基于分子對(duì)接法預(yù)測(cè)紅藤Sargentol及類似物紫丁香苷抗炎靶點(diǎn)的研究

耿春葉，曹裕旻，王 培，王雪茹，劉 東，湯 建*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230013；2.亳州學(xué)院 中藥學(xué)院，安徽 亳州 236800）

紅藤（Sargentodoxa cuneata）是中醫(yī)臨床常用的一味中藥材，具有清熱解毒、活血、祛風(fēng)止痛等功效［1］。紅藤提取物具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，特別是對(duì)炎癥疾病具有很好的治療效果，其化學(xué)成分主要有酚酸類、苯丙素、木脂素等［2-4］。本課題組在前期研究中，從野生紅藤的地上部分中分離得到苯丙醇苷類化合物Sargentol，該化合物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹具有良好的抑制作用［5］。進(jìn)一步在單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）模型中發(fā)現(xiàn)，3 μmol/L 的Sargentol 和結(jié)構(gòu)類似物紫丁香苷（Syringin）均能有效抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的一氧化氮（NO）釋放，抑制率達(dá)40.5%和37.8%［6］，且后者（11 mg/kg）對(duì)大鼠足腫脹以及足中前列腺素E2（PGE2）、NO 均有顯著抑制作用（P＜0.05）［7］。Sargentol 及紫丁香苷均表現(xiàn)出較好的抗炎應(yīng)用前景，但目前尚未對(duì)二者的抗炎相關(guān)機(jī)制及作用靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究。

分子對(duì)接（Molecular docking）是利用計(jì)算機(jī)軟件模擬小分子配體與大分子受體之間活性位點(diǎn)的最佳結(jié)合模式的技術(shù)，在藥物篩選和靶點(diǎn)確定等方面有著廣泛的應(yīng)用。分子對(duì)接中發(fā)現(xiàn)化合物肉桂硫胺（Cinanserin）對(duì)SARS病毒主要蛋白酶（Mpro）結(jié)合能極強(qiáng)，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該化合物確實(shí)可以強(qiáng)烈抑制病毒復(fù)制［8］。近年來，分子對(duì)接在中藥活性成分篩選、解析其作用機(jī)制方面的研究逐漸增多［9-10］。本研究擬利用AutoDockVina 軟件［11］進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)對(duì)接能量高低，預(yù)測(cè)Sargentol和紫丁香苷潛在的作用靶點(diǎn)，為深入研究其作用機(jī)制提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究采用ChemOffice Professional 軟件（美國PerkinElmer公司），AutoDock Tools 1.5.6和AutoDock Vina（美國The Scripps Research Institute），PyMOL（TM）1.7.4.5 Edu（美國Schrodinger，LLC 公司）和Discovery Studio 2016 client（美國BIOVIA 公司）等軟件。

1.2 Sargentol和紫丁香苷結(jié)構(gòu)的處理

繪制Sargentol和紫丁香苷的結(jié)構(gòu)，參照文獻(xiàn)［10］，MM2 能量最小化后經(jīng)AutoDock Tools1.5.6 進(jìn)一步處理，扭度（Torsion）設(shè)為默認(rèn)值，最終保存為pdbqt 文件，以備AutoDockVina進(jìn)行分子對(duì)接。

圖1 Sargentol（1）和紫丁香苷（2）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of sargentol（1）and syringin（2）

1.3 靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的獲取和預(yù)處理

檢 索 中 藥 抗 炎 相 關(guān) 文 獻(xiàn)［9，12-14］和 蛋 白 數(shù) 據(jù) 庫（PDB，http：//www.rcsb.org），選取26個(gè)與炎癥密切相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白（表1）。將26 個(gè)靶點(diǎn)蛋白pdb 文件依次導(dǎo)入PyMOL軟件中，刪除原配體、水分子、有機(jī)物、無機(jī)物等，在AutoDock Tools1.5.6 軟件中加氫，保存為pdbqt格式，以備AutoDockVina進(jìn)行分子對(duì)接。

1.4 參數(shù)設(shè)置和分子對(duì)接

通常認(rèn)為均方根偏差（RMSD）在2 ? 范圍內(nèi)。分子對(duì)接的晶格中心設(shè)置見（表2），對(duì)接空間（Grid Box）：40nm×40nm×40nm，能量范圍為4，利用Vina軟件進(jìn)行半柔性對(duì)接，得到Sargentol及紫丁香苷（配體）與26個(gè)靶點(diǎn)蛋白（受體）對(duì)接后的結(jié)合能打分值（kcal/mol）。蛋白晶體復(fù)合物中的原配體對(duì)接值為閾值。一般認(rèn)為與藥物有較高結(jié)合能，且超過或接近閾值的蛋白，可初步確定為潛在的作用靶點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子對(duì)接的結(jié)果

Sargentol、紫丁香苷以及原配體分別與26 個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行對(duì)接，具體結(jié)果見表2。Sargentol分別與4NF5、6EQ9、2Y37、5D3I 和2R59 等蛋白結(jié)合力較強(qiáng)，紫丁香苷分別與6EQ9、2Y37、2R59、3KGC 和3ELJ 等蛋白有結(jié)合較強(qiáng)的結(jié)合力，這些蛋白可能與Sargentol 和紫丁香苷抗炎作用具有密切關(guān)系。Sargentol及紫丁香苷均與c-Jun氨基末端激酶-3（JNK-3，PDB ID：6EQ9）表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能，分別為-7.9和-8.3 kcal/mol，提示JNK-3可能是Sargentol和紫丁香苷抗炎的重要靶點(diǎn)。二者對(duì)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS，PDB ID：2Y37）亦有較強(qiáng)的結(jié)合能，分別為-7.7 和-7.6 kcal/mol。Sargentol 對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸受體-2A（NR2A，PDB ID：4NF5）具有-8.2 kcal/mol的結(jié)合能，遠(yuǎn)超其閾值-6.0 kcal/mol，提示該化合物還可能通過調(diào)節(jié)NR2A 等谷氨酸受體發(fā)揮抗炎作用。

表2 Sargentol及紫丁香苷與受體蛋白的結(jié)合能Tab.2 Affinity of sargentol and syringin docking with receptors

在26 個(gè)靶點(diǎn)蛋白中，Sargentol 表現(xiàn)出更強(qiáng)結(jié)合能力的有14 個(gè)，紫丁香苷表現(xiàn)出更強(qiáng)結(jié)合力的有9個(gè)，二者相同的有3 個(gè)，這表明二者結(jié)構(gòu)中的差異（前者為含氧三元環(huán)，后者為碳碳雙鍵）對(duì)結(jié)合能力有明顯的影響。

Sargentol 對(duì)4NF5（NR2A）具有較強(qiáng)的結(jié)合能，且超過其閾值，分子對(duì)接平面圖（圖2）中可見其與4NF5蛋白中的SER114等氨基酸殘基之間存在范德華力；苯丙素片段5-OCH3的氧與ARG121 之間、三元環(huán)上的氧與THR116之間、9-OH的氧與GLU16之間分別形成氫鍵，3-OCH3的氧及糖的4＇-OH的氧與LYS87 之間、2＇-OH 的氧及3＇-OH 的氧與GLY89 之間、3＇-OH 的氫與ASN97 之間分別形成氫鍵；苯環(huán)與HIS88 之間存在Pi-Pi 作用；4＇-OH 的氧與GLY86之間、半縮醛的氧與LYS90 之間存在一種弱的氫鍵。

圖2 Sargentol與4NF5蛋白分子對(duì)接平面圖Fig.2 2D diagram of sargentol docking with protein 4NF5

Sargentol 對(duì)6EQ9（JNK-3）表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能，與閾值（-7.9 kcal/mol）相同，分子對(duì)接平面圖（圖3）中可見其與6EQ9蛋白中的ILE124等氨基酸基之間存在范德華力；苯丙素片段3-OCH3的氧與LYS93之間、9-OH 的氧與MET149 之間、糖的2＇-OH 的氫與ASP207 之間、3＇-OH 的氫與SER193 之間分別形成氫鍵；苯環(huán)與LEU206、VAL78 之間存在Pi-sigma作用，與MET146 之間存在Pi-sulfar 作用，與LYS93之間 存在Pi-alkyl 作用；3-OCH3的 碳與LEU206、GLU111 之 間、9 位 碳 與MET149 之 間、5＇位 碳 與SER193之間存在一種弱的氫鍵；另外2＇-OH的氫與GLY75 之間存在斥力。氫鍵及苯環(huán)的疏水性結(jié)合對(duì)Sargentol與6EQ9的結(jié)合具有關(guān)鍵作用。

圖3 Sargentol與6EQ9蛋白分子對(duì)接平面圖Fig.3 2D diagram of sargentol docking with protein 6EQ9

紫丁香苷對(duì)6EQ9 具有較強(qiáng)的結(jié)合能，超過其閾值，分子對(duì)接平面圖（圖4）中可見其與6EQ9 蛋白中的ILE70 等氨基酸基之間存在范德華力；苯丙素片段9-OH 的氧與MET149 之間、3-OCH3的氧及糖的3＇-OH 的氧與LYS93 之間、2＇-OH 的氫與SER193之間、6＇-OH 與GLY76 之間分別形成氫鍵；苯環(huán)與LEU206、VAL78 之間存在Pi-sigma 作用，與MET146之間存在Pi-sulfar 作用；8 位碳與GLU147 之間存在一種弱的氫鍵；另外6＇-OH 的氫與GLY73 之間存在斥力。氫鍵及苯環(huán)的疏水性結(jié)合對(duì)紫丁香苷與6EQ9的結(jié)合具有關(guān)鍵作用。

圖4 紫丁香苷與6EQ9蛋白分子對(duì)接平面圖Fig.4 2D diagram of syringin docking with protein 6EQ9

Sargentol 與2Y37（iNOS）的結(jié)合能力較強(qiáng)，分子對(duì)接平面圖（圖5）中可見與2Y37 蛋白中的ILE238等氨基酸殘基之間存在范德華力；三元環(huán)上的氧與ASN364 之間、糖的2＇-OH 的氫與TRP366 之間、3＇-OH 的氧與MET368 之間分別形成氫鍵；苯環(huán)與TRP188形成Pi-Pi相互作用，與CYS194間還存在一種弱的氫鍵。

圖5 Sargentol與2Y37蛋白分子對(duì)接平面圖Fig.5 2D diagram of sargentol docking with protein 2Y37

紫丁香苷與2Y37 的結(jié)合能力也較強(qiáng)，與2Y37中ILE238等氨基酸殘基之間存在范德華力；苯環(huán)與ASN364、CYS194 之間分別存在Amide-Pi 和Pi-sulfur 作用；5-OCH3的氧 與GLY196 形成一 種弱的 氫鍵（圖6）。

圖6 紫丁香苷與2Y37蛋白分子對(duì)接平面圖Fig.6 2D diagram of syringin docking with protein 2Y37

3 討論

本次對(duì)接結(jié)果顯示Sargentol 和紫丁香苷均對(duì)iNOS 有較強(qiáng)的結(jié)合能，這與二者前期的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Sargentol 和紫丁香苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中NO 的釋放具有明顯的抑制作用，后者還能顯著抑制角叉菜致大鼠組腫脹模型中PGE2和NO釋放［6-7］。JNK-3是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一，在機(jī)體的炎性反應(yīng)過程中起到重要作用，抑制JNK-3 是藥物抗炎的重要機(jī)制［15］，Sargentol 和紫丁香苷對(duì)JNK-3 均有較強(qiáng)的結(jié)合能力，這說明JNK-3 可能是抗炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)，這一點(diǎn)尚未有相關(guān)的藥理實(shí)驗(yàn)報(bào)道。

N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）的過度興奮會(huì)導(dǎo)致Ca2+超載和一氧化氮合酶（NOS）活性增加、NO 釋放增加，從而引起神經(jīng)損傷，而抑制NMDA 可以有效降低神經(jīng)炎癥水平［16-17］。Sargentol 與NR2A（PDB ID：4NF5）表現(xiàn)較高的結(jié)合能（-8.2 kcal/mol），這意味著Sargentol還可能具有基于NMDA的神經(jīng)保護(hù)潛力。但該化合物與NR1（PDB ID：4NF4）、NR2B（PDB ID：3QEL）、mGluR1（PDB ID：3KS9）、AMPM（PDB ID：3KGC）之間的結(jié)合能較弱，分別為-7.2、-5.5、-6.9、-6.4 kcal/mol。

后續(xù)的研究中將會(huì)采用細(xì)胞和動(dòng)物模型進(jìn)行Sargentol與紫丁香苷基于JNK-3等靶點(diǎn)蛋白的抗炎活性和相關(guān)的機(jī)制，將采用雙向電泳（2D-PAGE）技術(shù)等方法進(jìn)一步確證Sargentol與紫丁香苷炎癥的靶點(diǎn)蛋白［18］，同時(shí)驗(yàn)證分子對(duì)接技術(shù)在靶點(diǎn)確定過程中的可行性。