要都集中在對蝦肝胰腺,EHP 在對蝦體內(nèi)其他組織是否也有分布,或是否存在一個具體的感染路徑,相關(guān)研究還較為缺乏,甚至還未見有報道。

    5 防治措施

    EHP 具有幾丁質(zhì)的孢子壁,抗逆性較強,常規(guī)藥物很難穿透孢子壁殺滅孢子,截止目前未見有明確藥物可殺滅EHP 的報道。Tang 等[15]發(fā)現(xiàn)對控制微孢子蟲有一定作用的煙曲霉素無法消除或削弱EHP 感染。目前,主要從增強免疫調(diào)控、環(huán)境等角度來探索EHP 的防治措施。Palanikumar 等[42]利用從檸檬、大蒜、生姜、糖棕以及黑吉豆等植物中提取的物質(zhì)如維生素C、蒜素、生姜素、棕櫚糖及黑吉豆粉以輔助強化南美白對蝦的體質(zhì),增強其消化吸收、抗氧化、抗菌、抗炎癥能力,在一定程度上抵消EHP感染帶來的不利影響。徐勝威等[43,44]發(fā)現(xiàn),當氨氮濃度在9 mg/L 時,相較于空白對照組以及實驗組6 mg/L,對蝦增長率最高,小蝦比例明顯下降;亞硝酸鹽濃度在10 mg/L 時,相較于空白對照組以及實驗組20 mg/L,感染對蝦的生長率有所增加,EHP 攜帶量顯著降低,表明一定濃度的氨氮與亞硝酸鹽的脅迫,能抑制EHP 的感染,推測是EHP 孢子生長發(fā)育所需ATP 直接來源于對蝦肝胰腺組織細胞,氨氮與亞硝酸鹽的脅迫在一定程度上損傷對蝦肝胰腺,減少EHP 孢子生長發(fā)育所需ATP 的獲得量,一定程度上抑制了其感染與傳播。

    在養(yǎng)殖生產(chǎn)中,無論是添加植物提取物佐劑,還是采用環(huán)境脅迫的方式,雖然能產(chǎn)生一定的效果,但是仍然無法完全排除對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中EHP 感染的影響,治標不治本。鑒于目前尚無有效的治療藥物及手段,EHP 的防治措施重心將長期偏向防控,而病原檢疫則是防控的關(guān)鍵。檢疫能夠盡早發(fā)現(xiàn)EHP,最大限度減少EHP 感染造成的損失,檢測對象應(yīng)包括親蝦、蝦苗、飼料以及養(yǎng)殖環(huán)境。從整個產(chǎn)業(yè)鏈條來看,首先,從源頭進行把控,應(yīng)選擇無特定病原(Specific pathogen free,SPF)親蝦,防止EHP垂直傳染給苗種。其次,做好苗種檢疫,苗種檢疫以確保無EHP 攜帶防止水平傳播[13]。再者,切斷傳播途徑,對養(yǎng)殖環(huán)境消毒與檢測,包括養(yǎng)殖設(shè)施、養(yǎng)殖用具、養(yǎng)殖水等,以防止環(huán)境中EHP 孢子殘留造成的水平傳播。而后,還不能忽視餌料可能存在的問題。有報道指出,從養(yǎng)殖用的如鹵蟲、多毛類、軟體類等生物餌料中檢出EHP[7,13,15],因此使用前應(yīng)做好病原檢測,避免使用EHP 感染或污染的生物餌料。EHP 的孢子會隨蝦的糞便排出體外,進入水體并沉積到養(yǎng)殖池底質(zhì)中[15],需要有效清理、消毒和檢測養(yǎng)殖水、底質(zhì),養(yǎng)殖尾水同樣需要消毒后檢測以確保其安全無污染才可進行排放。本實驗室于2019年調(diào)查研究了江蘇主要養(yǎng)殖地區(qū)EHP 的發(fā)生,發(fā)現(xiàn)溫室養(yǎng)殖模式對EHP 傳播的限制作用強于傳統(tǒng)的土池養(yǎng)殖模式。溫室養(yǎng)殖單獨成棚的特性在一定程度上限制了EHP 的水平傳播,且能單獨配給水源,管理用水循環(huán),模塊化的養(yǎng)殖特點也避免了病原感染一損俱損的惡性局面[18]。

    EHP 的滅活長期以來一直是生產(chǎn)實踐中的難題,常規(guī)手段效果有限。Aldama-Cano 等[17]在研究理化因素對EHP 活力影響的過程中,發(fā)現(xiàn)EHP 孢子對極端低溫非常敏感,-20℃冷凍2 h 以上可完全抑制EHP 孢子的萌發(fā);使用40 mg/L 65%的活性氯、15 mg/L KMnO4以及20%的乙醇分別處理15 min 以上均可100%抑制EHP 的活性。上述條件在生產(chǎn)實踐中具有非常好的應(yīng)用前景,可以用來消毒具有化學(xué)惰性表面的養(yǎng)殖設(shè)施及用具。低溫冷凍則可以用于鮮活餌料的EHP 滅活,采用-20℃以下且持續(xù)24 h 以上的冷凍處理鮮活餌料可以滅活包括EHP在內(nèi)的大部分病原[17,45]。還可以將餌料冷凍后進行放射性射線照射殺滅病原,這更適用于大規(guī)模的現(xiàn)代化養(yǎng)殖[13]。最后,由于EHP 在感染對蝦前是否存在其他中間宿主目前仍不清楚,參考引起斑節(jié)對蝦“棉花蝦”病的對蝦八孢蟲(Agmaosma penaei)的應(yīng)對方式,應(yīng)避免對蝦與其他水生動物混養(yǎng),從根本上排除這個可能性[13]。

    6 展望

    目前EHP 生理結(jié)構(gòu)、組織病理、傳播機制以及檢測防控技術(shù)等已有一定的研究,但是,對EHP 生活史、詳細侵染機制等還未作詳細闡釋。后續(xù)的研究焦點應(yīng)主要集中在以下方面:(一)EHP 生活史,闡釋其發(fā)育生理學(xué)特點;(二)EHP 侵染的分子機制,探索其孢壁蛋白、極管蛋白與宿主細胞識別相關(guān)的作用機制;(三)EHP 與關(guān)鍵環(huán)境因子之間的互作關(guān)系,以期發(fā)現(xiàn)其重要作用因子,為EHP 的防治提供技術(shù)支撐。

    猜你喜歡
    生長檢測
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    碗蓮生長記
    小讀者(2021年2期)2021-03-29 05:03:48
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    共享出行不再“野蠻生長”
    生長在哪里的啟示
    華人時刊(2019年13期)2019-11-17 14:59:54
    野蠻生長
    NBA特刊(2018年21期)2018-11-24 02:48:04
    生長
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:14
    成年人免费黄色播放视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 黄色 视频免费看| 国产av一区二区精品久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 久9热在线精品视频| av一本久久久久| 香蕉久久夜色| 国产成人系列免费观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 免费在线观看亚洲国产| 欧美乱码精品一区二区三区| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 亚洲av成人av| 亚洲熟女精品中文字幕| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 老司机靠b影院| 国产精品免费一区二区三区在线 | 色综合婷婷激情| 999精品在线视频| 大香蕉久久网| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久午夜综合久久蜜桃| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品久久久人人做人人爽| 一夜夜www| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品中文字幕在线视频| 91精品三级在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 日韩欧美在线二视频 | 在线观看午夜福利视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 岛国在线观看网站| 在线观看免费视频网站a站| 免费观看人在逋| 两人在一起打扑克的视频| 91在线观看av| 国产精品久久久av美女十八| 黄色视频,在线免费观看| 三级毛片av免费| 国产激情欧美一区二区| 少妇粗大呻吟视频| 90打野战视频偷拍视频| 女人精品久久久久毛片| 韩国av一区二区三区四区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 91成年电影在线观看| 一进一出抽搐动态| 美国免费a级毛片| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人精品久久二区二区91| 婷婷丁香在线五月| 超碰成人久久| 久久狼人影院| 国产成人影院久久av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久国产精品影院| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一区二区三区精品91| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品久久久久久精品古装| 99精品欧美一区二区三区四区| 桃红色精品国产亚洲av| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日韩欧美国产一区二区入口| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲免费av在线视频| 国产精品永久免费网站| 国产亚洲av高清不卡| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产精品1区2区在线观看. | 午夜久久久在线观看| 欧美日韩av久久| 午夜福利欧美成人| 高清毛片免费观看视频网站 | 真人做人爱边吃奶动态| 国产野战对白在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲精品一二三| 中国美女看黄片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | a级毛片黄视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 99久久人妻综合| 视频区欧美日本亚洲| 日本wwww免费看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产淫语在线视频| 在线观看午夜福利视频| 一区二区三区国产精品乱码| 日本五十路高清| 日本a在线网址| 大片电影免费在线观看免费| 在线观看www视频免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产免费男女视频| 久久中文看片网| 久久九九热精品免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 男人舔女人的私密视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 丰满迷人的少妇在线观看| 999精品在线视频| 国产免费现黄频在线看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲男人天堂网一区| 麻豆国产av国片精品| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 中国美女看黄片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产高清视频在线播放一区| 午夜福利在线免费观看网站| 高清在线国产一区| 国产精品影院久久| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品电影一区二区三区 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲欧美激情在线| 国产成人精品在线电影| √禁漫天堂资源中文www| 麻豆乱淫一区二区| 丝袜美腿诱惑在线| svipshipincom国产片| 天堂俺去俺来也www色官网| 啦啦啦 在线观看视频| 国产成人免费观看mmmm| 欧美日韩精品网址| 国产一区二区激情短视频| 十分钟在线观看高清视频www| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 久久 成人 亚洲| 免费黄频网站在线观看国产| 久久性视频一级片| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 在线观看一区二区三区激情| 国产精华一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 免费少妇av软件| 在线观看午夜福利视频| 一级毛片精品| 午夜影院日韩av| 亚洲精华国产精华精| 欧美大码av| 精品电影一区二区在线| cao死你这个sao货| 看黄色毛片网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 中亚洲国语对白在线视频| 久久青草综合色| 免费看a级黄色片| 久久亚洲真实| 精品国产国语对白av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 成人手机av| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲美女黄片视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 韩国av一区二区三区四区| 久久亚洲精品不卡| av福利片在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩视频一区二区在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 91麻豆av在线| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 在线播放国产精品三级| 久久久久久人人人人人| av网站免费在线观看视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲精品自拍成人| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 操出白浆在线播放| 岛国在线观看网站| 露出奶头的视频| 国产激情久久老熟女| 欧美日韩黄片免| 免费高清在线观看日韩| 欧美久久黑人一区二区| 国产在线一区二区三区精| 母亲3免费完整高清在线观看| 午夜免费鲁丝| 午夜福利一区二区在线看| 在线观看日韩欧美| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲中文av在线| 成人三级做爰电影| www.自偷自拍.com| 十八禁人妻一区二区| 午夜日韩欧美国产| 午夜福利,免费看| e午夜精品久久久久久久| 久久国产精品影院| 精品免费久久久久久久清纯 | 免费高清在线观看日韩| 黄色怎么调成土黄色| 色在线成人网| 视频区图区小说| 一二三四在线观看免费中文在| 国产一区二区激情短视频| 国产成人啪精品午夜网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线看a的网站| 欧美最黄视频在线播放免费 | 91精品三级在线观看| 精品久久蜜臀av无| 丝瓜视频免费看黄片| 电影成人av| 国产成人av激情在线播放| tube8黄色片| 久久性视频一级片| 国产精品一区二区精品视频观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 午夜91福利影院| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜91福利影院| 日韩欧美三级三区| 国产成人啪精品午夜网站| 韩国精品一区二区三区| 一区在线观看完整版| 美女国产高潮福利片在线看| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 波多野结衣av一区二区av| 午夜精品在线福利| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 一级毛片女人18水好多| 热99久久久久精品小说推荐| 91麻豆av在线| 成人国产一区最新在线观看| tocl精华| 又紧又爽又黄一区二区| 人成视频在线观看免费观看| av电影中文网址| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 新久久久久国产一级毛片| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 香蕉丝袜av| 午夜免费鲁丝| 久久精品国产清高在天天线| 多毛熟女@视频| av线在线观看网站| 欧美成狂野欧美在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 99热只有精品国产| www.熟女人妻精品国产| 亚洲国产看品久久| 国产成人欧美在线观看 | 女人被狂操c到高潮| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 欧美激情久久久久久爽电影 | 在线免费观看的www视频| 大码成人一级视频| 精品亚洲成国产av| 午夜老司机福利片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 最新的欧美精品一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 女性生殖器流出的白浆| 久久影院123| 免费少妇av软件| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 少妇 在线观看| 成年人免费黄色播放视频| svipshipincom国产片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 满18在线观看网站| 中文字幕高清在线视频| 在线天堂中文资源库| 国产精品欧美亚洲77777| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产亚洲一区二区精品| 丝袜人妻中文字幕| 一级黄色大片毛片| 久久久久久久久久久久大奶| 曰老女人黄片| 在线看a的网站| 精品久久久精品久久久| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 中出人妻视频一区二区| 国产在线观看jvid| 在线av久久热| 国产日韩欧美亚洲二区| 性少妇av在线| 国产男靠女视频免费网站| 操出白浆在线播放| 精品电影一区二区在线| 18禁美女被吸乳视频| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲av成人av| 精品国产乱子伦一区二区三区| 两个人免费观看高清视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 91字幕亚洲| 国产色视频综合| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久99一区二区三区| 咕卡用的链子| 亚洲人成77777在线视频| 免费在线观看日本一区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品一区二区在线不卡| 国产不卡av网站在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产国语露脸激情在线看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 麻豆国产av国片精品| 一区二区三区激情视频| 国产精品成人在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 一级,二级,三级黄色视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 一夜夜www| 亚洲专区字幕在线| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美人与性动交α欧美软件| 99精国产麻豆久久婷婷| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利一区二区在线看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 男女午夜视频在线观看| 很黄的视频免费| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜视频精品福利| 99香蕉大伊视频| 妹子高潮喷水视频| 久久久精品免费免费高清| 99精品久久久久人妻精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美日韩成人在线一区二区| 激情视频va一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 制服诱惑二区| 精品电影一区二区在线| 精品久久久久久电影网| videos熟女内射| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲全国av大片| 女警被强在线播放| 乱人伦中国视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产男靠女视频免费网站| 免费不卡黄色视频| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲综合色网址| 亚洲第一av免费看| 午夜成年电影在线免费观看| 18禁国产床啪视频网站| xxx96com| 久久久水蜜桃国产精品网| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 丁香六月欧美| 精品国产美女av久久久久小说| 中文字幕最新亚洲高清| 一二三四社区在线视频社区8| 免费在线观看日本一区| 日韩三级视频一区二区三区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一夜夜www| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜激情av网站| a级毛片在线看网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美日韩视频精品一区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品在线观看二区| 欧美一级毛片孕妇| 国产av一区二区精品久久| 正在播放国产对白刺激| 亚洲av成人av| 午夜日韩欧美国产| 日本a在线网址| 曰老女人黄片| 国产成人影院久久av| 一区二区三区激情视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 搡老乐熟女国产| 99精品欧美一区二区三区四区| 免费在线观看日本一区| 天天添夜夜摸| 不卡av一区二区三区| 久久久久久久精品吃奶| 女同久久另类99精品国产91| 后天国语完整版免费观看| 国产精品1区2区在线观看. | 国产精品电影一区二区三区 | 岛国在线观看网站| 又大又爽又粗| 免费在线观看影片大全网站| 美女 人体艺术 gogo| 激情视频va一区二区三区| 青草久久国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| av网站在线播放免费| 久久久精品免费免费高清| 两个人看的免费小视频| 日韩三级视频一区二区三区| 一本综合久久免费| 电影成人av| 中文亚洲av片在线观看爽 | 日韩免费av在线播放| 美女 人体艺术 gogo| 99久久人妻综合| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 夫妻午夜视频| 黄片小视频在线播放| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | www.精华液| 亚洲精品一二三| 免费在线观看日本一区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美色视频一区免费| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 国产精品二区激情视频| 热re99久久国产66热| 一夜夜www| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲情色 制服丝袜| av有码第一页| 欧美国产精品va在线观看不卡| 电影成人av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 三级毛片av免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 捣出白浆h1v1| 久久精品国产综合久久久| 男女下面插进去视频免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 国产xxxxx性猛交| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品国产国语对白av| 免费人成视频x8x8入口观看| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久狼人影院| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久亚洲精品不卡| 亚洲精品av麻豆狂野| 性色av乱码一区二区三区2| 一二三四在线观看免费中文在| 久9热在线精品视频| 亚洲美女黄片视频| 欧美大码av| 90打野战视频偷拍视频| 水蜜桃什么品种好| 免费在线观看黄色视频的| 国产在线观看jvid| 91老司机精品| 国产av精品麻豆| 九色亚洲精品在线播放| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产淫语在线视频| 国产精品电影一区二区三区 | 日本黄色视频三级网站网址 | 色综合婷婷激情| 亚洲黑人精品在线| 国产精品综合久久久久久久免费 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 免费不卡黄色视频| 午夜免费观看网址| 91在线观看av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 久久精品亚洲av国产电影网| 男女午夜视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 天天添夜夜摸| 亚洲欧美激情在线| 亚洲免费av在线视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲av美国av| 欧美人与性动交α欧美软件| 两性夫妻黄色片| 精品人妻1区二区| 夫妻午夜视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲人成电影免费在线| 一区福利在线观看| 脱女人内裤的视频| 久久久久久久精品吃奶| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲av第一区精品v没综合| 少妇 在线观看| 国产成人av教育| 久久亚洲精品不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 自线自在国产av| 国产精品永久免费网站| 亚洲人成77777在线视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久久久精品吃奶| 18禁观看日本| 国产精品免费大片| 国产精品九九99| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 女警被强在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 一级毛片精品| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲少妇的诱惑av| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 动漫黄色视频在线观看| 91麻豆av在线| 亚洲中文av在线| 少妇 在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 超碰成人久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 啦啦啦免费观看视频1| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 91九色精品人成在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 久久国产乱子伦精品免费另类| 午夜免费鲁丝| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 丝瓜视频免费看黄片| 91大片在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 飞空精品影院首页| 国产精品欧美亚洲77777| 成在线人永久免费视频| 999久久久精品免费观看国产| 人妻久久中文字幕网| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 麻豆成人av在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 美女 人体艺术 gogo| 99热只有精品国产| 色老头精品视频在线观看| 午夜老司机福利片| 99热只有精品国产| 色老头精品视频在线观看| 国产麻豆69| 久久中文看片网| 老司机亚洲免费影院| av福利片在线| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品一区二区三卡| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲第一av免费看| 热re99久久国产66热| 91国产中文字幕| 国产精品香港三级国产av潘金莲| netflix在线观看网站| 国产av又大| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲专区字幕在线| 免费在线观看黄色视频的| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲片人在线观看|