CXC趨化因子配體14對高糖環(huán)境中脂肪細胞焦亡的影響

侯麗娜， 劉 嘉， 李亞蘭， 孫 振， 張莉莉， 王中群

(江蘇大學附屬醫(yī)院心內科，江蘇省鎮(zhèn)江市212001)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的一種代謝性疾病，目前已成為世界上最常見且增長最快的疾病之一，預計到2045年將有6.93億成年人患有糖尿病[1]。2型糖尿病患病率與肥胖密切相關[2]。糖尿病和肥胖的病理機制及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展都與胰島素抵抗和炎癥過程的激活有關[3-4]。高糖可影響脂肪細胞的分化及肥胖相關性代謝紊亂。暴露于高葡萄糖水平中的脂肪細胞表現(xiàn)出代謝功能受損，成熟脂肪細胞生成過程中長期和短期接觸葡萄糖都會促進3T3-L1細胞中甘油三酯的積累[5]。CXC趨化因子配體14(C-X-C motif chemokine ligand 14,CXCL14)是CXC趨化因子家族的一個成員，可以吸引樹突細胞、天然殺傷細胞和單核細胞[6-7]。近期研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者，特別是合并2型糖尿病患者循環(huán)中CXCL14水平下降，CXCL14的表達水平與體質指數(shù)和葡萄糖/胰島素穩(wěn)態(tài)受損指數(shù)呈負相關，與編碼促炎分子的基因表達呈負相關[8]。CXCL14在改善肥胖患者脂肪組織炎癥狀態(tài)和葡萄糖/胰島素穩(wěn)態(tài)方面具有重要研究意義。焦亡是一種炎癥誘導的程序性細胞死亡過程。既往體內外研究均發(fā)現(xiàn)，焦亡在糖尿病及其并發(fā)癥中起重要作用，但具體機制目前暫未闡明[9]。因此，本研究選用3T3-L1細胞為實驗細胞模型，探究CXCL14對高糖環(huán)境下脂肪細胞焦亡的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

3T3-L1細胞(ATCC)；胎牛血清(加拿大維森特公司)；青霉素、鏈霉素(中國北京博奧森生物技術有限公司)；IBMX、地塞米松(美國Sigma公司)；胰島素(蘇州美侖生物科技有限公司)；CXCL14重組因子(美國Peprotech公司)；β-actin抗體(美國Proteintech公司)；天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)抗體(美國Proteintech公司)；消化道皮膚素(gasdermin D，GSDMD)抗體、核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)抗體、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)抗體(英國Abcam公司)；羊抗兔二抗(上海泊灣生物公司)；ECL發(fā)光液(美國Gibico公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(南京建成生物公司)；Annexin V- FITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物科技公司)；油紅染色液(北京索萊寶有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

3T3-L1細胞采用DMEM、10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素培養(yǎng)，置于37 ℃、5%恒溫孵育箱內，用生長培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)培養(yǎng)細胞至完全融合并充分接觸抑制2天，換用誘導液I(DMEM+10%FBS,0.5 mmol/L IBMX,1 μmol/L地塞米松，10 mg/L胰島素)培養(yǎng)2天，換用誘導液Ⅱ(DMEM+10%FBS,10 mg/L胰島素)繼續(xù)培養(yǎng)2天，再換用完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2天換液。誘導分化第10天，90%以上細胞完全分化為成熟脂肪細胞，用于后續(xù)實驗。按照暴露環(huán)境將細胞分為5.5 mmol/L低糖(NG組)或25 mmol/L高糖組(HG組)。

1.3 油紅O染色

3T3-L1細胞經(jīng)“雞尾酒法”誘導10天后，棄去細胞培養(yǎng)基，用PBS輕柔漂洗3次，加入4%多聚甲醛固定30 min；配制油紅O工作液(油紅O儲存液∶去離子水為3∶2)，濾紙過濾，室溫下靜置10 min；將油紅O工作液加入細胞中，染色30 min，60%異丙醇漂洗，復染，蘇木精染色10 s，PBS漂洗；甘油明膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.4 Western blot

收集相應處理后的細胞，用預冷PBS清洗細胞3次，每孔加入100 μL RIPA細胞裂解液，用刮子刮取細胞，4 ℃ 10 000 r/min離心15 min，BCA法測定蛋白水平。總蛋白行10% SDS-PAGE，濕轉1.5 h至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 37 ℃封閉1 h,加入目標抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；冰上回收一抗，TBST洗膜3次，每次10 min,加入相應HRP標記的二抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h，再洗膜3次，采用ECL化學發(fā)光試劑顯色。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.5 實時熒光定量PCR

收集相應處理后的細胞，用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，再經(jīng)過反轉錄合成cDNA模板，最后進行熒光定量PCR檢測。擴增條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物序列：GSDMD上游引物5′-TTCAGGCCCTACTGCCTTCT-3′，下游引物5′-GTTGACACATGAATAACGGGGTT-3′；NLRP3上游引物5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′，下游引物5′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-3′；IL-1β上游引物5′-TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG-3′，下游引物5′-TGCTCATGTCCTCATCCTGGAAGG-3′；GAPDH上游引物5′-ATCATCTCCGCCCCTTCTGC-3′，下游引物5′-ATGCCTGCTTCACCACCTTC-3′。擴增結果采用2-ΔΔCt法計算相對定量。

1.6 CCK-8法

在96孔板中接種細胞懸液，將培養(yǎng)板在37 ℃、5%恒溫孵育箱內預培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)板中加入不同濃度CXCL14(終濃度為0、25、50、100、200 nmol/L)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內孵育4 h，用酶標儀測定450 nm處光密度，計算細胞活力。

1.7 LDH檢測

LDH按照試劑盒說明書加樣混勻后，室溫放置5 min，波長450 nm，酶標儀測定光密度值并計算。

1.8 Annexin V-FITC檢測

將細胞接種于6孔板，按實驗分組處理后，按照試劑盒說明步驟進行細胞熒光檢測，熒光顯微鏡拍照。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 HG對脂肪細胞焦亡的影響

3T3-L1細胞形態(tài)由梭形逐漸變?yōu)閳A形，誘導第4天細胞內開始出現(xiàn)小脂滴，誘導第10天90%以上細胞誘導為成熟脂肪細胞，經(jīng)油紅O染色呈紅色(圖1A)。與NG組比較，HG組GSDMD、NLRP3、IL-1β mRNA轉錄水平以及NLRP3、Caspase-1、IL-6蛋白表達水平明顯升高(P均<0.05)，其中NLRP3炎癥小體mRNA(P<0.01)及蛋白(P<0.05)變化最明顯，分別增加17.7倍、2.9倍(圖1B，C，D)。HG環(huán)境下，脂肪細胞LDH水平較對照組約升高1.8倍(P<0.01；圖1E)。Annexin V-FITC熒光檢測結果顯示HG組細胞死亡較高(圖1F)。

圖1 高糖環(huán)境對脂肪細胞焦亡的影響

2.2 HG環(huán)境下不同濃度CXCL14對脂肪細胞焦亡的影響

CCK-8結果顯示，與CXCL14未干預組(0 nmol/L)相比，不同濃度CXCL14對3T3-L1細胞增殖活力有促進作用(P<0.05；圖2A)。在HG環(huán)境下用0、25、50、100、200 nmol/L CXCL14處理脂肪細胞，免疫印跡法及qRT-PCR結果顯示不同濃度CXCL14對脂肪細胞焦亡相關蛋白及轉錄水平存在差異：相較于CXCL14未處理組(0 nmol/L)，25、100、200 nmol/L CXCL14對脂肪細胞焦亡具有促進作用，但是，與之相反的是50 nmol/L CXCL14處理組脂肪細胞GSDMD、NLRP3、IL-1β mRNA轉錄水平及NLRP3蛋白水平呈下調趨勢，其中NLRP3炎癥小體mRNA及蛋白下調最顯著(P<0.01；圖2B、C、D)。LDH結果同樣顯示，除50 nmol/L CXCL14處理組LDH釋放水平明顯下調(P<0.05)外，余處理組較0 nmol/L組LDH水平呈上升趨勢(P<0.05；圖2E)；Annexin-V FITC檢測同樣顯示50 nmol/L CXCL14處理組細胞死亡率下調顯著(圖2F)。

圖2 高糖環(huán)境下不同濃度CXCL14對脂肪細胞焦亡的影響

2.3 HG環(huán)境下CXCL14作用不同時間對脂肪細胞焦亡的影響

選用50 nmol/L CXCL14作用不同時間，免疫印跡法結果發(fā)現(xiàn)，與CXCL14未干預組(0 h)比較，50 nmol/L CXCL14干預后焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1蛋白表達水平呈下調趨勢(P<0.05)，并且隨干預時間的延長呈先下降再升高趨勢，其中作用12～24 h時NLRP3、Caspase-1蛋白下調最明顯(P<0.01；圖3)。

圖3 HG下CXCL14作用不同時間對脂肪細胞焦亡的影響(Western blot)

3 討 論

糖尿病大血管及微血管并發(fā)癥是導致2型糖尿病患者致死致殘的主要原因[2]，由于各個國家醫(yī)療支出和治療手段不平衡，給發(fā)達國家與發(fā)展中國家均造成巨大財政負擔[10]。糖尿病長期高血糖狀態(tài)會引起機體心臟、眼、腎臟、血管、神經(jīng)等組織器官和功能的慢性損傷。糖尿病和肥胖時，機體脂肪組織會發(fā)生病理性重構，主要表現(xiàn)為脂質蓄積、脂肪細胞肥大、脂肪細胞缺氧、壞死、凋亡，這一系列病理變化激活免疫相關細胞，并刺激脂肪組織分泌和表達炎癥因子，共同促進脂肪組織慢性炎癥狀態(tài)[3-5]。

細胞焦亡是一種由GSDMD介導的程序性細胞壞死，其特征是NLRP3炎癥小體和Caspase-1的激活，細胞膜孔的形成以及白細胞介素-1β和白細胞介素-18的釋放[9]。在肥胖癥中，脂肪細胞會發(fā)生肥大、缺氧或死亡，這可能導致脂肪組織發(fā)生嚴重功能障礙及胰島素敏感性受損。肥大的脂肪細胞可出現(xiàn)超微結構和生化的改變，包括膽固醇晶體、鈣聚集以及活性氧的形成，光鏡下可以觀察到絕大多數(shù)激活的巨噬細胞聚集在死亡脂肪細胞周圍形成冠狀結構。脂肪細胞這一變化可能觸發(fā)NLRP3炎癥小體，激活大量半胱氨酸蛋白酶-1，最終導致脂肪細胞死于焦亡[11]。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)高糖處理后心肌成纖維細胞焦亡水平較對照組明顯升高。Cheng等[13]研究證實高血糖狀態(tài)激活Caspase-11/4和GSDMD介導的焦亡并參與促細胞的損傷和丟失以及糖尿病腎病的發(fā)展。但是，鮮有研究報道糖尿病病理環(huán)境中，脂肪細胞是否發(fā)生焦亡以及炎癥水平變化。本研究結果發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)脂肪細胞高糖組GSDMD、NLRP3、IL-1β mRNA轉錄水平以及NLRP3、Caspase-1、IL-6蛋白表達水平較低糖組明顯增加。同樣，高糖組脂肪細胞LDH釋放水平及Annexin V-FITC染色細胞死亡率升高更顯著。該結果表明高糖暴露環(huán)境影響脂肪細胞正常生理狀態(tài)，且高糖暴露環(huán)境下脂肪細胞焦亡發(fā)生率升高，該過程可能進一步影響機體糖脂代謝水平，后續(xù)研究工作需進一步證實。

CXCL14是CXC趨化因子家族中的一種免疫細胞遷移調節(jié)劑，因其特殊的結構及生物學功能，具有潛在的獨特作用。多種組織中均有CXCL14 mRNA表達。CXCL14對未成熟樹突狀細胞和自然殺傷細胞的趨化作用可加強機體對惡性腫瘤的免疫屏障。惡性腫瘤組織中CXCL14表達水平下降可能導致腫瘤細胞逃脫機體免疫監(jiān)視作用[14]。Ignacio等[15]通過比較人類脂肪前體細胞和脂肪細胞的各趨化因子發(fā)現(xiàn)，CXCL14在脂肪細胞中升高最顯著，并且，相較于其他趨化因子，CXCL14在肥胖人群脂肪細胞中表達最突出。高脂飲食飼養(yǎng)的肥胖小鼠白色脂肪組織和骨骼肌中CXCL14表達上調，肥胖個體CXCL14的表達升高可能與游離脂肪酸水平增加、內質網(wǎng)應激和/或活性氧的增加有關。通過對高脂喂養(yǎng)的雌性CXCL14-/-肥胖小鼠研究發(fā)現(xiàn)，CXCL14主要通過招募巨噬細胞至內臟白色脂肪組織和部分抑制骨骼肌胰島素信號通路兩種途徑調節(jié)糖代謝，骨骼肌中CXCL14能促進白色脂肪組織巨噬細胞遷移，并參與調節(jié)葡萄糖代謝[16]。高脂飲食小鼠血漿CXCL14水平明顯降低并且與CXCL14表達基因受損有關。Cereijo等[17]通過滲透式微型泵方法使小鼠體內CXCL14處于正常水平時，證實CXCL14可以改善機體葡萄糖平衡，CXCL14通過選擇性激活非炎癥性巨噬細胞向脂肪組織聚集，從而有利于棕色脂肪活性以及促進白色脂肪棕色化，因此具有耐受胰島素抵抗和糖耐量異常的保護作用。脂肪組織中CXCL14表達與編碼促炎因子的基因的表達呈負相關，與參與糖代謝和胰島素敏感通路的基因成正相關[8]。CXCL14對脂肪細胞胰島素有增敏作用[6]。與之相矛盾的研究發(fā)現(xiàn)CXCL14也具有促糖尿病作用[18]。García-Beltran等[19]研究發(fā)現(xiàn)患有多囊卵巢綜合征的患者中CXCL14低水平狀態(tài)與由藥物誘導的胰島素敏感性增加有關。CXCL14表達水平可能是肥胖尤其是合并2型糖尿病患者的新型代謝標志物。故本研究以不同濃度CXCL14處理高糖暴露環(huán)境下的脂肪細胞，研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導脂肪細胞焦亡模型中，CXCL14可顯著增強3T3-L1細胞增殖活力。但是不同濃度CXCL14對高糖環(huán)境下脂肪細胞焦亡存在不同效應，不同于其他各組的促焦亡作用，50 nmol/L CXCL14處理組脂肪細胞焦亡水平呈明顯下調趨勢。故本研究選用50 nmol/L CXCL14處理脂肪細胞作用不同時間發(fā)現(xiàn)，50 nmol/L CXCL14干預后脂肪細胞焦亡相關指標蛋白水平下調，干預時間長短影響脂肪細胞焦亡相關蛋白的表達，干預12～24 h時蛋白表達水平下調最顯著。本研究結果表明適宜濃度CXCL14抑制高糖環(huán)境下脂肪細胞焦亡，CXCL14可能是保護脂肪細胞免受HG損傷的潛在靶標，CXCL14濃度及其活性的激活對于維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義，探究體內CXCL14有效濃度波動范圍、作用時間及CXCL14特異性受體對機體代謝影響十分重要，這將為治療糖尿病高糖所致機體代謝紊亂提供一個新的研究視角。

綜上所述，本研究證實，高糖暴露環(huán)境加重脂肪細胞焦亡及炎癥水平，CXCL14可影響高糖暴露環(huán)境中脂肪細胞的焦亡水平變化。CXCL14可以作為糖脂代謝調節(jié)的一個新生物標志物，研究其特異性受體及CXCL14濃度波動范圍將對開發(fā)新型抗肥胖和抗糖尿病藥物具有重要意義。目前CXCL14特異性受體尚不明確，CXCL14對脂肪細胞焦亡調控的具體機制仍有待進一步研究。