葛根素穴位注射預(yù)處理對(duì)布比卡因誘發(fā)的心肌損傷影響及機(jī)制探討

于 妍，王春愛，秦曉宇，李玉蘭，梁 曦，溫曉輝，劉 敏

(1. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730030；3. 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；4. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030)

手術(shù)過程中常采取局部麻醉的方式來減輕患者疼痛，以提高手術(shù)成功率，但局麻藥有一定不良反應(yīng)，甚至?xí)蛐难芟到y(tǒng)毒性導(dǎo)致死亡[1-2]。布比卡因是一種酰胺類的長(zhǎng)效局麻藥，具有快速起效的優(yōu)勢(shì)，以推薦劑量使用比較安全[3]，因此在臨床上廣泛應(yīng)用。然而，布比卡因過量或誤入靜脈仍會(huì)導(dǎo)致明顯的不良反應(yīng)，其中心臟毒性較常見，可表現(xiàn)為心律失常、心搏驟停等[4]；其還可以直接抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體I(MRCC-I)，影響線粒體能量產(chǎn)生，并導(dǎo)致線粒體中活性氧(ROS)的產(chǎn)生，觸發(fā)凋亡的線粒體途徑[5-7]。目前研究認(rèn)為，兼具針刺和藥物治療雙重作用的穴位注射療法在輔助麻醉及心律失常治療領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[8-9]。關(guān)于心肌保護(hù)作用的研究顯示，葛根中有效成分葛根素可通過靶向作用于線粒體而保護(hù)心肌[10]，電針內(nèi)關(guān)穴可通過調(diào)節(jié)線粒體能量代謝的各種信號(hào)減輕心肌缺血再灌注損傷[11]?；诖?，本研究從調(diào)節(jié)線粒體功能角度探討了內(nèi)關(guān)穴葛根素注射液預(yù)處理對(duì)布比卡因誘發(fā)的心肌損傷的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，6月齡，體重250～300 g，由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK[甘]2019-0002。實(shí)驗(yàn)遵循美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南》，并經(jīng)甘肅省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-005)。

1.2藥品與試劑 鹽酸布比卡因注射液(上海朝輝藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):1404113)，葛根素注射液(成都天臺(tái)山制藥有限公司,批號(hào):180201)；the RNeasy Mini試劑盒、the QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒、the QuantiNova Reverse Transcription 試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，大鼠細(xì)胞色素C氧化酶(Rat COX) ELISA試劑盒購(gòu)自CUSABIO公司，單胺氧化酶(MAO)ELISA試劑盒購(gòu)自Elabscience公司，解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)抗體(Anti-UCP2)、腺嘌呤核甘酸轉(zhuǎn)運(yùn)子1(ANT1)抗體(Anti-ANT1 )購(gòu)自GeneTex公司，電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)抗體(Anti-VDAC1)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)抗體(Anti-Bcl-2 )購(gòu)自Abcam公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 多道電生理記錄儀(AD instruments,DBS-170)，微量注射泵(深圳圣諾醫(yī)療設(shè)備有限公司,SN-50F6)，鼠控溫解剖臺(tái)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)，Power Lab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(埃德儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司)，-80 ℃冰箱(Form scientific 公司)，低溫高速離心機(jī)(Sigma公司)，電子天平(Sartorius公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將40只雄性Wistar大鼠分為空白組、布比卡因組、葛根素治療組、葛根素預(yù)防組，每組10只。大鼠禁食不禁飲8 h后，采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，分別于左側(cè)股靜脈和右側(cè)頸動(dòng)脈置入24 G套管針用于給藥和監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓及采集血樣，采用PowerLab系統(tǒng)監(jiān)測(cè)血壓和Ⅱ?qū)?lián)心電圖?？瞻捉M大鼠不給予布比卡因，僅在雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴(前肢內(nèi)側(cè)離腕關(guān)節(jié)約3 mm尺橈骨縫間)注入生理鹽水各0.1 mL；布比卡因組和葛根素治療組均參照文獻(xiàn)[12]的方法經(jīng)股靜脈2 min內(nèi)輸注0.5%布比卡因10 mg/kg，當(dāng)Ⅱ?qū)?lián)心電圖出現(xiàn)心律失常(頻發(fā)室性早搏、室性心動(dòng)過速、QRS延長(zhǎng)20%)后，分別立即在雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴注入生理鹽水和葛根素注射液各0.1 mL；葛根素預(yù)防組在雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴注入葛根素注射液各0.1mL后5min，輸注0.5%布比卡因10 mg/kg(該組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中均未出現(xiàn)惡性心律失常)。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法 于注入生理鹽水(空白組)或注入利多卡因的第8 min處死各組大鼠，取左室心肌組織，分離心肌細(xì)胞線粒體。

1.5.1心肌細(xì)胞中COX、MAO活性 取心肌細(xì)胞線粒體，按照試劑盒說明，采用 ELISA法檢測(cè)COX、MAO活性。

1.5.2心肌細(xì)胞中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè)：用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。采用10% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入Bcl-2(1∶2 000)、VDAC1(1∶2 000)、UCP2(1∶2 000)、ANT1 (1∶2 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗在4 ℃過夜，PBST沖洗后，加入辣根過氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體(1∶5 000)在37 ℃下孵育1 h。使用ECL試劑盒進(jìn)行條帶分析，使用Image J 1.42q軟件程序計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5.3心肌細(xì)胞中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2 mRNA表達(dá)情況 采用RT-PCR法檢測(cè)：用TRIzol試劑盒提取總RNA，以總RNA(0.5 μg)為原料，反式合成cDNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。隨后，cDNA用GoTaq-qPCR母料進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。反應(yīng)在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，具體引物序列見表1。使用ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)基因表達(dá)的倍數(shù)變化，倍數(shù)變化值用2-ΔΔCt表示。

表1 UCP2、VDAC1、ANT1、Bcl-2基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌線粒體中MAO、COX活性比較與空白組比較，布比卡因組大鼠心肌線粒體中MAO活性明顯升高(P<0.05)，COX活性明顯降低(P<0.05)；與布比卡因組比較，葛根素治療組和葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中MAO活性均明顯下降(P均<0.05)，葛根素治療組大鼠心肌線粒體中COX活性無明顯變化(P>0.05)，葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中COX活性明顯升高(P<0.05)；葛根素治療組和葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中MAO、COX活性比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 空白組和布比卡因造模各組大鼠心肌線粒體中MAO、COX活性比較

2.2各組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白表達(dá)情況比較 與空白組比較，布比卡因組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與布比卡因組比較，葛根素治療組和葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2蛋白相對(duì)表達(dá)量及葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中ANT1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，葛根素治療組和葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)；葛根素治療組和葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1及表3。

表3 空白組和布比卡因造模各組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 空白組和布比卡因造模各組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白表達(dá)情況

2.3各組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2 mRNA表達(dá)情況比較 與空白組比較，布比卡因組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與布比卡因組比較，葛根素治療組和葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)；葛根素治療組和葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

表4 空白組和布比卡因造模各組大鼠心肌線粒體中VDAC1、UCP2、ANT1 、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

線粒體通過氧化磷酸化為細(xì)胞供能，線粒體電子傳遞和氧化磷酸化發(fā)生障礙可抑制ATP的產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)ATP減少，呼吸鏈電子漏出活性氧增加，線粒體膜電位降低，促進(jìn)通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。目前研究證實(shí)，線粒體損傷可導(dǎo)致心臟毒性[13-14]。COX作為線粒體內(nèi)膜的標(biāo)志性酶，是線粒體氧化磷酸化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)部位，在ATP產(chǎn)生中起主要作用；MAO是線粒體外膜的標(biāo)志性酶，其活性的增高與線粒體氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[15]。VDAC和ANT是MPTP 的組成部分，對(duì)MPTP開放起主要調(diào)節(jié)作用[16]；UCP是線粒體內(nèi)膜上參與能量代謝的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與電子漏出活性氧有關(guān)[17]；Bcl-2主要定位在線粒體外膜上，通過作用于MPTP起到抗凋亡作用[18]。

李振輝等[19]研究顯示，布比卡因可導(dǎo)致心肌細(xì)胞活性和線粒體膜電位降低,線粒體發(fā)生髓樣變和空泡樣變，推測(cè)心肌細(xì)胞線粒體功能障礙是其導(dǎo)致心臟毒性的機(jī)制之一。國(guó)外的相應(yīng)研究顯示，布比卡因可使部分線粒體呼吸鏈復(fù)合體的活性下降，電子傳遞障礙，影響線粒體能量代謝，導(dǎo)致MPTP開放[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，布比卡因可增強(qiáng)心肌線粒體中MAO活性，促進(jìn)VDAC1、UCP2、ANT1蛋白及mRNA表達(dá)，抑制COX活性和Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)，損傷線粒體功能，產(chǎn)生心肌毒性，再次證明布比卡因的心肌細(xì)胞毒性作用與線粒體有關(guān)。

目前研究認(rèn)為葛根素注射液具有明顯心肌保護(hù)作用。課題組前期大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葛根素內(nèi)關(guān)穴注射可通過增強(qiáng)心肌組織中Na+，K+-ATP 酶活性和抑制乳酸脫氫酶(LDH)活性，減輕布比卡因的心臟毒性[20]，內(nèi)關(guān)穴注射葛根素融合了經(jīng)絡(luò)、腧穴、藥物效應(yīng)的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葛根素治療組和葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中MAO活性及VDAC1、UCP2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于布比卡因組，心肌線粒體中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于布比卡因組，且葛根素預(yù)防組大鼠心肌線粒體中COX活性明顯高于布比卡因組，ANT1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于布比卡因組。提示穴位注射葛根素可以減輕布比卡因造成的線粒體功能損傷，且葛根素預(yù)處理作用更明顯，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。