肝癌組織TPX2、TUFT1、Vimentin表達與癌細胞惡性生物學(xué)行為的關(guān)系及預(yù)測遠處轉(zhuǎn)移的價值研究*

流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝癌發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第4位，病死率居第3位，而中國每年死于原發(fā)性肝癌約為11～13萬人，超過全球肝癌死亡人數(shù)的50.0%

。外科手術(shù)、放化療等綜合治療手段是現(xiàn)階段臨床治療肝癌的主要方法，但癌細胞遠處轉(zhuǎn)移仍是患者死亡的主要原因

。因此，積極探索肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)測肝癌遠處轉(zhuǎn)移的新標(biāo)志物是目前臨床研究熱點問題。相關(guān)研究認(rèn)為

，癌細胞遠處轉(zhuǎn)移與B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、survivin、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)等細胞凋亡因子有關(guān)。同時，爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白2靶蛋白(TPX2)作為一種核增殖微管相關(guān)蛋白，在乳腺癌中出現(xiàn)過度高表達

，其在肝癌進程中的作用及潛在分子機制尚未完全明確。釉叢蛋白1(TUFT1)在細胞外釉質(zhì)生長、成熟中發(fā)揮重要作用

，而其在肝癌遠處轉(zhuǎn)移中的作用機制鮮有研究。波形蛋白(Vimentin)是中間纖維主要組成部分，也是一種信號分子與轉(zhuǎn)錄因子，已被證實參與癌癥發(fā)生、遠處轉(zhuǎn)移過程

，但關(guān)于其與癌細胞惡性生物學(xué)行為的關(guān)系及聯(lián)合TPX2、TUFT1對肝癌遠處轉(zhuǎn)移的預(yù)測效能報道較少。因此，本研究首次探討肝癌組織TPX2、TUFT1、Vimentin表達與癌細胞惡性生物學(xué)行為的關(guān)系及預(yù)測遠處轉(zhuǎn)移的價值。報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年4月我院收治的51例肝癌遠處轉(zhuǎn)移患者為觀察組(TxNxM1)及同時期51例肝癌無遠處轉(zhuǎn)移患者為對照組(TxNxM0)。對納入患者的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒史、吸煙史、合并疾病、腫瘤T、N分期、分化程度等進行信息采集。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①兩組患者均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》

中肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)手術(shù)組織病理診斷學(xué)確診；②兩組患者臨床資料完整，卡氏功能狀態(tài)量表評分≥70分；③對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性肝癌或伴有其他部位腫瘤者；②肝外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；③嚴(yán)重心腦肺腎功能不全者；④預(yù)計總生存期<3個月者；⑤凝血機制紊亂或活動性出血者；⑥嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙或精神行為異常者。

本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較兩組患者一般資料、TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白表達情況。②分析TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白之間的相關(guān)性。③比較兩組癌細胞惡性生物學(xué)行為指標(biāo)，即Bcl-2 mRNA、survivin mRNA、Bax mRNA、caspase-3 mRNA。④分析TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白與癌細胞惡性生物學(xué)行為指標(biāo)(Bcl-2 mRNA、survivin mRNA、Bax mRNA、caspase-3 mRNA)的關(guān)系。⑤分析TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白與病理特征的關(guān)系。⑥分析TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白對肝癌遠處轉(zhuǎn)移的預(yù)測效能。

根據(jù)中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2329-2009對上述防曬劑進行雞胚絨毛尿囊膜試驗，結(jié)果見表2。

（三）病理變化 對死亡羊只進行剖檢，該羊消瘦、眼結(jié)膜蒼白，顯貧血癥狀，唇內(nèi)及外陰口各有兩個丘疹；心肝未見明顯病變。肺微紅、無彈性，有一處淤血，兩側(cè)腎上有大量壞死灶，前胃及四胃上有少許硬實的結(jié)節(jié)單個存在；腸系膜淋巴結(jié)微腫、發(fā)白，其余未見明顯示病癥狀。

2.5 TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白與病理特征的相關(guān)性 TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白與腫瘤T、N分期呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)(

<0.05)。見表5。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 見表2。兩組患者年齡49～78歲，組間年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒史、吸煙史、合并疾病比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

>0.05)。觀察組患者與對照組腫瘤T、N分期、分化程度比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

<0.05)。

為確保整個系統(tǒng)的可靠運行，MES系統(tǒng)采用控制和信息分流的設(shè)計理念，負(fù)責(zé)整個工藝設(shè)備運行和邏輯控制的PLC僅作控制使用，而RFID設(shè)備則采用獨立的PLC來進行標(biāo)簽數(shù)據(jù)的讀取和寫入，與此同時，該項目中采用PROFINET總線網(wǎng)絡(luò)，將各個讀取站點的RFID設(shè)備進行組網(wǎng)，并與PLC進行組態(tài)通訊，由MES服務(wù)器通過PLC獲取相關(guān)信息。

鑒于中國鄉(xiāng)村特殊的歷史背景和社會結(jié)構(gòu)，以及價值觀念被基層腐敗和黑惡勢力腐蝕的現(xiàn)實，鄉(xiāng)村道德體系的修復(fù)、完善，在倡導(dǎo)初級階段社會主義主流價值觀的同時，應(yīng)重點強調(diào)以下幾點。

青花紋樣是我國陶瓷器具中最為著名的紋樣之一，江西四特集團則將這一紋樣應(yīng)用到其酒類器具的外包裝之上，通過與酒容器的有效結(jié)合，這樣的形式在消費者中受到了極大程度的歡迎，該集團的產(chǎn)品在市場上也取得了非常好的銷售效果。另一方面，由于青花瓷紋樣在世界范圍內(nèi)非常著名，因此，四特集團的酒類產(chǎn)品在東南亞、澳大利亞等地也同樣取得了非常好的銷售成果。與之類似的，衡水老白干52度十年陳釀使用了元青花中的卷草紋作為裝飾圖案，卷草紋自身所具備的清新淡雅的特點很好的表現(xiàn)出了這種酒自身的特點，進而在市場上得到了消費者的認(rèn)可。

2.4 TPX2 mRNA、TUFT1、Vimentin與癌細胞惡性生物學(xué)行為指標(biāo)的相關(guān)性 TPX2 mRNA與Bcl-2 mRNA(

=0.674，

<0.001)、survivin mRNA(

=0.656，

<0.001)呈正相關(guān)，與Bax mRNA(

=-0.688，

<0.001)、caspase-3 mRNA(

=-0.789，

<0.001)呈負(fù)相關(guān)；TUFT1與Bcl-2 mRNA(

=0.531，

<0.001)、survivin mRNA(

=0.699，

<0.001)呈正相關(guān)，與Bax mRNA(

=-0.627，

<0.001)、caspase-3 mRNA(

=-0.742，

<0.001)呈負(fù)相關(guān)；Vimentin與Bcl-2 mRNA(

=0.597，

<0.001)、survivin mRNA(

=0.692，

<0.001)呈正相關(guān)，與Bax mRNA(

=-0.615，

<0.001)、caspase-3 mRNA(

=-0.676，

<0.001)呈負(fù)相關(guān)。

1.4 檢測方法 ①儀器與試劑盒：Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自上海海方生物技術(shù)有限公司；兔抗人單克隆抗體TUFTI、Vimentin、過碘酸-雪夫(PAS)染色液均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；枸櫞酸鈉、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、蘇木精、免疫組織化學(xué)試劑盒均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。②TPX2 mRNA、癌細胞惡性生物學(xué)行為指標(biāo)：取手術(shù)切除的距腫瘤邊緣1 cm以內(nèi)且無壞死的腫瘤組織作為標(biāo)本，采用實時熒光定量PCR對肝癌組織TPX2 mRNA、Bcl-2 mRNA、survivin mRNA、Bax mRNA、caspase-3 mRNA進行檢測，TPX2、Bcl-2、survivin、Bax、caspase-3引物見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s、95℃變性5 s、60℃退火延伸64 s，共40個循環(huán)。擴增結(jié)束后制作熔解曲線。2

法計算TPX2 mRNA、Bcl-2 mRNA、survivin mRNA、Bax mRNA、caspase-3 mRNA的相對表達量。③TUFT1和Vimentin蛋白表達：取手術(shù)切除的距腫瘤邊緣1 cm以內(nèi)且無壞死的腫瘤組織作為標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)檢測肝癌組織TUFT1和Vimentin蛋白表達，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。TUFT1抗體、Vimentin抗體均以1∶50稀釋，4℃過夜，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，添加第二抗體，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封固。結(jié)果判定：TUFT1、Vimentin陽性染色主要表現(xiàn)為細胞質(zhì)與細胞膜顯示棕黃色信號。同一切片根據(jù)染色強度分級分為無染色計0分，輕度染色計1分，中度染色計2分，強染色計3分；根據(jù)細胞染色比率為0計0分，1%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：二者相加≥4分者為陽性。

2.3 兩組患者癌細胞惡性生物學(xué)行為指標(biāo) 觀察組患者Bcl-2 mRNA、survivin mRNA高于對照組，Bax mRNA、caspase-3 mRNA低于對照組(

<0.05)。見表4。

2.2 兩組患者肝癌組織TPX2 mRNA、TUFT1和Vimentin蛋白表達及相關(guān)性分析 觀察組TPX2 mRNA、TUFT1和Vimentin蛋白表達高于對照組(

<0.05)。見表3，圖1、2。相關(guān)性分析顯示TPX2 mRNA與TUFT1蛋白(

=0.800，

<0.001)、Vimentin蛋白(

=0.873，

<0.001)呈正相關(guān)，TUFT1蛋白與Vimentin蛋白呈正相關(guān)(

=0.676，

<0.001)。

2.6 TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白預(yù)測遠處轉(zhuǎn)移的ROC曲線 單一指標(biāo)中，TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白預(yù)測遠處轉(zhuǎn)移的AUC分別為0.762(0.667～0.857)、0.835(0.758～0.912)、0.840(0.763～0.916)；各指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測遠處轉(zhuǎn)移的AUC為0.932(0.885～0.978)，大于單一預(yù)測，見圖3。

3 討論

近期多項研究證實，癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)化是誘導(dǎo)惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素

。黃丹紅等

研究已證實，TPX2通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控肝癌細胞增殖及凋亡，有望成為肝癌治療的潛在靶點。但關(guān)于肝癌組織TPX2在肝癌遠處轉(zhuǎn)移中的作用尚需研究進一步論證。本研究采用實時熒光定量PCR法檢測表明，肝癌遠處轉(zhuǎn)移患者TPX2 mRNA過度上調(diào)，結(jié)合白國民等

研究考慮這可能是由于TPX2上調(diào)，可刺激細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶表達，進而促進腫瘤細胞侵襲及遷移。推測阻斷TPX2表達可能是肝癌遠處轉(zhuǎn)移治療的潛在靶點。另有文獻稱

，TPX2作為一種癌基因參與上皮細胞癌變的過程，并對癌細胞增殖、分化及生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響。本研究顯示，隨肝癌遠處轉(zhuǎn)移患者Bax mRNA、caspase-3 mRNA下降、Bcl-2 mRNA、survivin mRNA升高，TPX2 mRNA表達明顯上升，可能與TPX2通過刺激Caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡有關(guān)

。

Vimentin是一種在間質(zhì)中表達的Ⅲ型中間絲蛋白，在上皮來源的惡性腫瘤組織或癌細胞株中過度表達

。本研究經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測可知，Vimentin在肝癌遠處轉(zhuǎn)移患者中呈異常高表達狀態(tài)，并與腫瘤T、N分期、分化程度存在一定關(guān)系，考慮可能與Vimentin在癌細胞EMT過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用有關(guān)，一定程度可增強癌細胞運動能力，提高癌細胞侵襲能力，誘導(dǎo)癌細胞向惡性程度更高的細胞表型轉(zhuǎn)化，進而導(dǎo)致腫瘤局部復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移

。同時，細胞凋亡是一個由原癌基因、抑癌基因等多基因共同調(diào)控的復(fù)雜過程

。其中凋亡基因Bcl-2、Bax比值對細胞凋亡信號啟動具有調(diào)控作用，其比值失衡會增強癌基因活性

；survivin為凋亡抑制因子，具有促進癌細胞分裂與抑制細胞凋亡的雙重作用

；caspase-3活化是細胞凋亡途徑的重要信號分子

。通過Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Vimentin與Bcl-2 mRNA、survivin mRNA均存在正相關(guān)性，與Bax mRNA、caspase-3 mRNA均存在負(fù)相關(guān)性，這可能歸因于Vimentin一方面通過與p53蛋白形成復(fù)合體，有效阻斷p53蛋白抗細胞凋亡作用；另一方面通過結(jié)合14-3-3調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)控信號分子活性，抑制caspase-3、Bax等凋亡抑制因子表達增多，拮抗細胞凋亡

。

TUFTl在癌組織中呈高表達，可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期有關(guān)，參與間充質(zhì)干細胞的某些功能，影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達

。本研究結(jié)果表明，隨肝癌患者腫瘤T、N分期增加、分化程度降低、遠處轉(zhuǎn)移，TUFTl表達出現(xiàn)過度上調(diào)，結(jié)合李珍杰等

觀點認(rèn)為其機制可能與TUFT1通過與Rab蛋白GTP酶激活蛋白1相互作用，異常增殖癌細胞，并通過調(diào)控雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1信號通路，加快惡性腫瘤生長與轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。同時，Dou C等

研究還顯示，TUFT1不僅在多種惡性腫瘤組織中具有差異性表達，還參與惡性腫瘤生物學(xué)行為，支持本研究觀點，TUFT1高表達可上調(diào)HIF1、Snail、Vimentin等蛋白表達，調(diào)控癌細胞EMT過程，并通過磷酸化蛋白激酶B(Akt)-磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和Akt-磷酸化糖原合成酶3p信號傳導(dǎo)，影響肝癌細胞凋亡

。本研究還發(fā)現(xiàn)，TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白之間存在正相關(guān)性，提示TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白可能通過調(diào)控EMT表達，在肝癌發(fā)生發(fā)展及遠處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用。最后，本研究選取聯(lián)合預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)TPX2、TUFT1、Vimentin聯(lián)合預(yù)測肝癌遠處轉(zhuǎn)移AUC大于上述指標(biāo)單一預(yù)測。有力佐證了早期聯(lián)合檢測TPX2、TUFT1、Vimentin，有望為臨床預(yù)測肝癌遠處轉(zhuǎn)移、實施個性化治療手段提供有效輔助手段。

綜上可知，肝癌組織TPX2、TUFT1、Vimentin表達與癌細胞惡性生物學(xué)行為存在一定相關(guān)性，早期采用三者聯(lián)合檢測方式，有望成為臨床預(yù)測肝癌遠處轉(zhuǎn)移、制定恰當(dāng)治療方案的新途徑。

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