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    L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中4種有害醛類形成的抑制作用及其品質(zhì)的改善效果

    2022-06-29 04:30:40劉百里鄭潔黃才歡劉付歐仕益
    現(xiàn)代食品科技 2022年6期
    關(guān)鍵詞:鹽酸鹽曲奇呋喃

    劉百里,鄭潔,黃才歡,劉付,歐仕益

    (暨南大學(xué)理工學(xué)院,焙烤食品安全粵港聯(lián)合創(chuàng)新平臺,廣東廣州 510632)

    曲奇是全世界最受歡迎的烘焙產(chǎn)品之一[1]。它們含有大量糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì),并經(jīng)過高溫烘烤處理,因此曲奇是研究美拉德反應(yīng)衍生的化學(xué)危害的典型模型。以往研究焙烤加工食品的有害物方面多專注于丙烯酰胺問題[2]。然而,在美拉德反應(yīng)或糖類的直接熱裂解過程中,還會產(chǎn)生5-羥甲基糠醛(HMF)、α-二羰基化合物如3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)、乙二醛(GO)、丙酮醛(MGO)等[3]。此外,脂質(zhì)氧化也會產(chǎn)生GO、MGO等α-二羰基化合物[4]。研究表明,HMF可生物轉(zhuǎn)化為5-亞砜甲基-2-糠醛(SMF),后者能夠與DNA發(fā)生反應(yīng)且具有潛在致癌性[5]。二羰基化合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs),AGEs與多種和年齡相關(guān)的慢性炎癥疾病的發(fā)展相關(guān),例如糖尿病、心血管疾病[6]、癌癥[7]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]。在分子水平上,羥基酪醇可以有效捕獲乙二醛和丙酮醛,它們與3-脫氧葡萄糖醛酮一起,代表了食物中最豐富的二羰基化合物[9]。L-半胱氨酸由發(fā)酵法制得,我國年產(chǎn)約1×104t[10]。它是一種還原劑,能切斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵進(jìn)而弱化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)伸展開。L-半胱氨酸在食品、化妝品和醫(yī)藥保健品中有廣泛用途,其中食品添加劑用途占比60%以上。同時,L-半胱氨酸還具有抗氧化應(yīng)激、改善人體脂質(zhì)代謝和益生元等作用[11]。

    根據(jù)課題組前期研究,在生理條件下半胱氨酸可以與3-DG、GO、MGO、HMF形成加合物并降低細(xì)胞毒性,如丙烯醛的毒性降低近60倍[12,13]。因L-半胱氨酸溶解度小,食品工業(yè)中都用其鹽酸鹽;L-半胱氨酸鹽酸鹽是面粉改良劑,但在曲奇中的使用劑量,能否顯著降低以上四種有害醛類還未知。因此,本研究通過將不同添加量的L-半胱氨酸鹽酸鹽加于曲奇中,研究對曲奇外觀品質(zhì)、4種有害醛類含量及細(xì)胞毒性的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    低筋小麥粉,益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司;酥油、烤焙油,天津南僑食品有限公司;二甲基亞砜、氯化鈉、蔗糖、碳酸氫鈉,均為分析純,天津大茂有限公司;2,4-二硝基苯肼、鄰苯二胺、甲醇,德國默克試劑有限公司;5-羥甲基糠醛(98%),北京百靈威科技有限公司;乙二醛、丙酮醛,質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%水溶液,北京百靈威科技有限公司;3-脫氧葡萄糖醛酮,加拿大TRC有限公司;L-半胱氨酸鹽酸鹽(99%),北京夢怡美生物科技有限公司;MTT,德國BIOFROX公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LC-20AT高效液相色譜、GCMS-QP2010 ULTRA氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津公司;Centrifuge 5810 R離心機(jī),德國Eppendorf公司;XW-80A型微型旋渦混合儀,上海滬西分析儀器廠;SPECTRONIC-200分光光度計,賽默飛;QTS質(zhì)構(gòu)儀,英國Stable.Micro System公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 曲奇的制備

    參照美國AACC 10-54[14]方法制作曲奇。曲奇配方如表1(原料小麥粉不含有L-半胱氨酸鹽酸鹽)所示,首先將酥油迅速攪拌,加入蔗糖、奶粉、鹽、小蘇打攪打;之后取高果糖漿、碳酸氫銨、水,混合再向其中添加L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為0.0、0.3、0.6、1.0、1.5 g/kg)制得混合溶液。將溶液與干粉料攪拌均勻,置于心型模具內(nèi)制成曲奇,放在預(yù)熱45 min后的烤箱中,于200 ℃下烘焙15 min制得曲奇。

    表1 曲奇配料 Table 1 Cookie ingredients (g)

    1.3.2 感官評價

    構(gòu)建感官評價小組,小組有12名成員(3名男性和9名女性,年齡21至24歲)。對曲奇樣品進(jìn)行評價,分別從顏色、形態(tài)、香味、甜味、細(xì)膩度、裹齒感、后味七個特性分析。每種特性分?jǐn)?shù)構(gòu)成為:顏色0~20分,形態(tài)0~15分,香味0~15分,甜味0~15分,細(xì)膩度0~10分,裹齒感0~10分,后味~15分。

    1.3.3 曲奇中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

    根據(jù)鐘京等[15]的方法稍加改動,采用固相微萃取方法檢測曲奇中風(fēng)味物質(zhì)。取5 g研磨后的曲奇樣品放入40 mL的頂空采樣瓶中,于60 ℃恒溫條件下吸附萃取30 min。吸附結(jié)束后,將萃取頭立即插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口,于250 ℃解析3 min,進(jìn)行分析。色譜條件:DB-5MS色譜柱(300 mm×0.25 mm,0.25 μm);載氣(氦氣)流量:恒定流速,0.8 mL/min;升溫程序:初溫40 ℃,保留3 min,以5 ℃/min升至90 ℃,之后按照12 ℃/min升至220 ℃,保留7 min。

    質(zhì)譜條件:離子源溫度200 ℃,電子能量70 eV,電離方式為電子轟擊(electron impact),質(zhì)量掃描范圍為30~490。

    1.3.4 曲奇白度、質(zhì)構(gòu)測定

    采用白度計對曲奇樣品的色度進(jìn)行測定,以L*、a*和b*為色度參數(shù)。用質(zhì)構(gòu)分析儀檢測曲奇樣品的質(zhì)構(gòu)(配備探頭TA11/1000和TA90平臺),測試速度2 mm/s,觸發(fā)點負(fù)載1 g,返回速度2 mm/s[16]。

    1.3.5 曲奇中水提物的制備

    將1 g研磨后的曲奇樣品置于50 mL離心管中,加入5 mL去離子水,渦旋3 min,在10000 r/min下離心10 min,收集上清液,用5 mL去離子水重復(fù)提取兩次,合并上清液,用去離子水定容至15 mL。

    1.3.6 HMF的測定

    將曲奇水提物用0.22 μm濾膜過濾,參照Huang等[17]的方法,進(jìn)行高效液相色譜分析,色譜柱為Zorbax SB-Aq柱。流動相:5%甲醇水溶液;樣品進(jìn)樣體積:10 μL;流速:0.6 mL/min;檢測波長:284 nm。通過HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=101278x-145308(R2=0.9992,線性范圍10~600 μg/mL)。每處理重復(fù)3次。

    1.3.7 MGO、3-DG的測定

    對于MGO和3-DG的檢測采用OPD衍生法進(jìn)行高效液相色譜檢測,取1.0 mL樣品水提物與100 μL 10%(m/V)鄰苯二胺甲醇溶液混合后,60 ℃水浴避光衍生24 h。將衍生后的混合物用0.22 μm濾膜過濾,收集濾液采用HPLC測定?;旌暇鶆蚝笤?0 ℃水浴中加熱60 min,然后取出用0.22 μm濾膜過濾,收集濾液進(jìn)樣分析。根據(jù)Ou等[18]的方法,樣品分離在Zorbax SB-Aq柱上進(jìn)行,流動相:A為0.1%乙酸水,B為甲醇,進(jìn)行梯度洗脫,梯度程序設(shè)置:B=28%~43%,0.00~15.00 min;B=43%~75%,15.01~ 30.00 min;B=75%,30.01~35.00 min。流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL,柱溫:40 ℃,檢測波長:314 nm。通過MGO和3-DG的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,其中MGO濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2 μmol/mL,3-DG濃度為10、30、50、70、90、120 μg/mL由本實驗測得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:MGO為y=2128405.56x- 12276.93(R2=0.9996,線性范圍0.1~1.2 μmol/mL)3-DG為y=21986.31x+3027.17(R2=0.9999,線性范圍10~120 μg/mL)。每處理重復(fù)3次。

    1.3.8 GO的測定

    對于GO的檢測采用2,4-二硝基苯肼衍生法[19]進(jìn)行高效液相色譜檢測。取0.2 mL樣品水提物加入1.8 mL乙腈和1 mL DNPH(濃度為12.5 mmol/L溶于乙腈/濃鹽酸9:1)混合均勻后在70 ℃水浴中加熱2 h,冷卻后取出用0.22 μm濾膜過濾,收集濾液進(jìn)樣分析。根據(jù)Ou等[18]的方法,流動相A為0.1%乙酸水,流動相B為甲醇,進(jìn)行梯度洗脫,梯度程序設(shè)置:

    B=28%~43%,0.00~15.00 min;B=43%~75%,15.01~ 30.00 min;B=75%,30.01~35.00 min。進(jìn)樣量:10 μL;流速:0.6 mL/min;柱溫:40 ℃。檢測波長:435 nm。繪制GO的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,其中GO的濃度設(shè)置為0.01、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/mL,由本實驗測得GO的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下y=3095277.65x-15928.29(R2=0.99,線性范圍0.01~0.40 μmol/mL)。每處理重復(fù)3次。

    1.3.9 細(xì)胞活力

    通過MTT法檢測曲奇水提物對人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)的毒性,向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100 μL 104cells/mL的GES-1細(xì)胞單細(xì)胞懸液,然后加入100 μL曲奇水提物在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,移除培養(yǎng)液,用120 μL含有5 mg/mL MTT溶液的培養(yǎng)基替代藥物,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),移除培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO溶液,置于搖床上振蕩10 min,然后在570 nm處檢測吸光度。每處理重復(fù)3次。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件處理,使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析,并在p=0.05水平下進(jìn)行Duncan’s顯著性差異分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇感官、色澤和質(zhì)地的影響

    感官評價的結(jié)果如表2所示。從顏色、形態(tài)、香味、甜味、細(xì)膩度、裹齒感、后味七個屬性的得分分析,添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后曲奇的感官評價得分高于空白組,當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為1.0 g/kg時,曲奇的感官評價得分最高。

    表2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇的感官評分的影響 Table 2 The sensory scores of cookies after adding L-cysteine hydrochloride

    曲奇的白度可以通過三個參數(shù)來確定,即L*值、a*值和b*值,其中L*值表示黑色(0)/白色(100)顏色,a*值表示綠色(-)/紅色(+),b*值表示藍(lán)色(-)/黃色(+)[20]。隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增大,L*值顯著提高,b*值下降,證實了曲奇經(jīng)L-半胱氨酸鹽酸鹽處理后會變白。

    隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加,硬度先升后降。在1.5 g/kg添加量時硬度小于空白組曲奇,咀嚼性顯著增加。所以,L-半胱氨酸鹽酸鹽可對曲奇質(zhì)構(gòu)中的硬度和咀嚼性有較大的影響,可使曲奇口感變得更酥脆[21]。

    表3 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇質(zhì)構(gòu)的影響 Table 3 Effect of L-cysteine hydrochloride on texture in cookies

    2.2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中二羰基化合物含量的影響

    在本實驗中,我們研究了L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中3種二羰基化合物(3-DG、GO、MGO)的影響。二羰基化合物3-DG、GO、MGO等化學(xué)性質(zhì)非?;顫姡瑢θ梭w健康產(chǎn)生有害影響,是焙烤食品中需要把控的物質(zhì)[22]。

    由表4可知,L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加可顯著降低曲奇中3-DG、GO、MGO的含量。

    表4 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中3-DG、GO、MGO的影響(mg/kg) Table 4 Effect of L-cysteine hydrochloride on 3-DG, GO, and MGO in cookies (mg/kg)

    當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量為0.3 g/kg時,3-DG含量顯著下降,減少了30.05%(p<0.05),隨著添加量繼續(xù)增大,3-DG、GO、MGO都有顯著降低,L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為1.5 g/kg時,3-DG、GO、MGO含量分別下降了62.73%、46.27%、36.59%(p<0.05)。以往的研究中,Liu等[23]在熱加工模擬體系中添加槲皮素分別降低MGO、GO含量32.60%、40.48%。與此結(jié)果相比,L-半胱氨酸鹽酸鹽效果較好。實驗結(jié)果表明,L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中產(chǎn)生的二羰基化合物有明顯的抑制作用,能有效地降低烘焙過程中產(chǎn)生的有害物。這可能是因為L-半胱氨酸和二羰基化合物形成了加合產(chǎn)物[13]。

    2.3 L-半胱氨酸鹽酸鹽對HMF的影響

    研究表明HMF在高濃度下具有細(xì)胞毒性,對眼睛、上呼吸道、皮膚和粘膜有刺激性[24]。由表5可知,添加L-半胱氨酸鹽酸鹽可顯著降低曲奇中的HMF含量:當(dāng)添加量達(dá)到0.3 g/kg后,HMF顯著下降,降低幅度達(dá)到28.75%(p<0.05)。繼續(xù)增加L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量,抑制率顯著增加,添加量至1.5 g/kg時,HMF下降82.95%。

    表5 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中HMF的影響 Table 5 Effect of L-cysteine hydrochloride on HMF in cookies

    2.4 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

    半胱氨酸可以通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生肉香、燒烤風(fēng)味[25]。添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后,曲奇中的揮發(fā)性醛、醇和吡嗪含量升高,除呋喃酮外大部分酮類物質(zhì)含量減少。如表6所示,風(fēng)味物質(zhì)含量采用峰面積歸一化法計算。吡嗪類物質(zhì)在對照組中檢測到2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪,添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后增加了2,3-二甲基-吡嗪,2-(正丙基)-吡嗪。其中添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪含量分別增加了72.51%、92.54%、40%,2,6-二甲基吡嗪含量降低11.18%。醇類物質(zhì)在對照組中檢測到苯甲醇、乙醛縮丙醇苯乙醇、3-呋喃甲醇、1-戊醇、1-辛醇、1,2-丙二醇、3-甲基-4戊烯-1醇、2,3-丁二醇、葉醇,添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后1,2-丙二醇、3-甲基-4戊烯-1醇含量分別降低72.22%、100%,苯甲醇、乙醛縮丙醇苯乙醇、3-呋喃甲醇、葉醇含量分別升高80%、25%、8.15%、4.65%。醛類物質(zhì)在對照組中檢測到乙醛、壬醛、糠醛、2,4-二甲基-苯甲醛、辛烷醛,添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后增加了桃醛、反式-2,4-癸二烯醛、苯甲醛、2-噻吩甲醛。添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后,壬醛、2,4-二甲基-苯甲醛、辛烷醛含量分別升高85.71%、728.57%、66.67%,乙醛、糠醛含量分別降低88.24%、43.59%。酮類物質(zhì)在對照組中檢測到1-羥基-2-丙酮、3,4-二氫-6-甲基-2H-吡喃-2-酮、5-乙基二氫-2(3H)-呋喃酮、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮、1-羥基-2-丁酮、2-庚酮、3-[3-溴苯基]-7-氯-3,4-二氫-10-羥基-1,9(2H,10H)-吖啶二酮、2(5H)-呋喃酮、二氫-5-丙基-2(3H)-呋喃酮、5-丁基二氫-2(3H)-呋喃酮、二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮、5-己基二氫-2(3H)-呋喃酮,添加前后酮種類基本不變,含量有較明顯變化,在添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后3-[3-溴苯基]-7-氯-3,4-二氫-10-羥基-1,9(2H,10H)-吖啶二酮、2-庚酮、2(5H)-呋喃酮、5-丁基二氫-2(3H)-呋喃酮、二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮含量分別升高200%、17.24%、7.69%、46.27%、176.14%,1-羥基-2-丙酮、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮、1-羥基-2-丁酮、二氫-5-丙基-2(3H)-呋喃酮物質(zhì)含量分別降低4.75%、61.90%、79.31%、42.67%。這可能是因為半胱氨酸和還原糖的美拉德反應(yīng)會降低脂肪族羰基的水平源自脂質(zhì)氧化和降解的化合物,例如酮[26]。含硫化合物-噻吩是肉香味的重要來源[27]。對照組中檢測到4-甲基-5-(beta-羥乙基)噻唑,在添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后增加了2-乙基-噻唑、2-乙酰噻唑。

    表6 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響 Table 6 Effect of L-cysteine hydrochloride on the volatile flavor substances in cookies

    續(xù)表6

    2.5 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇水提物細(xì)胞毒性的影響

    采用人胃粘膜細(xì)胞(GES-1)研究了曲奇水提物對細(xì)胞活力的影響。未加藥的對照組細(xì)胞存活率為84.8%,添加L-半胱氨酸鹽酸鹽的曲奇水提物培養(yǎng)GES-1細(xì)胞的存活率分別為103.7%、100.9%、86.3%、99.2%。添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽的曲奇水提物培養(yǎng)細(xì)胞的存活率均有提高,說明L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加對GES-1細(xì)胞活力有促進(jìn)作用。

    3 結(jié)論

    本實驗通過添加不同量L-半胱氨酸鹽酸鹽,研究對烘焙曲奇外觀品質(zhì)及有害物質(zhì)的影響。研究表明:L-半胱氨酸鹽酸鹽提高了曲奇的白度和感官評分,更加酥脆的口感。抑制了曲奇中的活潑羰基化合物(HMF、3-DG、GO、MGO)的形成。同時對風(fēng)味成分有不同程度的影響,揮發(fā)性醛、醇和吡嗪含量升高,除呋喃酮外大部分酮類物質(zhì)含量減少。添加L-半胱氨酸鹽酸鹽對細(xì)胞沒有抑制作用。結(jié)合實驗數(shù)據(jù)分析可以得出結(jié)論,在1.0 g/kg L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量時,曲奇的外觀、氣味、口感均令人滿意,有害醛類含量較少且對GES-1細(xì)胞活力有促進(jìn)作用。

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