基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討牛膝-鉤藤藥對(duì)治療糖尿病合并高血壓的作用機(jī)制

喻詩(shī)雯，齊月

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110085； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能障礙為主要病理因素，常伴有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及碳水化合物代謝受損的慢性疾病[1]。高血壓是一種公認(rèn)的影響心血管、腎臟及外周動(dòng)脈系統(tǒng)的重要危險(xiǎn)因素[2]。兩種疾病關(guān)系密切，50%～80%的2型糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)高血壓，其中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)和交感神經(jīng)系統(tǒng)(sympathetic nervous system，SNS)的不適當(dāng)激活、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞外囊泡異常釋放(extracellular vesicles，EVs)和相關(guān)的microRNAs(miRs)及腸道微生物群和腎臟鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2)失調(diào)，逐漸成為胰島素抵抗和2型糖尿病誘發(fā)的高血壓發(fā)展的潛在機(jī)制[3]?！芭Ｏ?鉤藤”作為常用配伍藥對(duì)，廣泛應(yīng)用于糖尿病合并高血壓的治療[4]，二者均歸肝經(jīng)，在平肝、清肝的同時(shí)，又起到了補(bǔ)益肝腎、活血逐瘀的作用。同時(shí)牛膝、鉤藤也被證實(shí)有顯著的降血壓[5]、降血糖[6]效果。本研究從分子機(jī)制角度出發(fā)，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多成分、多靶點(diǎn)相互作用的特點(diǎn)為依據(jù)，與中醫(yī)辨證“整體”“統(tǒng)一”“關(guān)聯(lián)”的思維相契合[7]，挖掘牛膝-鉤藤藥對(duì)潛在活性成分，預(yù)測(cè)其治療糖尿病合并高血壓的靶點(diǎn)通路，從大數(shù)據(jù)分析層面總結(jié)出中藥治療糖尿病合并高血壓的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)檢索牛膝、鉤藤的化學(xué)成分，依據(jù)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)參數(shù)(absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME)，將口服生物利用度(oral availability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18作為篩選條件，獲得牛膝、鉤藤的活性成分。通過(guò)TCMSP預(yù)測(cè)牛膝、鉤藤活性成分的相關(guān)作用靶點(diǎn)，刪除未檢索出相關(guān)靶標(biāo)的化合物，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將所得靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用Cytoscape 3.7.2軟件將牛膝-鉤藤共同靶點(diǎn)與藥物活性成分進(jìn)行映射，獲得“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 疾病靶點(diǎn)和“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)的獲取以“diabetic mellitus”“hypertension”作為檢索詞，分別在人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)、人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards，https：//www.genecards.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//go.drugbank.com/)及療效藥靶數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)中篩選糖尿病、高血壓病的相關(guān)靶點(diǎn)，合并并刪除重復(fù)靶點(diǎn)后與活性成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，初步得到活性成分與疾病的交集靶點(diǎn)，即為牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的潛在作用靶點(diǎn)，并繪制“活性成分-疾病”交集靶點(diǎn)韋恩圖。

1.3 交集靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選將交集靶點(diǎn)輸入STRING在線分析平臺(tái)(https：//cn.string-db.org/)，交互分?jǐn)?shù)設(shè)定>0.4，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)關(guān)系，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。利用CentiScaPe 2.2插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，最終篩選出牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的潛在核心靶點(diǎn)。

1.4 富集分析采用基因注釋和資源分析數(shù)據(jù)庫(kù)(Metascape，https：//metascape.org/)對(duì)牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的潛在核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。其中，GO功能富集分析包括生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)及細(xì)胞組成(cell component，CC)。

1.5 “活性成分-核心靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建選取前30條主要參與的信號(hào)通路與核心靶點(diǎn)、藥物活性成分進(jìn)行映射，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 牛膝-鉤藤活性成分篩選結(jié)果通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出皂苷類、多糖類及甾酮類為牛膝主要活性成分；生物堿類物質(zhì)，包括鉤藤堿及異鉤藤等是鉤藤的主要活性成分。根據(jù)OB≥30%及DL≥0.18進(jìn)行篩選并刪除未檢索出相關(guān)靶標(biāo)的化合物，得到牛膝成分14個(gè)、鉤藤成分29個(gè)，相同活性成分3個(gè)。見表1。

表1 牛膝-鉤藤主要活性成分

2.2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過(guò)TCMSP平臺(tái)獲取46個(gè)活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，剔除各活性成分重復(fù)靶點(diǎn)與假陽(yáng)性靶點(diǎn)后，共篩選出牛膝-鉤藤活性成分作用靶點(diǎn)199個(gè)，將活性成分與作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，獲得“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。圖中共有244個(gè)節(jié)點(diǎn)、892條邊，節(jié)點(diǎn)表示藥物、活性成分、靶點(diǎn)，邊表示它們之間的相互作用關(guān)系，藍(lán)綠色正方形代表藥物，綠色、橙色、粉色正八邊形分別代表牛膝、鉤藤及共有活性成分，藍(lán)色菱形代表靶標(biāo)基因。在牛膝中，活性成分槲皮素對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目最多，為75個(gè)，其次為山奈酚、漢黃芩素。在鉤藤中，同樣為共有成分槲皮素、山奈酚對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目最多，其次為β-谷甾醇。該網(wǎng)絡(luò)可直觀地表現(xiàn)出牛膝-鉤藤藥對(duì)治療糖尿病合并高血壓是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)來(lái)取得成效，其中槲皮素和山奈酚可能是核心活性成分。見圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 疾病靶點(diǎn)篩選及韋恩圖的繪制通過(guò)OMIM、GeneCards、DrugBank及TTD數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索糖尿病及高血壓的靶基因，得到糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)909個(gè)，高血壓相關(guān)靶點(diǎn)906個(gè)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后，共得到糖尿病合并高血壓靶點(diǎn)1494個(gè)。利用韋恩圖在線繪制網(wǎng)站生成“活性成分-疾病”靶點(diǎn)韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)104個(gè)。見圖2。

圖2 “活性成分-疾病”靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖與核心靶點(diǎn)篩選利用STRING在線分析平臺(tái)，交互分?jǐn)?shù)設(shè)定>0.4，生成蛋白互作關(guān)系，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。圖中共有104個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 279條邊，節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示它們之間的相互作用關(guān)系。利用CentiScaPe 2.2插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，得出Degree值，以Degree值>24.59作為篩選條件，最終獲得牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的潛在核心靶點(diǎn)47個(gè)，包括白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα，AKT1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)等，這些靶蛋白可能是牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見圖3。

圖3 交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，設(shè)置P<0.01，最小計(jì)數(shù)為3，且富集因子>1.5，共得到生物過(guò)程(biological process，BP)1004條，主要包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等；分子功能(molecular function，MF)32條，主要包括轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合、蛋白激酶活性等；細(xì)胞組成(cell component，CC)84條，主要包括細(xì)胞膜上的膜筏、囊泡腔、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)等。KEGG通路富集分析得出153條信號(hào)通路，主要包括晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、叉頭框蛋白(Forkhead box O，F(xiàn)oxO)信號(hào)通路、磷酸肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/ AKT信號(hào)通路等。見圖4、圖5。

圖4 GO分析柱狀圖

圖5 前30位信號(hào)通路氣泡圖

2.6 “活性成分-核心靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建選取前30條主要參與的信號(hào)通路與核心靶點(diǎn)、藥物活性成分進(jìn)行映射，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。圖中共有120個(gè)節(jié)點(diǎn)、696條邊，節(jié)點(diǎn)表示藥物主要活性成分、信號(hào)通路、靶點(diǎn)、疾病，邊表示它們之間的相互作用關(guān)系，綠色正八邊形代表牛膝、鉤藤及共有活性成分，藍(lán)色倒三角形代表信號(hào)通路，黃色菱形代表核心靶點(diǎn)，粉色正方形代表疾病。由此可清晰看出，牛膝-鉤藤藥對(duì)是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)影響TNF、IL-17等信號(hào)通路干預(yù)并治療糖尿病合并高血壓。見圖6。

圖6 “活性成分-核心靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病與高血壓往往互相為患，因先天之精虧虛、飲食不節(jié)、憂思煩勞而致陰虛耗氣、耗液，日久累及腎臟，氣陰兩傷，陰虛火旺，消渴先發(fā)為病，繼而虛火上蒸肺胃，耗傷肝腎精血，則引動(dòng)少陽(yáng)相火亢逆，累及脾胃，則煉液成痰，上至頭目，則引發(fā)頭暈?zāi)垦５劝Y狀。久而久之，陰陽(yáng)兩虛而致浮陽(yáng)上擾，最終導(dǎo)致消渴間雜眩暈更為遷延難愈[8]。牛膝具有補(bǔ)益肝腎、祛瘀通絡(luò)的功效，而其引血下行之功對(duì)陰虛陽(yáng)亢型高血壓病有獨(dú)特療效[9]。鉤藤為清熱平肝之良藥，其常用組方天麻鉤藤飲是當(dāng)前中醫(yī)治療肝陽(yáng)上亢型高血壓病的經(jīng)典名方[10]。因此，兩藥相伍治療糖尿病合并高血壓共奏“清上引下”之效，既治肝陽(yáng)上亢之標(biāo)，又治陰虛火旺之本。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，牛膝中含豐富的三萜化合物，其中主要為牛膝皂苷類及多糖類[11]。牛膝總皂苷(achyranthes bidentata saponin，ABS)通過(guò)其抑制促炎因子的作用，在治療腰、膝關(guān)節(jié)炎癥方面應(yīng)用廣泛[12-13]。牛膝多糖(achyranthes bidentata polysaccharide，ABP)聯(lián)合牛膝甾酮皂苷可對(duì)軟骨細(xì)胞損傷產(chǎn)生增益作用，對(duì)抗骨質(zhì)疏松[14]。同時(shí)經(jīng)ABP處理小鼠細(xì)胞24 h后，IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著增加，表明ABP可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及一氧化氮(nitric oxide，NO)，達(dá)到舒張血管、保護(hù)內(nèi)皮功能的作用[15]。鉤藤總生物堿(rhynchophylla total alkaloid，RTA)是鉤藤的主要活性成分[16]，研究表明，自噬可防止細(xì)胞凋亡，RTA可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬，減少低密度脂蛋白(oxidation of LDL，ox-LDL)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)累積，減輕氧化損傷，并增加自發(fā)性高血壓模型大鼠血清中的NO含量和主動(dòng)脈中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達(dá)從而改善內(nèi)皮血管舒張。同時(shí)，研究顯示，RTA可顯著上調(diào)p-AMPK(Thr-172)的表達(dá)，表明RTA對(duì)自噬的促進(jìn)作用導(dǎo)致腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)的激活，而AMPK的激活又可通過(guò)增加eNOS表達(dá)和促進(jìn)NO產(chǎn)生來(lái)改善內(nèi)皮功能[17]。

本研究篩選出牛膝-鉤藤藥對(duì)的主要活性成分為槲皮素、山奈酚、漢黃芩素以及β-谷甾醇等，其治療糖尿病合并高血壓的核心靶點(diǎn)主要為IL-6、AKT1、TNF、VEGFA及MAPK3等。研究表明，胰島素抵抗與脂肪組織代謝及慢性低度炎癥密切相關(guān)，脂肪組織、骨骼肌中的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和IL-6，以及促炎酶，如環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的水平升高，會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)展[18-19]。槲皮素可降低TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2的基因表達(dá)水平，抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)的激活和c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的產(chǎn)生并升高脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein1，UCP1)的水平，上調(diào)AMPK磷酸化和沉默信息調(diào)節(jié)劑(sirtuin1，Sirt1)的表達(dá)，以此減少脂肪組織的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，降低促炎介質(zhì)的水平，改善胰島素抵抗[20]。槲皮素還通過(guò)與抗氧化酶相互作用，如血紅素加氧酶-1(heme oxygenase，HO-1)，保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和線粒體功能障礙[21]，同時(shí)槲皮素也可通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬，促進(jìn)NO的產(chǎn)生，在高血壓中發(fā)揮抗感染、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用[22]。山奈酚也叫黃酮醇，研究證實(shí)，山奈酚可抑制炎癥因子的表達(dá)和高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生[23]。晚期糖基化終產(chǎn)物參與了包括心臟在內(nèi)的各種器官的糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，而山奈酚可抑制AGEs-RAGE的激活并通過(guò)參與維持血流動(dòng)力學(xué)功能，維持氧化劑抗氧化狀態(tài)，減少炎癥和細(xì)胞凋亡，顯著改善胰島素抵抗誘導(dǎo)的心肌損傷[24]。VEGF通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能，提高腎小球毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成，從而影響糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)和糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)等微血管并發(fā)癥的發(fā)展。山奈酚可以通過(guò)降低VEGFR-2蛋白水平和激酶活性及其下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[如PI3K/AKT、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，MEK/ERK)]，觸發(fā)VEGF刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的抗血管生成活性[25]。漢黃芩素也是一種黃酮類化合物，研究表明，漢黃芩素可下調(diào)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β表達(dá)，并減少其釋放以降低神經(jīng)細(xì)胞毒性，同時(shí)抑制 MCP-1在人體內(nèi)的表達(dá)，從而減緩DN進(jìn)行性腎小管間質(zhì)病變和腎臟炎癥，其潛在機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/Smad蛋白3(transforming growth factor-beta1/Smad protein3，TGF-β1/Smad3)信號(hào)通路來(lái)改善DN中的腎臟炎癥和纖維化[26]。此外，通過(guò)抑制PI3K/AKT/NF-κB通路可有效抑制高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和自噬功能障礙[27]。漢黃芩素還可通過(guò)干擾細(xì)胞外Ca2+流入和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+的能力，誘導(dǎo)內(nèi)皮非依賴性血管舒張[28]。研究表明，β-谷甾醇-3-O-D-吡喃葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-D-glucopyranoside，BSD)具有雌激素活性，增強(qiáng)了PI3K介導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)的易位，刺激骨骼肌細(xì)胞中的葡萄糖利用[29]。高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠給予β-谷甾醇后，可通過(guò)增加NO水平促進(jìn)胰島素敏感性，并且還通過(guò)降低肝臟中的氧化、亞硝化應(yīng)激和脂質(zhì)累積而發(fā)揮保護(hù)作用[30]。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，AGE-RAGE、TNF、IL-17、MAPK、FoxO、PI3K-AKT等通路與糖尿病合并高血壓高度相關(guān)。AGE-RAGE軸與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[31]。AGE通過(guò)與AGE受體RAGE結(jié)合，改變先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，通過(guò)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子、ROS和活性氮中間體(reactive nitrogen intermediates，RNI) 在免疫相關(guān)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)炎癥和纖維化信號(hào)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞和腎系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致各種組織和器官發(fā)生纖維化[32]。胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)受到氧化還原敏感性絲氨酸激酶如JNK和ERK-1的激活，導(dǎo)致其絲氨酸磷酸化，磷酸化的IRS-1通過(guò)與PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，誘導(dǎo)PI3K脂質(zhì)激酶的激活。活化的PI3K繼續(xù)轉(zhuǎn)換并激活3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，PDK1)，使AKT2磷酸化。AKT是GLUT4由囊泡向細(xì)胞膜易位的重要調(diào)節(jié)劑，當(dāng)發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，PI3K/AKT通路調(diào)控障礙，GLUT4向膜的易位減少，導(dǎo)致外周組織葡萄糖代謝受損和胰島素介導(dǎo)的NO合成減少，這可能是糖尿病內(nèi)皮功能障礙(以及由此產(chǎn)生高血壓)的主要原因。研究表明，牛膝提取物(achyranthes bidentata extracts，ABE)可通過(guò)下調(diào)AKT2和GLUT1的mRNA表達(dá)，上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)及胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，從而激活MAPK信號(hào)通路并抑制AKT信號(hào)通路，以減少糖酵解[33]。

IL-17蛋白通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞因子和細(xì)胞外蛋白的誘導(dǎo)作用，在調(diào)節(jié)銀屑病、多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性疾病中發(fā)揮積極作用。IL-17信號(hào)通過(guò)NF-κB激活炎癥轉(zhuǎn)錄因子以誘導(dǎo)基因表達(dá)并激活MAPK通路(p38、ERK、JNK)[34]。IL-17A可直接誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡并局部增加細(xì)胞因子和趨化因子，加重胰島炎癥，也可能觸發(fā)MIN6β細(xì)胞系中iNOSmRNA和iNOS蛋白質(zhì)表達(dá)的上調(diào)，并導(dǎo)致NO依賴性毒性。因此，減少IL-17A分泌或阻斷IL-17A與受體相互作用的藥物可能具有治療1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)的功效[35]。IL-17通過(guò)正向調(diào)節(jié)IL-6的表達(dá)，增強(qiáng)NF-κB信號(hào)激活，從而激活包括TGF-β1及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在內(nèi)的腎臟纖維化基因，加重腎損傷[36]。目前，IL-17在高血壓中的作用仍然存在爭(zhēng)議，其中可能引起高血壓的原因是IL-17可上調(diào)腎小管中的轉(zhuǎn)運(yùn)通道[37]。

FoxO的過(guò)度激活與高血糖、高三酰甘油血癥和胰島素抵抗有關(guān)。FoxO在代謝活躍的細(xì)胞(例如肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)中高度表達(dá)，調(diào)節(jié)參與脂肪細(xì)胞分化、氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)代謝以及在低能量攝入條件下誘導(dǎo)糖異生的基因的轉(zhuǎn)錄。在饑餓狀態(tài)下，F(xiàn)oxO可增加脂肪細(xì)胞中ROS水平，決定線粒體抗應(yīng)激反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，作為營(yíng)養(yǎng)傳感器通過(guò)核質(zhì)穿梭響應(yīng)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，是新陳代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。當(dāng)細(xì)胞在正常條件下生長(zhǎng)時(shí)，F(xiàn)oxO是不活躍的，這需要通過(guò)胰島素和生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，二者通過(guò)胰島素受體、胰島素受體底物和PI3K發(fā)出信號(hào)并激活PDK1和AKT?；罨腁KT可以通過(guò)三個(gè)保守殘基的磷酸化，進(jìn)而抑制下游轉(zhuǎn)錄因子FoxO轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致FoxO的細(xì)胞質(zhì)保留。細(xì)胞應(yīng)激后，特別是當(dāng)產(chǎn)生高水平的活性氧時(shí)，F(xiàn)oxO以相反的方式轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)錄活性[38]。研究指出，F(xiàn)oxO6亞型可通過(guò)激活NF-κB通路，改善高糖高脂血管內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素抵抗[39]。

綜上所述，牛膝-鉤藤藥對(duì)可能以槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇為主要核心成分，作用于IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MAPK3等核心靶點(diǎn)，通過(guò)參與調(diào)控脂質(zhì)、細(xì)胞因子、活性氧活性及炎癥反應(yīng)等生物過(guò)程，介導(dǎo)AGE-RAGE、TNF、IL-17、MAPK、FoxO、PI3K-AKT等關(guān)鍵通路，起到治療糖尿病合并高血壓的作用。從微觀作用到宏觀協(xié)同，本研究證明了牛膝-鉤藤藥對(duì)治療糖尿病合并高血壓多成分、多靶點(diǎn)、多過(guò)程的分子機(jī)制，為深入研究牛膝-鉤藤藥對(duì)治療糖尿病合并高血壓的藥理學(xué)機(jī)制提供依據(jù)。