離體小鼠股骨骨小梁與骨皮質(zhì)CT樣品制備探索

王戰(zhàn)京，武文琦，趙媛媛，雷建鋒

（首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

小動(dòng)物活體分子影像學(xué)是近些年來新興的交叉學(xué)科，其使用影像手段顯示組織水平、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的特定分子，進(jìn)而了解活體動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)生理變化[1-3]。顯微CT（Mirco-CT）是小動(dòng)物活體分子顯像影像學(xué)重要的實(shí)驗(yàn)方法，它適用于研究對(duì)象為小型嚙齒類動(dòng)物（小鼠，大鼠等），可無創(chuàng)、定量、多次重復(fù)的提供小動(dòng)物骨組織與肺組織結(jié)構(gòu)學(xué)變化[4，5]。同時(shí)它還是對(duì)離體小動(dòng)物骨組織進(jìn)行骨密度、骨小梁測(cè)量的重要手段[6-8]。小動(dòng)物CT 對(duì)骨密度進(jìn)行測(cè)算的原理是通過測(cè)量X 射線衰減系數(shù)（AC）與該材料的質(zhì)量密度的相關(guān)性進(jìn)行配準(zhǔn)計(jì)算，從而得出實(shí)驗(yàn)樣品的密度。本次實(shí)驗(yàn)主要探索不同的樣品制備方法對(duì)離體小鼠股骨骨小梁密度（BMD）和骨皮質(zhì)密度（TMD）CT 定量測(cè)量的影響，為小動(dòng)物離體樣品制備和CT 掃描提供選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周雌性BALA/C 小鼠20 只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。取出40 根小鼠股骨浸泡于戊二醛溶液1 周，股骨重量0.13～0.8 g，長(zhǎng)度5.3～4.8 cm。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)研究準(zhǔn)則。

1.2 儀器設(shè)備和軟件 儀器設(shè)備為BRUKER 公司in-vivo X-ray Microtomograph SkyScan-1276，由首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供，掃描系統(tǒng)為SKSCAN-1276 SYSTEM OVERVIEW，重建系統(tǒng)為SkyScan NRecon，2D 圖像觀察與校正軟件為SkyScan DataViewer，3D 圖像展示軟件為SkyScan Volume Rendering，圖像分析軟件為SkyScan 2D/3D Image Analysis。

1.3 分組及方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40 根小鼠股骨分為無水合制備組和水合制備組，每組20 根。按照不同的方法制備實(shí)驗(yàn)樣品，然后在相同條件下對(duì)樣品采用相同掃描參數(shù)進(jìn)行掃描。無水合制備組于掃描當(dāng)天直接從戊二醛溶液中取出離體小鼠股骨，掃描過程中采用直接暴露在空氣中。水合制備組于掃描前1 d 將固定于戊二醛溶液中的離體小鼠股骨放入EP 管中，加入純凈水進(jìn)行12 h 水合，掃描過程中內(nèi)部采用濕潤(rùn)紙巾包裹，外邊再包保鮮膜，模擬小鼠股骨在活體的環(huán)境下進(jìn)行Micro-CT 掃描。

1.4 圖像采集與骨密度計(jì)算 將標(biāo)本水平固定于樣品床上，使標(biāo)本與樣品床旋轉(zhuǎn)中心保持一致。選擇的掃描參數(shù)：矩陣2048×2048×116，電壓57 kV，電流72 μA，圖像分辨率5 μm/piex，曝光時(shí)間1300 ms,旋轉(zhuǎn)步長(zhǎng)0.4 度，濾光片選擇厚度為0.25 mm 的Al，旋轉(zhuǎn)度數(shù)為206°，掃描時(shí)間22 min。掃描完成后，再用布魯克公司提供的密度標(biāo)準(zhǔn)樣品羥基磷灰石（CaHA）密封分別為0.25 g/cm3和0.75 g/cm3進(jìn)行相同條件下CT 掃描[9-11]。掃描結(jié)束后分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品與股骨頭使用SkyScan NRecon 進(jìn)行相同參數(shù)的樣品重建，參數(shù)設(shè)置為平滑度為3，射線硬度設(shè)為60%。重建完成后使用SkyScan DataViewer 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣與小鼠股骨進(jìn)行物理位置的校正，校正結(jié)果為樣品在圖像中心，見圖1；樣品擺放整齊以便于下一步對(duì)其進(jìn)行分析，圖像調(diào)整完畢后劃出感興趣區(qū)域（VOI）在對(duì)圖像進(jìn)一步進(jìn)行重建，使在不損失圖像質(zhì)量的前提下，去除空白的像素區(qū)域，讓文件變小以便于后期處理，見圖2。圖像預(yù)處理結(jié)束后，使用SkyScan 2D/3D Image Analysis 對(duì)分析部位制作3D 重構(gòu)圖。BMD：起始位置從縱切面距離生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.5 mm 處開始向下取3.00 mm；TMD：起始位置從縱切面距離生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端6 mm 處腔內(nèi)沒有骨小梁分布處開始向下取3.00 mm。選取小梁內(nèi)部區(qū)域與骨皮質(zhì)外部區(qū)域同時(shí)進(jìn)行重組獲得3D 圖像，圖像信息設(shè)為最低閾值[12-14]。使用SkyScan Volume Rendering 軟件對(duì)重建的3D 圖像進(jìn)行展示。對(duì)骨組織重組的圖像使用SkyScan 2D/3D Image Analysis進(jìn)行定量分析，可以得到BMD 值和TMD 值。首先測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)樣品的射線吸收率，建立骨密度計(jì)算公式，再將需要測(cè)量的骨組織的射線吸收率代入公式計(jì)算出相應(yīng)的骨密度。

圖1 SkyScan DataViewer 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣和小鼠股骨進(jìn)行物理位置校正

圖2 重建感興趣區(qū)域

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，使用配對(duì)t檢驗(yàn)，置信區(qū)間設(shè)為95%。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨小梁與骨皮質(zhì)3D 重建結(jié)果 使用SkyScan Volume Rendering 軟件展示重建的3D 圖像，見圖3。

圖3 3D 骨小梁結(jié)構(gòu)和3D 骨皮質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)

2.2 兩組BMD 檢測(cè)結(jié)果比較 水合制備組BMD 檢測(cè)結(jié)果高于無水合制備組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1～表3。

表1 兩組BMD 檢測(cè)結(jié)果

表2 兩組BMD 檢測(cè)結(jié)果描述統(tǒng)計(jì)量

表3 兩組BMD 成對(duì)差分檢測(cè)結(jié)果t 檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 兩組TMD 檢測(cè)結(jié)果比較 兩組TMD 檢測(cè)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4～表6。

表4 兩組TMD 檢測(cè)結(jié)果

表5 兩組TMD 檢測(cè)結(jié)果描述統(tǒng)計(jì)量

表6 兩組TMD 成對(duì)差分檢測(cè)結(jié)果t 檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

小鼠是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，在骨科醫(yī)學(xué)、口腔醫(yī)學(xué)中常常用于各類疾損傷修復(fù)的研究。CT 對(duì)骨組織成像有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在臨床疾病診斷中有重要意義，是目前最為廣泛的檢測(cè)項(xiàng)目之一[15-18]。Mirco-CT作為骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)的重要檢測(cè)手段具有不可替代性，尤其是對(duì)BMD 和TMD 的測(cè)量具有突出優(yōu)勢(shì)。精度可以達(dá)到微米級(jí)別，能夠清晰的分辨骨小梁結(jié)構(gòu)，精準(zhǔn)測(cè)算出骨小梁與骨皮質(zhì)的密度等相關(guān)數(shù)據(jù)，再配合三維重構(gòu)軟件、幾何測(cè)量軟件，可以對(duì)各類硬組織進(jìn)行精準(zhǔn)觀測(cè)。動(dòng)物離體骨具有便于保存，有助于各類實(shí)驗(yàn)順利展開，在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域研究使用十分廣泛[18]。而離體骨的檢測(cè)與活體骨組織檢測(cè)由于存在環(huán)境不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異。如何讓保存的離體骨的測(cè)量結(jié)果更加接近與真實(shí)的活體檢驗(yàn)結(jié)果，一直是實(shí)驗(yàn)員探討的課題之一。同時(shí)在不影響掃描結(jié)果的前提下，如何短時(shí)間測(cè)量打樣品量也是實(shí)驗(yàn)室科學(xué)探索方向之一。

本次研究顯示，水合制備組BMD 檢測(cè)結(jié)果高于無水合制備組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；說明兩種制備方法樣品對(duì)CT 掃描結(jié)果存在差異。由于顯微CT 掃描測(cè)試是小動(dòng)物骨小梁BMP 分析的金標(biāo)準(zhǔn)，其中骨小梁密度作為重要參數(shù)之一，測(cè)量結(jié)果直接影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過結(jié)果可以看出水合后CT 掃描結(jié)果密度增加，更加接近與動(dòng)物體內(nèi)真實(shí)數(shù)值；同時(shí)觀察骨小梁結(jié)構(gòu)狀態(tài)無明顯變化。本次研究中，兩組TMD 檢測(cè)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明兩種制備方法樣品對(duì)CT 掃描結(jié)果存在差異不明顯。TMD 作為CT 掃描重要參數(shù)之一，測(cè)量結(jié)果直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。無水合與水合后CT 掃描結(jié)果密度無明顯差異，說明骨皮質(zhì)密度高，水分子很難滲透到骨皮質(zhì)之中，無水合不影響CT 掃描結(jié)果。

Mirco-CT 是骨密度檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，它的結(jié)果可衡量前期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立是否成功，同時(shí)對(duì)下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的修復(fù)治療提供重要參考依據(jù)。因此，建議使用水合制備法以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。需要說明的是，本次研究實(shí)驗(yàn)的數(shù)量相對(duì)較少，并且采用單一的小鼠股骨，沒有對(duì)大鼠以及裸鼠進(jìn)行比較，研究使用的儀器也比較單一。今后需要更多的相關(guān)研究確保其有效性、實(shí)用性，從而為臨床前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究提供有力保障。

綜上所述，無水合制備法直接影響了BMD 的測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性，對(duì)TMD 的測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生的影響較小，使用水合制備法更能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。