m6A甲基化修飾與泌尿系統(tǒng)腫瘤關(guān)系的研究進展

計 銳， 鄭君芳

(1.首都醫(yī)科大學附屬同仁醫(yī)院本?？平逃?，北京市100176；2.首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學系 腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究實驗室，北京市100069)

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladeno-sine,m6A)修飾是位于腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾，往往含有一段保守基序RRACH(R代表A或G，H代表A、C或U)，它是真核生物RNA最常見的一種表觀修飾方式，存在于各種不同類型的RNA上，包括信使RNA(mRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(Micro RNA，miRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)等[1]。m6A修飾是一種由多種蛋白維持的動態(tài)、可逆平衡過程，包括甲基轉(zhuǎn)移酶，去甲基化酶以及閱讀蛋白等。m6A甲基化修飾參與調(diào)控mRNA的剪切加工、核轉(zhuǎn)運、降解及翻譯等過程，在mRNA的整個生命周期中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，m6A甲基化修飾與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸受到重視，但m6A甲基化修飾與泌尿系統(tǒng)腫瘤中的研究并不多見。本文就m6A甲基化修飾的生理作用機制及其與泌尿系統(tǒng)腫瘤之間的關(guān)系做一綜述。

1 m6A甲基化修飾的3種蛋白

1.1 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶

m6A甲基轉(zhuǎn)移酶利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基介導RNA發(fā)生甲基化修飾，主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like14，METTL14)及其輔助因子腎母細胞瘤1-相關(guān)蛋白(Wilm’s tumor 1-associated protein,WTAP)等組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復合物，此外，還包括METTL3的同源物甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白16(methyltransferase-like 16，METTL16)、病毒分離劑類m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白(virus isolator m6A methyltransferase-associated proteins，VIRMA，也稱KIAA14929)、RNA結(jié)合基序蛋白15/15B(RNA-binding motif protein 15/15B，RBM15/15B)和含鋅指CCCH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)13(protein containing zinc finger CCCH domain 13，ZC3H13)等其他蛋白質(zhì)[2]。Wang等[3]發(fā)現(xiàn)，METTL3是一種催化活性甲基轉(zhuǎn)移酶，METTL14在其活性位點提供結(jié)構(gòu)支持以實現(xiàn)催化作用。RNA GAC和AAC甲基化由METTL3選擇性誘導，而METTL14選擇性誘導RNA GAC甲基化，二者協(xié)同介導m6A甲基化過程。METTL3和METTL14形成異二聚體，WTAP通過募集METTL3和METTL14來促進m6A甲基化進程[4]。VIRMA往往優(yōu)先選中3′-UTR附近的mRNA來介導甲基化，ZC3H13與WTAP等其他輔助因子共同作用控制m6A甲基化過程[5]。

1.2 m6A去甲基化酶

m6A去甲基化酶的作用是對已經(jīng)發(fā)生m6A修飾的堿基去除甲基化修飾，肥胖相關(guān)(fat mass and obesity associated,FTO)基因和α-酮戊二酸依賴的加雙氧酶ALKB同源蛋白5(α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 5,ALKBH5)均屬此類。FTO和ALKBH5以Fe(II)和α-酮戊二酸依賴性的方式催化m6A的去甲基化，他們均為α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族成員[6]。m6A的去甲基化依賴FTO的氧化功能，生理條件下，m6A是FTO的最佳底物。m6A修飾在m6A去甲基化酶與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用下，成為一個動態(tài)、可逆且相對平衡的過程。

1.3 m6A閱讀蛋白

m6A閱讀蛋白主要作用是識別發(fā)生m6A修飾的堿基，進而指導下游生物活動。閱讀蛋白主要包括YT521-B同源性(YTH)域家族成員、YTHDF1～3和YTHDC1～3，它們均可以選擇性嵌入共有序列m6A核苷酸的保守m6A結(jié)合域，這有助于募集參與控制mRNA的各種效應(yīng)因子。YTHDC1通過與pre-mRNA結(jié)合并影響剪接位點的選擇而有助于選擇性剪接[7]。YTHDC2對不同mRNA翻譯和穩(wěn)定性存在著不同影響，穩(wěn)定生殖細胞減數(shù)分裂特異的轉(zhuǎn)錄本，同時加速有絲分裂的mRNA靶標的降解[8]。研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2減少了多種m6A轉(zhuǎn)錄本的半衰期，而YTHDF3與YTHDF1可以協(xié)同加速甲基化RNA的翻譯過程，也可以與YTHDF2相互作用促進mRNA的降解[9]。異質(zhì)核糖核蛋白(heteroribonucleoprotein，HNRNP)家族的某些成員也可作為閱讀蛋白，如HNRNPA2B1為特定的m6A結(jié)合蛋白，通過與m6A甲基化的轉(zhuǎn)錄本相結(jié)合來對主要的miRNA加工和成熟進行促進。HNRNPC和HNRNPG可調(diào)節(jié)mRNA的豐度和剪接。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein，IGF2BP，包括IGF2BP1/2/3)可以識別m6A修飾，它以m6A依賴性方式增加靶mRNA的穩(wěn)定性并促進其儲存，進而影響基因轉(zhuǎn)錄水平和癌癥的發(fā)生發(fā)展，與YTHDF2的作用剛好相反[10]。

2 m6A修飾與泌尿系統(tǒng)腫瘤關(guān)系

m6A修飾不會改變堿基編碼，但它通過閱讀蛋白與下游RNA的相互作用，在多水平上影響基因表達，參與了人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，尤其在癌癥中，扮演著十分重要的角色。研究表明，m6A修飾在多種癌癥中水平失調(diào)，影響腫瘤干細胞自我更新與分化等過程，不僅調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，也會引起其復發(fā)以及耐藥[11]。在膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GM)中，ADAM19上m6A甲基化修飾降低會增強癌基因的表達，促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的生長和自我更新，導致腫瘤發(fā)生[12]；而同在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中m6A修飾的增強卻可以促進成熟mRNA的降解，進而加速腫瘤的發(fā)生；在乳腺癌(breast cancer)中，m6A甲基化上調(diào)也會加速腫瘤的發(fā)生[10]。由此可見，m6A修飾酶表達水平能改變腫瘤相關(guān)基因mRNA的甲基化水平，進而實現(xiàn)對下游致癌基因或抑癌基因表達的調(diào)控，甚至在同一種腫瘤的進展過程中，m6A修飾的表達能發(fā)揮相反的作用。

2.1 m6A修飾與腎癌

在泌尿系腫瘤中，腎癌是較為常見的一類，其中臨床最常見的類型是腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，由于其早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者均在病情晚期被發(fā)現(xiàn)，預(yù)后多不良，轉(zhuǎn)移和復發(fā)的風險很高，病死率較高。

RCC細胞系總m6A修飾水平和正常腎小管上皮細胞系相比差異有顯著性，通過分析19個m6A調(diào)節(jié)因子之間的關(guān)聯(lián)確認了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的主要作用[13]。WTAP與METTL3和METTL14的表達水平相關(guān)，它們共同影響m6A修飾水平。WTAP是唯一與其他5種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶存在已知交互關(guān)系的轉(zhuǎn)移酶，WTAP在ccRCC中顯著上調(diào)，它的高表達也與ccRCC患者總生存期(overall survival,OS)相關(guān)。Li等[14]發(fā)現(xiàn)，腎癌中METTL3 mRNA和蛋白質(zhì)表達均較低。低表達的METTL3通過以下3種途徑促進癌癥的發(fā)生發(fā)展：①敲低METTL3可以通過調(diào)節(jié)p-PI3k，p-Akt，p-mTOR通路增加p-PI3k，p-Akt，p-mTOR和p-p70的表達，并減少p-4EBP1的表達，進而促進細胞增殖；②下調(diào)的METTL3通過反向調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)途徑中波形蛋白，β-catenin和N-cadherin以及同向調(diào)節(jié)E-cadherin，對細胞的遷移和侵襲過程起到積極促進作用；③METTL3的下調(diào)還可以顯著增加G1期的細胞周期停滯，降低抑癌基因P21的表達。

此外，ALKBH5高表達與腫瘤體積、TNM分期以及預(yù)后不良程度呈正相關(guān)[15]。ALKBH5的穩(wěn)定表達在體外促進腎癌細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，其主要機制為ALKBH5通過m6A依賴方式調(diào)節(jié)AURKB mRNA的穩(wěn)定性進而影響潛在靶標AURKB的表達，對細胞增殖進行調(diào)控。敲低的ALKBH5導致RCC細胞中AURKB mRNA的3′-UTR m6A水平顯著增加。Zheng等[13]發(fā)現(xiàn)，ccRCC組織中m6A結(jié)合蛋白IGF2BP1、IGF2BP2、IGFBP3、HNRNPA2B1表達上調(diào)。

2.2 m6A修飾與前列腺癌

男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤是前列腺癌(prostate cancer，PC)。近年來PC的治療發(fā)展迅速，在內(nèi)分泌去勢治療、內(nèi)分泌治療聯(lián)合化療以及生物分子靶向治療等方面均有所突破，但這些治療只能短期延緩疾病進程，無法做到根治。

Cai等[16]通過TCGA數(shù)據(jù)庫和Western印跡分析實驗發(fā)現(xiàn)METTL3在前列腺癌細胞系中過表達。METTL3通過m6A修飾的方式調(diào)節(jié)GLI、PAPR cleavage、Caspase 3/7、BclG2和Bcl-xL(抗凋亡)蛋白的活性以及SHH(Sonic Hedgehog)信號通路下游基因mRNA的表達水平，進而改變PC細胞的增殖、存活、集落形成和遷移能力。YTHDF3基因水平缺失，F(xiàn)TO和ALKBH5擴增是前列腺癌復發(fā)的危險因素。在Ji等[17]收集的病例中發(fā)現(xiàn)約70.2% m6A甲基化調(diào)節(jié)基因的基因拷貝數(shù)變異事件(copy number variations，CNV)是DNA拷貝數(shù)丟失，在所有m6A甲基化調(diào)節(jié)劑CNV中，ZC3H13拷貝數(shù)丟失百分比最高(46.1%)，其次是FTO和YTHDC2。在所有的m6A調(diào)控基因中，YTHDF3、IGF2BP3和HNRNPA2B1拷貝數(shù)增加最常見。通過研究CNV基因水平的改變和m6A甲基化調(diào)節(jié)劑的突變與前列腺癌臨床特征之間的關(guān)系，可以明確m6A調(diào)節(jié)劑改變的頻率與較高的TNM分期和生化復發(fā)密切相關(guān)。

Wang等[18]發(fā)現(xiàn)，PSA和基于METTL14和YTHDF2計算的風險評分與PC的OS顯著相關(guān)，高危評分患者發(fā)生PC的HR高于PSA值高的患者，提示METTL14和YTHDF2可以作為PC有效生存預(yù)測的生物標志物，具有作為治療靶點的潛力。

2.3 m6A修飾與膀胱癌

膀胱癌(bladder cancer，BCa)是最常見的泌尿道惡性腫瘤，在男性發(fā)病率中排第4位，死亡率第8位，初診時70%以上患者可確診為非肌層浸潤性膀胱癌(non muscular invasive bladder cancer，NMIBC)[19]。主要治療方法包括膀胱內(nèi)灌注化療、免疫治療以及對患者肉眼可見的腫瘤組織進行切除的聯(lián)合應(yīng)用，經(jīng)尿道膀胱腫瘤激光整塊切除術(shù)和電動力藥等[19]。

METTL3在體內(nèi)或體外的下調(diào)均可以抑制膀胱癌的增殖和轉(zhuǎn)移。Xie等[20]發(fā)現(xiàn)，由甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和識別蛋白YTHDF2組成的m6A調(diào)控軸與膀胱癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。METTL3/YTHDF2 m6A軸可以通過降解腫瘤抑制因子SETD7和KLF4的mRNA，促進BCa的進程。因此，METTL3/YTHDF2軸可能是治療BCa的潛在靶標。METTL14在膀胱癌和膀胱腫瘤起始細胞(TICs)中也存在低表達。Gu等[21]發(fā)現(xiàn)，Notch1是METTL14 m6A修飾的功能靶基因，METTL14的敲除大大增加了Notch1的表達，進而促進膀胱TICs的增殖、自我更新、轉(zhuǎn)移和腫瘤起始能力。因此，可以通過調(diào)節(jié)METTL14/m6A/ Notch1途徑對膀胱癌進行干預(yù)及治療。

Jin等[22]發(fā)現(xiàn)，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和去甲基化酶ALKBH5通過調(diào)節(jié)膀胱癌細胞中ITGA6的表達來改變細胞黏附功能。在大多數(shù)膀胱癌樣本中，ITGA6和METTL3表達中等或較高，而ALKBH5表達較低。在人組織微陣列中ITGA6的上調(diào)與人BCa組織中METTL3的表達增加和ALKBH5表達降低相關(guān)，且ITGA6高表達的患者存活率較低，膀胱癌患者腫瘤樣品ITGA6表達水平與組織學等級和分期呈正相關(guān)。因此，m6A修飾的ITGA6可確定為治療BCa的潛在治療靶標。

2.4 m6A修飾與睪丸生殖細胞腫瘤

睪丸生殖細胞腫瘤(testicular germ cell tumors，TGCT)是15～44歲男性中最常見的惡性腫瘤。目前臨床中TGCT的治療主要依賴于主動監(jiān)測，輔助單劑量卡鉑化療、順鉑化療、放療和腹膜后淋巴結(jié)清掃術(shù)。早期TGCT經(jīng)治療后長期存活率接近100%[23]，因此，找到早期診斷TGCT的靶標對患者的治療和預(yù)后有著極大的意義。Nettersheim等[24]發(fā)現(xiàn)，在GCT組織和細胞系中，成纖維細胞和不同發(fā)育階段的生殖細胞的RNA中可檢測到與METTL3、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPC相關(guān)的m6A甲基化修飾，且分化后的GCT細胞的RNA中m6A修飾水平增加，提示m6A修飾與GTCs的進展有密切關(guān)聯(lián)。Lobo等[25]發(fā)現(xiàn)，在TGCT的不同類型精原細胞瘤(Seminomas，SEs)和非精原細胞瘤(Non-Seminomatous tumors，NSTs)中，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶VIRMA和m6A閱讀蛋白YTHDF3 mRNA的表達水平有所不同。

順鉑是包括SEs在內(nèi)多種腫瘤中使用最廣泛的化療藥物之一。順鉑在抗腫瘤治療中起著雙重作用，在治療的同時常伴有毒性和耐藥性。Wei等[26]發(fā)現(xiàn)，METTL3高表達可以在耐順鉑精原細胞TCam-2中提高TFAP2C mRNA的m6A修飾水平，增強了TFAP2C mRNA的穩(wěn)定性，TFAP2C的高表達與某些類型腫瘤的不良存活率相關(guān)。同時，IGF2BP1作為m6A甲基識別蛋白，也可以增強TFAP2C mRNA的m6A甲基化，而TFAP2C通過激活DNA修復基因WEE1和BRCA1，增加了該環(huán)境下TCam-2-CDDP細胞的活力，影響著細胞對CDDP治療壓力的反應(yīng)。

3 總結(jié)與展望

m6a甲基化修飾通過甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和閱讀蛋白在腎癌、前列腺癌、膀胱癌和睪丸癌等泌尿系統(tǒng)腫瘤中起到了抑制癌基因表達或促進癌基因表達的作用，這是因為m6A修飾在RNA上有多個靶點，而各個靶點下游相關(guān)RNA和蛋白的表達機制及相互作用不盡相同。目前，以m6A甲基化為靶點的抗腫瘤治療仍局限在某些信號傳導通路或者說是某些基因上，且仍未應(yīng)用于臨床，主要原因在于對各條信號通路本身以及與其他通路上基因的相互作用并不清晰。

綜上所述，伴隨m6A修飾功能研究的逐步擴展和深入，m6A調(diào)控相關(guān)蛋白靶向藥物的研發(fā)也逐漸增多，RNA甲基化修飾研究在泌尿系統(tǒng)腫瘤早期診斷、精準治療、預(yù)后預(yù)測、預(yù)防復發(fā)等方面具有良好的應(yīng)用前景。