千峽湖三種肉食性魚類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析

肖善勢，張愛菊，劉金殿，王俊，羅偉，郝雅賓，周志明

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所浙江研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001）

魚類腸道存在大量和種類繁多微生物，它們之間以及其與宿主之間相互依存、制約形成一個動態(tài)平衡的系統(tǒng)。魚類腸道微生物在腸道發(fā)育、營養(yǎng)消化、免疫防御和拮抗等起到重要作用[1-3]，與魚類健康息息相關(guān)，其群落結(jié)構(gòu)的變化可間接影響宿主健康[4,5]。研究表明：水生生物自孵化后，其腸道菌群隨著生長發(fā)育會出現(xiàn)一定的定植和演替過程，微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯[6,7]，即魚類腸道微生物組成并不是一成不變，受多種因素影響，是諸多因子共同作用的結(jié)果，如魚類餌料組成、季節(jié)、水環(huán)境、物種、基因型、發(fā)育階段、養(yǎng)殖模式及投喂策略等[1,8-10]。探究不同因子對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，調(diào)節(jié)諸多因子以利于宿主健康生長十分必要，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。然而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法以及基礎(chǔ)分子生物學(xué)方法如變性梯度凝膠電泳（DGGE）[11]和末端限制性片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP）[12]等，無法全面準(zhǔn)確展示腸道菌群結(jié)構(gòu)，而基于16S rRNA基因的新一代高通量測序研究方法具有靈敏度高和測序量大的特點，可檢測到低豐度微生物，極大地推動了腸道微生物的研究。如董學(xué)興等[13]采用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖模式通過影響?zhàn)B殖水體中氮磷營養(yǎng)鹽的含量來間接影響羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）腸道菌群結(jié)構(gòu)；李健柱等[14]采用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)魚菜共生模式下草魚（Ctenopharynogodon idellus）、鯽（Carassius auratus）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和鳙（Aristichthys nobilis）腸道內(nèi)含物微生物優(yōu)勢菌群的組成十分相似。目前已比較了不同食性魚類、草食性魚類之間、濾食性魚類之間的腸道微生物[8,14,15]，而對分類地位相近、生活環(huán)境相同的肉食性魚類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的研究卻鮮見。

本研究以鲌屬的翹嘴鲌（Culter alburnus）和達氏鲌（Culter dabryi）以及原鲌屬的紅鰭原鲌（Cultrichthys erythropterus）為研究對象，利用高通量測序技術(shù)獲得其腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，以期揭示肉食性魚類腸道微生物之間的異同，并進一步探究魚類食性和物種對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響以及翹嘴鲌等肉食性魚類的健康養(yǎng)殖提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 樣品采集及DNA 的獲取

2019 年8 月在麗水市千峽湖用刺網(wǎng)捕撈翹嘴鲌、達氏鲌和紅鰭原鲌，分別命名為LB_CA 組、LB_CD 組和LB_CE 組。挑選活力較好、無外傷，大小相近的三種魚各4 尾，其中翹嘴鲌平均體質(zhì)量57.6 g，達氏鲌平均體質(zhì)量53.4 g，紅鰭原鲌平均體質(zhì)量63.5 g。用75%的酒精消毒魚體后，解剖并取其腸道內(nèi)容物于滅菌5 mL 離心管中，置于-80℃保存。用E.Z.N.A.Stool DNA Kit（D4015,Omega,Inc.,USA）試劑盒提取腸道微生物總DNA。

1.2 PCR 擴增和測序

以提取的三種魚類的腸道微生物DNA 為模板，基于16S rRNA 基因V3～V4 可變區(qū)特異性引物（341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，805R：5′-GACTACHVGGGTATCTA ATCC-3′）擴增序列。PCR 體 系25 μL：Phusion Hot start flex 2X Master 12.5 μL，引物341F 及805R 各2.5 μL，DNA 模板50 ng，ddH2O 補至25 μL。PCR 條件：98℃預(yù)變性30 s，98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 個循環(huán)，72℃延伸10 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，并割膠回收。經(jīng)AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）純化后的擴增產(chǎn)物用Qubit（Invitrogen，USA）進行定量。文庫的大小和數(shù)量分別在Agilent2100 生物分析儀（Agilent，美 國）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美國）的文庫定量試劑盒上進行評估，在Illumina NovaSeq 平臺上進行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)樣品序列條碼，將配對端序列分配到每個樣品，去除建庫引入的條形碼和引物序列。在FLASH軟件下基于overlap 將雙端數(shù)據(jù)進行拼接。用fqtrim（v0.94）對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量過濾，以獲得高質(zhì)量的clean 標(biāo)簽，并使用Vsearch 軟件對嵌合序列進行過濾（v2.3.4）。最后利用DADA2 進行解調(diào)，得到特征表和特征序列。多樣性指數(shù)通過歸一化到相同的隨機序列來計算。用QIIME2 計算Alpha 多樣性（Chao1、observed species、goods coverage、Shannon 和Simpson）并分析樣本物種多樣性的復(fù)雜性。采用Blast 進行序列比對，每個代表性序列用SILVA 數(shù)據(jù)庫對特征序列進行注釋。用SPSS20.0 對樣本數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序質(zhì)量分析

對三種魚類的腸道微生物16S rRNA 基因測序數(shù)據(jù)進行雙端拼接、質(zhì)控以及嵌合體過濾后，共獲得有效序列943 949 條，單個樣品平均含有效序列78 662 條，序列長度在400～500 bp 之間（99.96%）。采用DADA2 算法修正擴增子的測序錯誤，經(jīng)過去除背景噪音獲得特征序列feature 1 094 個，其中翹嘴鲌（LB_CA）共計獲得feature 407 個，4 個樣品feature 數(shù)量分別為191、203、88 和157；達氏鲌和（LB_CD）feature 數(shù)量共計666 個，4 個樣品分別為259、155、403 和71 個；紅鰭原鲌（LB_CE）4 個樣品feature 數(shù)量分別為166、161、37 和162 個，合計392個。試驗基于Chao1 指數(shù)建立稀釋曲線（圖1），隨著測序量的不斷增加，各樣本曲線趨于平緩，表明數(shù)據(jù)量的增加只會產(chǎn)生少量新的物種，即測序量可涵蓋樣本絕大多數(shù)細(xì)菌群落的信息。另外三種魚類的測序的覆蓋度（goods coverage）均在0.995 以上，也表明測序基本涵蓋了樣品中的全部細(xì)菌種類。

圖1 三種魚類樣品稀釋曲線Fig.1 The rarefaction curve of high-through sequencing results in the three fish species

2.2 腸道微生物多樣性分析

feature 特征序列韋恩圖顯示（圖2），三種魚類的共有feature 為73 個，占feature 總數(shù)的6.67%。翹嘴鲌、達氏鲌和紅鰭原鲌獨有feature 特征序列數(shù)分別為207 個、441 個和148 個。翹嘴鲌與達氏鲌共有127 個feature 特征序列，占兩者總數(shù)的13.42%，占各自總數(shù)的31.20%和19.07%；翹嘴鲌和紅鰭原鲌共有146 個feature 特征序列，占兩者總數(shù)的22.36%，占各自總數(shù)的35.87%和37.25%；達氏鲌和紅鰭原鲌共有171 個feature 特征序列，占兩者總數(shù)的19.28%，占各自總數(shù)的25.68%和43.62%?？梢?，翹嘴鲌和紅鰭原鲌腸道菌群相似性較高。

圖2 三種魚類樣品feature 特征序列韋恩圖Fig.2 Venn analysis of three fish species with features

三種魚類腸道微生物α 多樣性指數(shù)（表1）顯示，達氏鲌observed species 以及Chao1 指數(shù)均高于其他兩種魚，表明其腸道微生物物種豐度較高；翹嘴鲌Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均高于其他兩種魚；方差分析顯示：三種魚之間α 多樣性指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），表明三種魚類腸道微生物的豐度和多樣性無顯著差異。

表1 腸道菌群Alpha 多樣性統(tǒng)計Tab.1 Alpha indices of intestinal bacteria community

2.3 腸道菌群組成分析

三種魚類樣品經(jīng)與SILVA 以及NT-16S 數(shù)據(jù)庫比對物種注釋后，發(fā)現(xiàn)腸道菌群分屬23 個門，其中1 個門未命名（圖3）。其中相對豐度較高（≥1%）的門類有變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋菌門（Spirochaetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍細(xì)菌門（Cyanobacteria）和浮霉菌門（Planctomycetes）。翹嘴鲌腸道菌群分為16 個菌門，以變形菌門（35.88%）、梭桿菌門（31.80%）、厚壁菌門（27.62%）和擬桿菌門（4.18%）為主，前三優(yōu)勢菌門占比高達95.30%。達氏鲌腸道菌群分屬20 個菌門，其中變形菌門（57.26%）和梭桿菌門（30.41%）相對豐度遠高于其他菌門，合計占比為87.67%；相對豐度超過1%的還有厚壁菌門（6.02%）、藍細(xì)菌門（2.93%）和浮霉菌門（1.20%）。紅鰭原鲌腸道菌群包含17 個菌門，其中變形菌門（62.98%）占絕對優(yōu)勢，其次為梭桿菌門（17.74%）、螺旋菌門（11.06%）和厚壁菌門（6.99%）。腸道菌群組成在門水平上的差異上主要表現(xiàn)為：翹嘴鲌厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度遠高于另外兩種魚；達氏鲌藍細(xì)菌門和浮霉菌門遠高于另外兩種魚；紅鰭原鲌螺旋菌門遠高于另外兩種魚；但方差分析顯示，三種間以上菌門相對豐度的差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 三種魚樣品中門水平下細(xì)菌相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial communities in the three fish species at phylum level

在屬水平上，三種魚類腸道細(xì)菌相對豐度如圖4 所示，相對豐度較高（≥2%）的12 個屬分別為鯨桿菌屬（Cetobacterium）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Romboutsia、Brevinema、嚴(yán)格梭菌屬（Clostridium_sensu_ stricto_1）、Epulopiscium、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、梭菌屬（Clostridium）、ZOR0006、Barnesiellaceae_unclassified。其中鯨桿菌屬、鄰單胞菌屬和氣單胞菌屬是三種魚類腸道共有優(yōu)勢菌群，鯨桿菌屬在翹嘴鲌和達氏鲌中的相對豐度為30.80%和30.41%，高于紅鰭原鲌的17.68%；鄰單胞菌屬在翹嘴鲌、達氏鲌和紅鰭原鲌的相對豐度分別為21.61%、9.70%和31.74%；紅鰭原鲌氣單胞菌屬相對豐度為23.50%，高于另外兩種魚（12.17%和10.72%）。除共有優(yōu)勢菌屬外，翹嘴鲌還有Romboutsia（8.33%）、梭菌屬（6.45%）、Epulopiscium（7.00%）、梭菌屬（2.63%）和Barnesiellaceae_unclassified（2.14%）等優(yōu)勢菌屬；翹嘴鲌優(yōu)勢菌屬還包含假單胞菌屬（24.42%）、短波單胞菌屬（4.07%）和ZOR0006（2.56%）；假單胞菌屬（4.60%）、Romboutsia（3.10%）、Brevinema（11.06%）、嚴(yán)格梭菌屬（2.06%）是紅鰭原鲌優(yōu)勢菌屬。翹嘴鲌假單胞菌屬的相對豐度僅為1.31%，而在達氏鲌的相對豐度在24.42%，差異較大。在相對豐度較高的12 個菌屬中，在翹嘴鲌中并未檢測到Brevinema。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)：翹嘴鲌和達氏鲌嚴(yán)格梭菌屬和梭菌屬相對豐度差異顯著（P＜0.05），其他菌屬在三種魚間差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 三種魚樣品屬水平下細(xì)菌相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities in the three fish species at genus level

在屬水平下，以三種魚類腸道微生物相對豐度最高的30 個物種分布來繪制聚類熱圖，并以顏色梯度及相似程度來反映其組成的相似性和差異性。翹嘴鲌（LB_CA）和紅鰭原鲌（LB_CE）首先聚為一支，二者腸道微生物群落組成較為相似，后與達氏鲌（LB_CD）聚為一大類，與其距離相對較遠。聚類分析顯示的結(jié)果與韋恩圖顯示:翹嘴鲌和紅鰭原鲌共有feature 特征序列數(shù)目較多的結(jié)果相一致（圖5）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，翹嘴鲌、達氏鲌和紅鰭原鲌腸道菌群共有feature 特征序列數(shù)為73 個，分別占翹嘴鲌、達氏鲌和紅鰭原鲌feature 總數(shù)的17.94%、10.96%和18.62%。在α 多樣性水平上，達氏鲌的observed_species 和Chao1 指數(shù)最高，即所含細(xì)菌物種豐度最大；翹嘴鲌的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)最高，即其菌群多樣性水平最高；但是，方差分析結(jié)果顯示:三者之間無顯著差異。王純等[15]對草魚（Ctenopharyngodon idellus）和團頭魴（Megalobrama amblycephala）的腸道菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，兩種魚類消化道微生物群落結(jié)構(gòu)差異不明顯，認(rèn)為食性相同的魚類有相似的腸道菌群結(jié)構(gòu)。而李秀玲等[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂磷蝦油和1∶1 磷蝦油—豆油的魚腸道微生物多樣性較高，且不同脂肪源對腸道微生物多樣性影響顯著，即餌料的變化對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有一定的影響。同一養(yǎng)殖系統(tǒng)中，投喂相同人工飼料的斑點叉尾（Ictalurus punctatus）與銀鯽（Carassius auratus gibelio）、異育銀鯽腸道微生物群落存在顯著差異（P＜0.05），即物種差異會引起腸道菌群的不同[17]。本研究中三種魚均為中上層兇猛肉食性魚類，幼魚階段主要以浮游動物、水生昆蟲等為食，成魚則主要以浮游動物、小型魚類和蝦等為食，食物組成基本一致[18-21]。斑點叉尾與銀鯽、異育銀鯽分類地位相距較遠，而本研究種三種魚類分類地位相近，因此認(rèn)為分類地位相近的肉食性魚類，在相同的發(fā)育階段和水環(huán)境下，其腸道菌群結(jié)構(gòu)相似。

姜敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)，洄游型刀鱭（Coilia nasus）的腸道微生物群落優(yōu)勢菌門為變形菌門、厚壁菌門和軟壁菌門。李倩等[23]發(fā)現(xiàn)，池塘內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖模式下太湖魴鲌腸道微生物優(yōu)勢菌門為梭桿菌門、變形菌門和厚壁菌門。李英英等[24]采用高通量測序的方法分析了生長速度不同的大黃魚（Pseudosciaena crocea）腸道菌群的差異性，結(jié)果顯示：大黃魚腸道優(yōu)勢菌群為變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門以及擬桿菌門。本研究中，千峽湖三種魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)共計獲得特征序列feature 1 094 個，分屬23 個門，與前人研究類似，其優(yōu)勢菌門為變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門和螺旋菌門。不同種魚類腸道優(yōu)勢菌門有所不同，但變形菌門、厚壁菌門和梭桿菌門更多的以優(yōu)勢菌門的身份出現(xiàn)。這可能與幾種菌門的特點以及某些種類的功能有關(guān)。比如變形菌門是細(xì)菌中最大的門類，種類繁多；厚壁菌門則具有重要的促宿主能量吸收作用[25,26]。

魚類食物的組成對腸道菌群結(jié)構(gòu)有顯著影響。如草食性魚類腸道中可降解纖維素的菌屬相對豐度較高[14]。淡水肉食性魚類腸道菌群中可產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶的菌屬豐度較高[1]。吳振聰?shù)妊芯堪l(fā)現(xiàn)，攝食含鮑內(nèi)臟多糖飼料的羅非魚（Oreochromis niloticus）腸道中鯨桿菌屬和鄰單胞菌屬豐度上調(diào)，不動桿菌屬（Acinetobacter）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、Alsobacter 和Aquicella 等致病菌屬豐度下調(diào)[27]。本研究結(jié)果顯示，三種魚優(yōu)勢菌屬主要為鯨桿菌屬、鄰單胞菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬和Brevinema。鯨桿菌屬不但可以產(chǎn)生豐富的維生素B12 和對宿主有利的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，還可以產(chǎn)生促進脂肪、蛋白質(zhì)等的代謝分解的醋酸，同時其對潛在致病菌也有一定的抑制作用[28,29]，與本研究中三種魚屬肉食性魚類相對應(yīng)。鄰單胞菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬均含有條件致病菌，但檢測的三種魚類樣本均為健康魚類，各菌屬在腸道微環(huán)境中的功能作用及其相互作用還有待進一步研究。弧菌屬（Vibrio）中多數(shù)都是致病菌，但研究發(fā)現(xiàn)，部分弧菌分泌的一些蛋白酶對宿主的發(fā)育可能起到一定作用[30]。本試驗結(jié)果顯示：翹嘴鲌和達氏鲌腸道菌群中嚴(yán)格梭菌屬和梭菌屬相對豐度差異顯著（P＜0.05）。聚類分析表明：翹嘴鲌和紅鰭原鲌腸道菌群組成更相近。Larsen 等[31]的研究表明，梭菌屬細(xì)菌能夠利用糖類以及發(fā)酵的碳水化合物等物質(zhì)，具有降解纖維素的功能，可為宿主提供能量。郝耀彤等[32]給草魚投喂人工飼料和蘇丹草改變了草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)。推測此種差異可能是達氏鲌食譜中各部分餌料所占比例與翹嘴鲌和紅鰭原鲌不同有關(guān)，即翹嘴鲌和紅鰭原鲌可能攝食了一定的植物性餌料。綜上所述，三種魚類同屬肉食性魚類，腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在門、屬水平上存在差異，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義，即其腸道菌群結(jié)構(gòu)相似。本研究結(jié)果可為研究魚類食性和物種對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響以及翹嘴鲌等肉食性魚類的健康養(yǎng)殖提供一定數(shù)據(jù)支撐。

結(jié)論

本研究借助高通量測序技術(shù)測定了千峽湖三種肉食性魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)，分析了同一生境下食性相似、發(fā)育階段相同、分類地位相近的魚類之間腸道微生物的差異性。發(fā)現(xiàn)三種魚類優(yōu)勢菌門為變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門和螺旋菌門；優(yōu)勢菌屬為鯨桿菌屬、鄰單胞菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬和Brevinema。三種魚類腸道菌群α 多樣性差異不顯著，推測分類地位相近的魚類，在相同的發(fā)育階段和水域環(huán)境下，其腸道菌群結(jié)相似。