二氫楊梅素通過抑制骨骼肌TCPTP改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗

陳 欣， 劉 雙， 文 琴， 王 越， 鄧杰文， 凌宏艷， 奉水東

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院1.公共衛(wèi)生學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，湖南省衡陽市 421001)

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展以及人們生活行為方式的轉(zhuǎn)變，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的患病率逐年上升，其病因主要是胰島素分泌不足,或胰島素敏感性下降所引起的胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[1]。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase1B，PTP1B)是胰島素信號(hào)通路中一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子，可以降低胰島素的敏感性[2]。T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶(T cell protein tyrosine phosphatase，TCPTP)在PTP家族中與PTP1B相似度最高，普遍存在于成熟細(xì)胞和胚胎中。二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY)屬黃酮類化合物，可以提高胰島素的敏感性，改善IR[3]。研究證明，TCPTP可以抑制下丘腦AgRP/NPY神經(jīng)元胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，并且能抑制下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt信號(hào)通路[4-6]，但DMY對(duì)TCPTP的影響目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。骨骼肌是糖代謝以及胰島素作用最重要的外周靶器官，與IR密切相關(guān)[7]。本文旨在探究DMY改善T2DM大鼠胰島素抵抗的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)購于張家界志誠生物科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購于北京博愛港生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein serine threonine kinase,Akt)、磷酸化蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphorylated protein serine threonine kinase，p-Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylation of phosphatidylinositol 3′-kinase，p-PI3K)、TCPTP和β-actin抗體均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰島素試劑盒購于上海仁捷生物科技有限公司。-80 ℃超低溫冰箱購于奧林巴斯生物公司；高速低溫離心機(jī)購于其林貝爾生物公司；蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、電泳槽/轉(zhuǎn)印槽購于美國Bio-Rad公司；血糖儀購于三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

SD雄性大鼠22只7～8周齡，體質(zhì)量(270±10)g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。實(shí)驗(yàn)前，先將大鼠在安靜及清潔干燥的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自然光照，溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%。

1.3 二氫楊梅素的配制

將雙蒸水置于70 ℃的恒溫水浴箱中加熱，20 min后，將一定量的二氫楊梅素溶解在已經(jīng)加熱好的雙蒸水中，并用玻璃棒攪拌均勻。

1.4 T2DM大鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

將22只大鼠隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照組、DMY對(duì)照組，每組6只，2型糖尿病組、2型糖尿病DMY組，每組5只，DMY劑量為250 mg/kg，沿用Gheibi等[8]的方法進(jìn)行造模，造模成功后用普通飼料喂養(yǎng),直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.5 檢測各組大鼠體質(zhì)量、血糖、胰島素敏感指數(shù)

16周末，各組大鼠空腹過夜，稱重后，用三諾血糖儀測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，用ELISA法測血胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)，ISI=Ln[1/(FPG·FINS)][9]。

1.6 Western blot檢測大鼠骨骼肌TCPTP、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K和GLUT4的表達(dá)

16周末，用斷頸法處死大鼠，立即分離其骨骼肌至預(yù)冷的RIPA裂解液中,在勻漿器中反復(fù)研磨后低溫高速離心20 min取上清液，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析。配制10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上后，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，用TBSB洗去封閉液，共3次，每次5 min。清洗完成后，將PVDF膜與稀釋好的一抗TCPTP、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、GLUT4、β-actin，4 ℃孵育過夜。次日加入二抗室溫孵育1 h,TBSB洗滌3次，每次5 min，顯影，用Image J軟件系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 T2DM模型建立成功

在注射STZ后的第1、2、3、7天測量大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下的尾靜脈血，2型糖尿病組和2型糖尿病DMY組、大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L，且精神萎靡，活動(dòng)次數(shù)減少，皮毛光澤度下降，并出現(xiàn)了多飲、多食、多尿等表現(xiàn)，提示T2DM模型建立成功。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、血糖、胰島素敏感指數(shù)的比較

與正常對(duì)照組比較，2型糖尿病組大鼠FBG和FINS水平顯著升高，體質(zhì)量和ISI顯著降低；與2型糖尿病組比較，2型糖尿病DMY組FBG和FINS水平降低(P<0.05)，體質(zhì)量和ISI顯著升高(P<0.05；表1)；DMY可逆轉(zhuǎn)T2DM大鼠上述指標(biāo)改變，但DMY對(duì)正常大鼠上述指標(biāo)無明顯影響。表明DMY可增加T2DM大鼠體質(zhì)量、降低血糖并改善胰島素抵抗(表1)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖及胰島素敏感指數(shù)比較

2.3 各組大鼠骨骼肌TCPTP表達(dá)的比較

與正常對(duì)照組比較，2型糖尿病組大鼠TCPTP表達(dá)水平顯著升高；DMY可顯著降低2型糖尿病組大鼠TCPTP表達(dá)，但DMY對(duì)正常大鼠TCPTP表達(dá)水平無顯著影響(圖1)。

圖1 各組TCPTP相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 各組大鼠p-Akt、p-PI3K、GLUT4的比較

與正常對(duì)照組比較，2型糖尿病組GLUT4、p-Akt和p-PI3K的表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05)；與2型糖尿病組比較，2型糖尿病DMY組p-Akt、p-PI3K、GLUT4的表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05)。正常對(duì)照組與DMY對(duì)照組之間上述指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖2)。

圖2 各組大鼠蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

目前，市面上大多數(shù)降糖藥物都有不同程度的不良反應(yīng)[10-11]，因此，尋找相對(duì)安全、低不良反應(yīng)的中草藥正成為治療T2DM的熱點(diǎn)。

DMY是植物藤茶的主要成分，具有降血脂、降血糖、改善大鼠認(rèn)知功能及IR等作用[12-13]。研究表明DMY可以通過激活A(yù)MPK-PGC-1α-Sirt3信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬、抑制PPARg磷酸化[14]以及調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)改善IR[15]。

T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TCPTP)可以使胰島素受體去磷酸化，并減弱外圍胰島素信號(hào)傳導(dǎo)。Dodd等[16]實(shí)驗(yàn)證明，TCPTP的缺失可增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘦素和胰島素敏感性，并且抑制下游PI3K/Akt信號(hào)通路，改善IR。

本文以7～8周齡SD雄性大鼠為對(duì)象，采用高糖高脂飲食聯(lián)合STZ的方法成功建立了T2DM大鼠模型。通過觀察大鼠的體質(zhì)量、FBG、FINS、ISI及TCPTP、GLUT4、p-Akt、p-PI3K的表達(dá)水平，探究DMY改善T2DM大鼠骨骼肌IR的機(jī)制。結(jié)果顯示DMY可以增加T2DM大鼠的體質(zhì)量、降低血糖并改善IR，對(duì)正常大鼠無明顯影響。與正常對(duì)照組比較，2型糖尿病組p-Akt、p-PI3K、GLUT4的表達(dá)水平顯著降低，TCPTP表達(dá)水平顯著升高；與2型糖尿病組比較,2型糖尿病DMY組大鼠p-Akt、p-PI3K、GLUT4的表達(dá)水平顯著升高、TCPTP表達(dá)水平顯著降低，但DMY對(duì)正常大鼠上述指標(biāo)無顯著影響。

綜上所述，DMY可能通過抑制TCPTP的表達(dá)改善T2DM大鼠骨骼肌胰島素抵抗，這為T2DM的防治提供了新的思路。