羅米司亭對血小板減少性紫癜小鼠BMNC中Notch信號以及PBMC中GATA-3和PD-1表達的影響

張 揚， 王文斌

(1.重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院腫瘤血液科，重慶市402760；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院海扶腫瘤中心，重慶市400010)

免疫性血小板減少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura，ITP)是指以血小板減少為特征的出血性疾病，多發(fā)于小兒，嚴重影響患兒的生命健康和生活質(zhì)量。羅米司亭作為新一代的血小板生成素受體激動劑可直接刺激血小板的生成，臨床上用于治療血小板減少癥，但是關(guān)于其在血小板減少性紫癜中的研究較少。Notch信號通路具有調(diào)節(jié)巨核細胞生長、凋亡的作用，從而影響血小板的生成[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白-3(transfer factor binding protein-3，GATA-3)可通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)參與免疫性血小板減少的發(fā)生[2]。程序性細胞死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)也是ITP的主要參與者，其水平與患者療效有一定的關(guān)系[3]。本文探究羅米司亭對血小板減少性紫癜小鼠Notch信號、GATA-3和PD-1表達的影響，為臨床治療血小板減少性紫癜提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑(Sigma公司，美國)；抗血小板抗體(antiplatelet antibody，PAIg)、Western blot所需一抗、二抗(Abcam公司，美國)；羅米司亭注射液(安進公司，美國)；EDTA-Na2抗凝劑試管、全自動血液分析儀BC-3000 Plus(深圳邁瑞生物科技有限公司)；瑞氏染色液(溫州市康泰生物公司)；T淋巴細胞活化劑PHA(BD Biosciences公司，美國)；Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，日本)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒和ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(阿斯本生物技術(shù)公司，中國)；骨髓單個核細胞(bone marrow monouclear cells，BMNC)(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 分組及干預(yù)方法

48只SPF級Balb/C小鼠(體質(zhì)量18～22 g)隨機均分為對照組、ITP組和羅米司亭組。ITP組和羅米司亭組參考文獻[4]方法進行ITP建模，腹腔注射PAIg 2 μg(溶解于200 μL磷酸鹽緩沖溶液)，連續(xù)注射7天，當小鼠血小板計數(shù)下降至<50%初始值即建模成功。對照組腹腔注射等量的磷酸鹽緩沖溶液。從第8天起，羅米司亭組皮下注射羅米司亭(安進公司，H20065432)2 μg/kg，連續(xù)14天。ITP組給予同等劑量的生理鹽水皮下注射。

1.3 血小板計數(shù)

分別在建模前、建模第7天、干預(yù)第7天和干預(yù)第14天收集小鼠尾靜脈血液于抗凝管中，使用全自動血液分析儀檢測血小板計數(shù)。

1.4 BMNC和外周血單個核細胞的培養(yǎng)

將建模第21天BMNC在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別加入T淋巴細胞活化劑PHA和不加PHA培養(yǎng)48 h(37 ℃、5%CO2)，細胞含量調(diào)節(jié)至5×105個/mL待測。建模第21天抽取外周血，通過淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，同上培養(yǎng)。

1.5 qRT-PCR

將細胞在液氮保護下研磨并裂解，然后用Trizol法提取組織總RNA并溶解于DEPC水中。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃反應(yīng)15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活條件為85 ℃反應(yīng)15 s。用PCR試劑盒進行qRT-PCR實驗檢測BMNC中Notch1、Jagged1和PBMC中GATA-3 mRNA水平。95 ℃下激活DNA聚合酶5 min進行PCR，然后進行40個循環(huán)兩步PCR(95 ℃10 s和60 ℃30 s)，最終延伸75 ℃ 10 min，保持在4 ℃。所有引物均獲自Genewiz公司，使用2-ΔΔCT法分析mRNA表達。

1.6 Western blot檢測BMNC中Notch1、Jagged1蛋白水平

使用Western blot檢測BMNC中Notch1、Jagged1蛋白水平，細胞裂解后收集蛋白并通過蛋白定量方法繪制標準曲線以確定蛋白水平。10%聚丙烯酰胺電泳，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜進行轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫下孵育1.5～2.0 h，使用ECL試劑進行化學發(fā)光檢測，以GAPDH為內(nèi)參。使用流式細胞術(shù)檢測BMNC中PD-1水平。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果2.1 各組小鼠血小板計數(shù)的比較

與對照組比較，建模后小鼠血小板計數(shù)顯著降低，干預(yù)第7天和14天羅米司亭組血小板計數(shù)顯著高于ITP組，且隨時間延長更為顯著(P<0.05；表1)。

表1 各組小鼠血小板計數(shù)的比較 單位：×109個/L

2.2 各組Notch信號通路表達水平的比較

建模后BMNC中Notch信號通路表達水平顯著升高(P<0.05)，羅米司亭組Notch、Jagged1蛋白和mRNA表達水平顯著低于ITP組(P<0.05;圖1和表2)。

圖1 各組BMNC中Notch和Jagged1蛋白水平的比較

表2 各組BMNC中Notch信號通路表達水平的比較

2.3 各組GATA-3 mRNA和PD-1水平的比較

建模后小鼠PBMC中GATA-3 mRNA和PD-1水平顯著降低(P<0.05)，羅米司亭組GATA-3 mRAN和PD-1水平顯著高于ITP組(P<0.05；表3)。

表3 各組PBMC中GATA-3 mRNA和PD-1水平比較

3 討 論

血小板減少性紫癜可分為繼發(fā)性血小板減少性紫癜和免疫性血小板減少性紫癜，其中免疫性血小板減少是由于血小板抗體的存在而引起的血小板減少，其發(fā)病機制尚不明確。臨床上一線用于治療ITP的方法主要是通過抑制血小板抗體的生成來減少血小板破壞，常用的藥物包括糖皮質(zhì)激素等激素類藥物和丙種球蛋白，以及環(huán)孢素、長春花堿、利妥昔單抗等化療藥物，但這些藥物往往具有較多的不良反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)新的治療ITP方法具有重要意義。

促進血小板的生成也是治療血小板減少性紫癜的主要方法，血小板生成素模擬肽(thrombopoitinmimetic peptide，TMP)與血小板生成素(thrombopoietin，TPO)具有相似的生物學活性，具有促進局部細胞增殖、分化和促進血小板生成的作用。新一代的血小板生成素受體激動劑羅米司亭可直接與巨核細胞表面的TPO受體c-MPL結(jié)合并促進血小板的生成，從而治療免疫性血小板減少性紫癜[5]。FDA在2008年批準將羅米司亭用于經(jīng)糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白以及脾切除治療無效的成人慢性免疫性血小板減少癥，但是對于其在ITP中的應(yīng)用以及相關(guān)機制的研究較少[6]。為探究羅米司亭對血小板減少性紫癜的意義，本研究通過注射PAIg建立小鼠ITP模型，建模后小鼠皮下出現(xiàn)明顯紫癜，出現(xiàn)行動遲緩、精神萎靡等癥狀，并通過檢測血小板計數(shù)判斷建模成功；并通過皮下注射羅米司亭進行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建模后小鼠血小板計數(shù)顯著降低，干預(yù)后7天和14天羅米司亭組血小板計數(shù)顯著高于ITP組。這說明羅米司亭具有促進ITP小鼠血小板恢復(fù)的作用。過往研究發(fā)現(xiàn)羅米司亭可呈劑量依賴性促進血小板生成，治療血小板減少和ITP[7-8]。

為進一步探究羅米司亭治療ITP的機制，本研究檢測了羅米司亭對BMNC中Notch信號通路，以及PBMC中GATA-3和PD-1水平的影響。血小板減少性紫癜的機制之一是血小板生成的減少，過往研究已經(jīng)證明羅米司亭與c-MPL結(jié)合后可通過促進JAK2和STAT5磷酸化，促進巨核系集落生成細胞生長，從而促進血小板生成[9]。同時骨髓中巨核細胞的成熟障礙也是免疫性血小板減少性紫癜的發(fā)病原因之一，Notch信號通路一方面可以通過影響造血干/祖細胞水平影響巨核細胞分化調(diào)節(jié)血小板的生成，另一方面Notch信號通路的激活會激活CD4+T細胞生成從而引起免疫性血小板減少，過往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ITP會引起Notch通路過表達引起免疫反應(yīng)[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建模后小鼠BMNC中Notch信號通路表達水平顯著上調(diào)，羅米司亭組Notch、Jagged1蛋白和mRNA表達水平顯著低于ITP組，提示羅米司亭可能具有抑制Notch信號通路表達的作用，從而治療免疫性血小板減少。另一方面，血小板的減少也與機體的免疫情況有關(guān)，研究顯示，GATA-3作為一種鋅指蛋白可通過調(diào)節(jié)白細胞介素4、5等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機體Th1/Th2平衡，參與免疫性血小板減少[11]。PD-1作為一種免疫球蛋白發(fā)揮免疫抑制作用，在免疫性血小板減少患者中，PD-1水平會顯著降低，從而引起過度炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病[12]。本研究結(jié)果顯示，建模后小鼠GATA-3和PD-1水平顯著降低，羅米司亭組GATA-3 mRAN和PD-1水平顯著高于ITP組。羅米司亭具有免疫抑制的作用[13]。

綜上所述，羅米司亭可提高ITP小鼠血小板計數(shù)，下調(diào)BMNC中Notch信號通路表達水平，上調(diào)PBMC中GATA-3和PD-1水平。關(guān)于羅米司亭對免疫性血小板減少性紫癜的作用及其機制還需要進一步研究。