大蔥小孢子發(fā)育時(shí)期細(xì)胞學(xué)與形態(tài)特征觀(guān)察

賈俊香，李娜，楊國(guó)棟，田云，蔣欣陶，崔連偉

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧沈陽(yáng) 110161）

大蔥（Allium fistulosum L）為蔥屬植物（染色體數(shù)2n=2x=16），是重要的蔬菜作物[1]。大蔥新品種選育仍以常規(guī)育種為主，對(duì)于二年生的蔬菜作物大蔥而言，常規(guī)育種所花費(fèi)的時(shí)間更長(zhǎng)，要想獲得純合的自交系通常需要6~8年，甚至更長(zhǎng)時(shí)間，費(fèi)工費(fèi)時(shí)。大蔥屬于常異花授粉植物，花由花梗、花被、子房、花柱、雄蕊、雌蕊組成，傘形花序藏于總苞。但不是所有時(shí)期的小孢子都能用于培養(yǎng)，選擇適宜時(shí)期的花蕾是小孢子培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。單倍體育種技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)獲得純合的自交系，提高選育效率，縮短育種年限。前人在番茄[2]、辣椒[3]、黃瓜[4]、西葫蘆[5]、大白菜[6]、青花菜[7]、蘿卜[8]、甘藍(lán)[9-10]等多種植物上的研究表明，利用單核靠邊期的小孢子較易誘導(dǎo)出胚狀體，且僅需通過(guò)花蕾的外部形態(tài)即可判斷出花粉的發(fā)育時(shí)期。劉寧等[11]和胡雪華[12]均開(kāi)展了大蔥花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂觀(guān)察，但有關(guān)大蔥花蕾外部形態(tài)與小孢子發(fā)育時(shí)期中單核靠邊期的詳細(xì)研究較少。該研究對(duì)3個(gè)不同基因型大蔥品種花蕾各發(fā)育時(shí)期及其與花器官外部形態(tài)的相關(guān)性進(jìn)行研究，旨在通過(guò)花器官的形態(tài)特征來(lái)確定小孢子發(fā)育時(shí)期，從而為進(jìn)一步開(kāi)展大蔥游離小孢子培養(yǎng)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)地概況。選擇在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所試驗(yàn)基地溫室中進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 供試材料。3個(gè)不同基因型的大蔥材料，分別為喬香3號(hào)、遼蔥11號(hào)和Ln yc16。喬香3號(hào)為獨(dú)棵香蔥品種，株高90 cm，白長(zhǎng)40 cm，葉片顏色深綠，抽薹開(kāi)花晚；遼蔥11號(hào)為雜交種，株高115 cm，白長(zhǎng)55 cm，葉片顏色為綠色，抽薹開(kāi)花早；而Ln yc16為自交系材料，株高110 cm，白長(zhǎng)50 cm，葉片顏色深綠，抽薹開(kāi)花晚。2020年12月15日，將秋季露地收獲的種株栽于試驗(yàn)地，正常田間管理至大蔥植株抽薹開(kāi)花開(kāi)始采樣。

1.2 方法

1.2.1 花蕾的形態(tài)觀(guān)察與測(cè)量。大蔥現(xiàn)蕾后，在每天8：00—10：00采摘健壯植株上不同大小的花序放入自封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。用游標(biāo)卡尺測(cè)量花蕾的縱徑、橫徑，并記錄花蕾顏色。然后用鑷子剝?nèi)セū?，取出花藥，測(cè)量花藥的縱徑和橫徑，并記錄花藥顏色。每一時(shí)期取花蕾3個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.2 花藥的細(xì)胞學(xué)觀(guān)察。將各個(gè)材料的花蕾按不同大小分類(lèi)后用卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3 V∶1 V）于室溫下固定24 h后，取小花，在鹽酸∶乙醇＝1 V∶1 V中，60℃恒溫下解離8~10 mi n，然后用超純水沖洗3~5遍，用鑷子和解剖針小心去除花梗、花被及子房等較大的組織殘?jiān)瑢⒒ㄋ幏旁谳d玻片上，用改良石碳酸復(fù)紅染液方法染色，染色1~2 h后，蓋上載玻片在L EICA-DM4B顯微鏡40×10下觀(guān)察。

每份材料根據(jù)不同大小隨機(jī)取10個(gè)花蕾，3次重復(fù)，每個(gè)花蕾取1個(gè)花藥，通過(guò)視野中小孢子主要發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞個(gè)數(shù)來(lái)確定小孢子所處的發(fā)育時(shí)期，并拍攝照片。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)采用S P SS 16.0軟件中D u n c a n方法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蔥花蕾各發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)觀(guān)察

對(duì)基因型不同的大蔥花蕾發(fā)育過(guò)程進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀(guān)察（圖1）。大蔥花粉母細(xì)胞進(jìn)入分裂之前，在花藥壓片中可見(jiàn)較多的分裂間期細(xì)胞（圖1-1），此時(shí)兩大核仁模糊可見(jiàn)，染色體散于核內(nèi)，呈顆粒狀。

2.1.1 四分體時(shí)期。當(dāng)大蔥花粉母細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)絲狀染色體時(shí)，即為減數(shù)分裂開(kāi)始，分為2個(gè)時(shí)期。第1次減數(shù)分裂變化復(fù)雜，前期Ⅰ可清楚地看到細(xì)線(xiàn)期（圖1-2）、偶線(xiàn)期（圖1-3）、粗線(xiàn)期（圖1-4）、雙線(xiàn)期（圖1-5）和終變期（圖1-6），中期Ⅰ時(shí)核膜、核仁消失，染色體變得粗短，排列在赤道板上（圖1-7）。后期Ⅰ同源染色體分散開(kāi)并逐漸向兩極移動(dòng)（圖1-8，圖1-9和圖1-10），移向兩極時(shí)染色體數(shù)目減半，直接從2n變?yōu)閚，n=8。末期Ⅰ核膜、核仁又重新出現(xiàn)，形成2個(gè)新的核，2個(gè)子核之間出現(xiàn)了1個(gè)細(xì)胞板（圖1-11）。減數(shù)分裂Ⅰ期結(jié)束后直接進(jìn)入第2次減數(shù)分裂前期Ⅱ，此時(shí)分隔壁形成，出現(xiàn)二分體時(shí)期（圖1-12），染色體相互盤(pán)繞于核內(nèi)。中期Ⅱ2子核內(nèi)的核膜、核仁消失，染色體變短，分別排列在各自赤道板上。后期Ⅱ2子核內(nèi)的染色單體離開(kāi)赤道板移向兩極。末期Ⅱ到達(dá)兩極后開(kāi)始聚縮，形成4個(gè)子核（圖1-13、圖1-14和圖1-15），各子核之間被胼胝質(zhì)壁分隔。

2.1.2 小孢子的形成。胼胝質(zhì)不斷解體，四分孢子體逐漸彼此分開(kāi)，小孢子被釋放出來(lái)，形成各自的細(xì)胞壁，小孢子處于單核早期時(shí)，內(nèi)有較厚的細(xì)胞質(zhì)和1個(gè)位于中央的細(xì)胞核（圖1-16、圖1-17）。此后，液泡逐漸形成，細(xì)胞核被擠壓靠近細(xì)胞壁，又稱(chēng)為單核靠邊期。隨著花蕾中小孢子的發(fā)育，經(jīng)過(guò)一次有絲分裂之后形成生殖核和營(yíng)養(yǎng)核各1個(gè)。生殖核距離細(xì)胞壁近，營(yíng)養(yǎng)核距離液泡近，此時(shí)為雙核期（圖1-18）。其體積不斷增大，形狀由球形發(fā)展為橄欖型，這時(shí)花粉粒膨大，花粉壁也開(kāi)始增厚，萌發(fā)溝部分明顯向外凸出，逐漸成長(zhǎng)為成熟的花粉粒（圖1-19、圖1-20）。

圖1 大蔥小孢子各發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)特征

2.2 大蔥小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾形態(tài)特征的相關(guān)性

從表1可以看出，在不同的發(fā)育時(shí)期，3份試驗(yàn)材料的花蕾縱徑和花藥縱徑均差異顯著。遼蔥11號(hào)和Ln yc16的花藥橫徑差異較大，而喬香3號(hào)差異不明顯。隨著小孢子生長(zhǎng)發(fā)育，花蕾橫徑和花蕾縱橫比也逐漸增大，花被長(zhǎng)度變化幅度較大。

表1 不同大蔥材料小孢子各發(fā)育時(shí)期花器官的形態(tài)特征

從表2可以看出，小孢子處于單核靠邊期時(shí)花蕾的縱徑在4.700~6.133mm范圍內(nèi)，花蕾橫徑在2.200~2.567mm，花蕾縱橫比在2.133~2.390，花藥縱徑在2.0~2.6 mm，花藥橫徑在0.767~0.867 mm，藥被比在0.507~0.517。在供試材料中，單核靠邊期時(shí)，不同基因型材料間的花蕾縱徑差異相對(duì)較大，而花蕾橫徑、花藥縱徑、花藥橫徑和花被長(zhǎng)等形態(tài)特征的同一尺寸在不同試材中有交叉現(xiàn)象，而且分布在小孢子發(fā)育的不同時(shí)期，因此，這些性狀不能作為衡量小孢子單核靠邊期的標(biāo)準(zhǔn)。而花蕾縱橫比和藥被比的適宜大小不存在與其他發(fā)育時(shí)期尺寸相同的現(xiàn)象，它們更適宜作為不同材料取樣適期的通用尺寸，花蕾縱橫比在2.133~2.390，藥被比在0.507~0.517，此范圍可作為大蔥不同材料花蕾單核靠邊期的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

表2 不同大蔥材料小孢子單核靠邊期花器官的形態(tài)特征

供試材料的大蔥小孢子發(fā)育時(shí)期花器官的其他外部形態(tài)特征，不同基因型大蔥小孢子各發(fā)育時(shí)期花蕾的形態(tài)差異明顯，處于單核靠邊期時(shí)，其花蕾明顯變大，花藥被花被包裹，前者長(zhǎng)度比后者長(zhǎng)度的1/2還長(zhǎng)一些，花被淺綠色，花藥黃綠色（表3）。

表3 大蔥小孢子不同發(fā)育時(shí)期花器官的其他外部形態(tài)特征

3 結(jié)論與討論

該文利用改良石碳酸復(fù)紅染液方法對(duì)不同時(shí)期的大蔥花蕾進(jìn)行染色、壓片觀(guān)察，染色效果非常好，能清楚地觀(guān)察到染色體和細(xì)胞核的分布情況，成本低，操作簡(jiǎn)單。在小孢子培養(yǎng)中，并不是任何時(shí)期的小孢子均可以培養(yǎng)，十字花科中的多個(gè)作物已經(jīng)找到小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期，如羽衣甘藍(lán)[13]、芥藍(lán)[14]、白菜[15]、甜瓜[16]、紅菜薹[17]和小白菜[18]等作物，多以單核靠邊期至雙核初期時(shí)小孢子誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生最佳，即花瓣與花藥比為0.50~0.60時(shí)小孢子出胚率最高。此時(shí)期小孢子容易誘導(dǎo)成胚。茄子花蕾處于單核中晚期，長(zhǎng)度在10.0~11.1 mm時(shí)[19]，小孢子培養(yǎng)效果最佳。

大蔥是傘形花序，上部花先開(kāi)，中部次之，下部最晚，因此，在取花藥壓片時(shí)要注意花序中花蕾的部位和花蕾大小。研究發(fā)現(xiàn)1.5 mm以下的花蕾多以無(wú)分裂現(xiàn)象出現(xiàn)；1.5~2.3 mm的花蕾，第1次減數(shù)分裂前期多；2.4~2.7 mm的花蕾，以第2次減數(shù)分裂前期多，出現(xiàn)明顯的二分體時(shí)期；2.7~4.6 mm之間的花蕾，不同時(shí)期分裂現(xiàn)象并存：其中，2.8~3.3 mm的花蕾時(shí)多為第2次減數(shù)分裂末期四分孢子體時(shí)期，3.4~4.6 mm，多為單核早期；4.700~6.133 mm時(shí)出現(xiàn)多為單核靠邊孢子體時(shí)期；6.467~6.867 mm為雙核期；藥被比在0.507~0.517時(shí)可取樣進(jìn)行單倍體培養(yǎng)。不同類(lèi)型材料花蕾大小會(huì)有些差異，在進(jìn)行小孢子培養(yǎng)時(shí)，有必要了解供試材料花器官的適宜培養(yǎng)時(shí)期與外部形態(tài)的相關(guān)性，可綜合花蕾大小、花蕾縱橫比、藥被比和花藥的形狀、大小和顏色等因素來(lái)判斷其發(fā)育時(shí)期，無(wú)需鏡檢、省時(shí)省力。此外，還要考慮供試材料的基因型、培養(yǎng)基成分、小孢子濃度、熱激溫度和時(shí)間等因素，有利于提高小孢子培養(yǎng)效率。