多肽藥物合成和純化方法發(fā)展現(xiàn)狀

高云龍

（哈爾濱吉象隆生物技術有限公司 黑龍江 哈爾濱 150025）

多肽是有一定活性的由氨基酸縮合連接而成的化合物分子，肽類具有很多重要的生物活性，參與機體的多種生理活動，在人體中發(fā)揮抗菌、抗氧化、降血脂等作用，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領域均有廣泛作用。多肽藥物是指具有特定治療作用的多肽，應用于抗腫瘤、抗菌、疫苗、心血管、內(nèi)分泌等方面。與小分子藥物及蛋白質(zhì)藥物相比，多肽藥物具有較易合成、低毒性、原料易得、產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢明顯的獨特優(yōu)勢，目前已成為藥物開發(fā)的新趨勢，具有重要的經(jīng)濟價值和社會價值。多肽的合成和純化方法已然成為多肽藥物研究的重點，本文就目前多肽制備工藝進行簡要概述。

1.多肽合成方法

多肽合成發(fā)展迅速，目前多肽合成方法可分為化學合成方法和生物合成方法?；瘜W合成方法主要包括液相合成法和固相合成法，生物合成方法主要包括天然提取法、發(fā)酵法、酶解法、基因重組法。

1.1 化學合成方法

多肽化學合成法利用保護基團保護原料氨基酸中暫時不反應的基團，保證反應按照設計方向進行，通過氨基酸之間的縮合反應來實現(xiàn)氨基酸連接延長，以獲得特定序列的多肽。主要步驟包括保護、激活、縮合、去保護。液相合成法與固相合成法主要的區(qū)別源于是否使用固相載體。

1.1.1 液相合成法 液相合成法最早由Fischer 等創(chuàng)造出來，是第一個發(fā)展起來的肽合成法，包括逐步偶聯(lián)和片段縮合。從肽鏈的碳端（C 端）氨基酸向氮端（N端）偶聯(lián)氨基酸延長肽鏈即為逐步偶聯(lián)，而片段縮合是先合成完整肽鏈中的部分短的肽鏈，再將各個短的肽鏈進行縮合成目標肽鏈。液相合成法的優(yōu)點是保護基選擇多、成本低，可以合成10 個氨基酸以下純度較高的寡肽，缺點是每步進行耦合之后都需要純化中間體，只適合合成寡肽，而且C 端氨基酸在溶液中易消旋。

1.1.2 固相合成法 1963 年，Merrifield 首先建立了固相合成的方法，是將C 端第一個氨基酸的羧基與固相載體即不溶性載體樹脂相連，在縮合劑作用下與下一個被保護的氨基酸的羧基連接，重復操作，從肽鏈的C 端到N 端依次合成，直至多肽鏈完成，然后將多肽鏈從樹脂上裂解，再經(jīng)過分離純化得到目標產(chǎn)物。固相合成法又分為Boc 固相合成法（α-氨基用叔丁氧羰基保護）和Fmoc 固相合成法（α-氨基用9-芴甲氧羰基保護）。與液相合成法相比，該方法適用于生產(chǎn)各種長度的多肽尤其是中長肽，每步中間體無需純化，易于實現(xiàn)自動化處理，產(chǎn)品純度和收率較高，在目前已有的多肽合成方法中固相合成方法相對成熟且應用較多，多數(shù)多肽藥物是通過此方法制備。但是循環(huán)反應會產(chǎn)生大量的廢液，而且氨基酸需要過量會導致原料浪費。

1.2 生物合成法

生物合成法可分為天然提取法、微生物發(fā)酵法、酶解法、基因工程表達法等，概述如下。

1.2.1 天然提取法 天然提取法是根據(jù)多肽分子量、電學性質(zhì)等特性，通過物理、化學方法從生物組織中提取目標多肽的方法。天然提取法天然原料有限，分離過程影響因素多（包括天然原料的多肽種類和含量），經(jīng)濟價值不高，臨床中患者可能產(chǎn)生過敏，此外部分物理化學法可能會導致多肽降解或影響后續(xù)研究。

1.2.2 微生物發(fā)酵法 微生物發(fā)酵法是利用微生物在生產(chǎn)代謝過程中產(chǎn)生酶來水解底物蛋白制備多肽的方法。目前，用于制備具有生物活性多肽的菌種主要有曲霉菌、乳酸菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等。微生物發(fā)酵法制備的具有生物活性的多肽有高活性酪蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽（AEC 抑制肽）、抗氧化活性肽、抗菌肽、免疫活性肽等，其中AEC 抑制肽是臨床上常用的降血壓藥物。發(fā)酵法生產(chǎn)成本低、原料易得、適合工業(yè)化生產(chǎn)，但基礎研究較差，生產(chǎn)技術不完善，生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)利用率低，造成資源浪費和環(huán)境污染。該方法可以直接生產(chǎn)的多肽藥物仍然較少，目前多應用于食品、化妝品、飼料等行業(yè)。

1.2.3 酶解法 酶解法是利用蛋白酶水解蛋白質(zhì)得到目標多肽的方法，需要選擇特定蛋白酶。酶解法具有反應特異性高、反應環(huán)境溫和等優(yōu)點，不足之處在于得到的多肽分離純化難度大、產(chǎn)量低、耗費底物、質(zhì)量控制難度較大。于麗娜采用Alcalase AF 2.4 L 堿性蛋白酶酶解提取鹿茸蛋白多肽，最佳工藝為：在溫度55 ℃，pH7.5 條件下，以底物濃度為2%（m/v），加入8%（v/m）的酶反應2 h，多肽含量為36.28%。利用酶解法進行蛋白質(zhì)深加工提供了一個可能的提高蛋白質(zhì)利用率的思路，這種方法是否能夠產(chǎn)業(yè)化則需要進一步提高產(chǎn)率。

1.2.4 基因工程表達法 隨著基因工程技術的發(fā)展，實現(xiàn)了將基因片段轉(zhuǎn)移到原核或真核細胞內(nèi)容易被中進行基因表達的技術，并利用這種技術生產(chǎn)目標多肽。由于短肽在微生物酶降解，所以基因工程表達法適用于長煉肽的制備。該方法表達定向性強、成本低，但是基因表達研發(fā)困難、研發(fā)周期長、產(chǎn)率低、分離純化難度大。溫敏類彈性蛋白多肽是新型的藥物載體，在腫瘤治療中擁有廣闊的應用前景，任艷艷等根據(jù)大腸桿菌密碼子的簡并性和偏好性，將高度連續(xù)重復氨基酸的多種遺傳密碼引入基因序列中，利用依次插入單體基因和遞歸定向連接技術，構(gòu)建了以纈氨酸為客座氨基酸的ELPs基因的表達質(zhì)粒庫，即pET28-ELP-V～pET28-ELP-V。將pET28-V轉(zhuǎn)化至表達宿主Escherichia coli BL21（DE3）中，經(jīng)重組菌的培養(yǎng)和IPTG 誘導，結(jié)果顯示ELP-V50 在大腸桿菌中成功獲得了可溶性表達，與預期分子量大小一致。

2.多肽分離純化方法

通過各種合成方法合成的多肽并非單一物質(zhì)，而是目標多肽和極性相近多肽的混合物，為了得到目標多肽，需要進行分離純化。根據(jù)多肽極性、所帶電荷、分子量、大小、性狀等選擇不同的純化方法。目前有多種多肽分離純化方法，本文只簡述常用的反相高效液相色譜法、離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法、電泳法、親和層析法、超濾法以及電滲析法。

2.1 反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜法由極性流動相與非極性固定相組成，利用多肽分子的極性差異以及極性較弱的多肽分子與非極性固定相的結(jié)合進行梯度洗脫分離。該方法分離效果好、靈敏度高、易于實現(xiàn)自動化，且有些填料可以重復利用，雖然生產(chǎn)成本較高，但這并不影響反相高效液相色譜法成為工業(yè)生產(chǎn)中多肽分離純化的首選方法。蔣雨晴等以卵白蛋白為原料，采用超濾法、凝膠色譜法、反相高效液相色譜法制備具有抑菌活性的蛋白肽，分離得到9 個組分抑菌活性，發(fā)現(xiàn)C3 組分的抑菌活性最高。付玉清等采用Fmoc 固相合成法，以Wang 樹脂為載體，并且以HOBt/DIC 為縮合劑，逐步縮合獲得利那洛肽線性肽樹脂后，采用固相-裂解-液相結(jié)合的方式完成環(huán)化獲得粗品。粗品經(jīng)反相高效液相色譜法純化后得到目標產(chǎn)物即精肽純度高達99.32%。此種方法可以大規(guī)模制備利那洛肽，為工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

2.2 離子交換色譜法

離子交換色譜法是多肽陽離子或陰離子和固定相通過靜電作用結(jié)合，然后以不同pH 值或不同離子強度的洗脫液洗脫，通過所帶電荷差異對多肽進行分離。根據(jù)離子交換柱的不同，可分為陽離子交換色譜和陰離子交換色譜。離子交換色譜法進樣量大、耐酸堿、分辨率高、操作簡便，但是耗材貴、速度慢，并且需要選取合適的離子交換柱和洗脫條件。舒一梅以豬股骨酶解的酶解液為原料分離純化豬股骨降血壓肽，酶解液經(jīng)超濾、凝膠層析初步分離后，采用離子交換層析對凝膠層析分離后的高活性組分進一步分離，從而得到純度更高的降血壓肽。通過對洗脫液離子強度、pH 值、流速三個因素進行研究，確定了最佳分離條件。結(jié)果顯示離子交換層析分離得3 個組分中組分1 的活性最高，其IC50 值為0.1 012 mg/mL。

2.3 凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠對不同大小和形狀的多肽分子進行分離。凝膠具有分子篩作用，因粒徑不同、移動路線、洗脫時間不同而分離。凝膠色譜法分離條件溫和（產(chǎn)物不容易變性）、分離效果好，但是一般需要結(jié)合其他分離法才會得到較高純度的多肽。Yu 等采用凝膠過濾層析、超濾、反相高效液相色譜等方法從螺旋藻酶解物中分離抗氧化肽。

2.4 電泳法

電泳法是多肽在電場作用下，根據(jù)分子量和所帶電荷不同而被分離的方法。應用于多肽分離的電泳法有雙向電泳法、聚丙烯酰胺電泳法、凝膠電泳法等，尤其是毛細管電泳法在多肽分離純化方法得到了廣泛應用。電泳法選擇性強、分離效果好、分離速度快，但也可能使多肽喪失有效活性。張崟等對骨素蛋白酶解液采用N-三（羥甲基）甲基甘氨酸凝膠電泳法分離，能有效分離骨素酶解液中的肽。

2.5 親和層析法

親和層析法是一種利用固定相與多肽特異性結(jié)合（這種結(jié)合是可逆的）而純化目的肽的方法。該方法優(yōu)點在于分辨率高、特異性強、填料可重復使用，針對活性不穩(wěn)定的多肽分離效果好，但是其適用范圍小，主要用于抗體及糖蛋白的純化。劉琳利用纖維連接蛋白與膠原蛋白具有親和作用的原理，用乙醇沉淀明膠獲得大分子蛋白，胰蛋白酶酶解后的產(chǎn)物經(jīng)纖維連接蛋白親和層析分離，獲得了部分可與纖維連接蛋白特異性結(jié)合的明膠多肽。

2.6 超濾法

超濾法是通過膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對分子量在1 ～500之間的多肽進行選擇性分離，主要是利用膜兩端的壓差截留多肽。超濾法操作簡單、節(jié)約資源、不破壞多肽活性，但該方法只適用于初步分離，不適用于分離某種特定多肽。

2.7 電滲析法

電滲析在超濾的基礎上改變分離多肽驅(qū)動力，引用陰陽離子膜，根據(jù)電荷和分子大小兩種性質(zhì)分離多肽，但在過程中有部分多肽富集到電極上，對儀器造成損害，雖然有研究通過增加超濾膜減緩這種損害，但是并不能徹底解決問題。利用電滲析分離堿性蛋白酶酶解后的菜籽蛋白分離物時，電滲析過程以KCl 為電極緩沖液，可將陰離子多肽和陽離子多肽進行分離。

3.結(jié)語

多肽種類繁多，理化性質(zhì)各不相同，應根據(jù)實際情況選擇不同的合成和分離純化方法，學者們通常會采用多種分離純化的方法提高目標肽純度。隨著多肽藥物的研究和發(fā)展，人們對多肽的需求不斷增加，在促使多肽行業(yè)規(guī)模不斷增長的同時，對多肽藥物制備工藝的要求也越來越高，這就意味著需要更多學者投入到多肽制備工藝的研究中來，并在前人研究基礎上進行創(chuàng)新和升級，克服多肽制備工藝的各種不足，進一步滿足人們的需求，相信在領域內(nèi)的科研人員的共同努力下，能夠有更多的多肽藥物獲批上市。