靈芝多糖對(duì)肝纖維化小鼠肝損傷及免疫功能的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

肝纖維化是一種可逆的動(dòng)態(tài)性創(chuàng)傷-修復(fù)反應(yīng)，若不及時(shí)干預(yù)，可持續(xù)進(jìn)展為假小葉、肝結(jié)節(jié)，造成肝硬化，甚至引發(fā)肝癌

。肝纖維化損傷還可影響機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫功能，引發(fā)免疫功能失調(diào)，而免疫功能異常改變可加重肝組織損傷，形成惡性循環(huán)

。因此，臨床探尋肝纖維化有效逆轉(zhuǎn)或控制方法，已成為研究熱點(diǎn)之一。有研究認(rèn)為肝纖維化主要是因濕、熱、毒、郁、虛等因素引發(fā)肝功能損傷所致

。靈芝為我國傳統(tǒng)中藥之一，可補(bǔ)氣安神、保肝解毒、補(bǔ)養(yǎng)氣血，靈芝多糖為靈芝主要活性成分，具有保肝解毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抑制血管新生等作用，且對(duì)多種有毒物質(zhì)、免疫、缺血、缺氧等所致肝損傷有保護(hù)作用

。本研究分析了靈芝多糖對(duì)肝纖維化小鼠肝損傷、免疫功能的影響并探討其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只ICR成年健康雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量25～30 g，購自北京科興生物制品有限公司(許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0053)。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，清潔級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，溫度(24±2)℃，濕度50%～65%，普通飼料、自來水喂養(yǎng)，自然光照。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物處置符合“3R”原則。

1.2 藥物、試劑和儀器 靈芝多糖(純度，沈陽恩世制藥有限公司)，無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族(Wnt)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路激活劑SKL2001(徐州天鴻化工有限公司)。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(TBil)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)，蘇木精-伊紅(HE)試劑盒(賽默飛世爾科技公司)，兔抗小鼠Wnt1/3a/10、β-catenin、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)一抗及山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司)。Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)，光學(xué)顯微鏡(日本尼康株式會(huì)社)，DXC800全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 模型制備及分組 60只小鼠中隨機(jī)取10只作為A組，另50只建立肝纖維化小鼠模型

：以40% 四氯化碳、石蠟油混合液皮下注射，首次注射量根據(jù)5 ml/kg體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，自第2次開始以3 ml/kg體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，每隔4天注射1次，連續(xù)4周。建模成功標(biāo)準(zhǔn)

：建模4周后出現(xiàn)體質(zhì)量下降、毛色黯淡、食欲減少、反應(yīng)遲鈍、萎靡不振等表現(xiàn)，血清AST、ALT、TBil水平高于A組(

<0.05)，鏡下顯示肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞變性、壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤，伴假小葉形成。實(shí)驗(yàn)后證實(shí)，50只小鼠建模成功46只，B組、C組、D組、E組各納入11、11、12、12只。A組以等量生理鹽水皮下注射，10只小鼠均納入研究。

2.3.3 母血及臍血血脂水平與妊娠指標(biāo)的相關(guān)性分析 母血與臍血TG、TC水平均與新生兒出生體質(zhì)量、身長、頭圍、胎盤重量等呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，而LDL-C與HDL-C水平與妊娠指標(biāo)無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表7、表8。

2.5 各組小鼠肝組織纖維化程度 Masson染色顯示，A組小鼠肝組織內(nèi)小葉結(jié)構(gòu)無異常，肝細(xì)胞周圍存在少量排列較整齊膠原纖維。B組、C組肝小鼠小葉破壞較嚴(yán)重，肝實(shí)質(zhì)、中央靜脈及匯管區(qū)纖維組織增生明顯，存在大量膠原沉積，部分形成假小葉，其中B組異常改變更明顯。與B組、C組比較，D組、E組小鼠肝組織內(nèi)小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，纖維結(jié)締組織增生、膠原纖維沉積減少，其中E組改善更顯著，見圖2。

1.4 動(dòng)物給藥 建模成功后24 h給藥。E組以1.0 ml/kg靈芝多糖溶液灌胃，D組以1.0 ml/kg 靈芝多糖、20 μmol/L SKL2001混合液灌胃，B組以20 μmol/L Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑SKL2001溶液灌胃，灌胃體積均為10 ml/kg。A組、C組以同體積生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)灌胃6周。

1.5 標(biāo)本采集及處理 完成腹主動(dòng)脈血抽取后，小鼠麻醉未清醒前，斷頭處死，摘取1 cm

大小肝臟組織，以生理鹽水沖洗干凈，分為4份，其中2份置于4%多聚甲醛固定，2份置于液氮保存。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) ①小鼠末次治療后稱重，記錄體質(zhì)量。完成體質(zhì)量檢測(cè)后，檢測(cè)血清AST、ALT、TBil水平，按照儀器及試劑盒使用說明書操作。②ELISA法檢測(cè)IL-2、IFN-γ、TNF-α水平，根據(jù)試劑盒使用說明書嚴(yán)格完成相關(guān)操作。③Masson染色法檢測(cè)肝纖維化程度。取1份4%多聚甲醛固定肝臟組織，流水沖洗1 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明。軟石蠟浸蠟1 h，包埋，切片，厚度5 μm。切片平置于載玻片，60℃烘箱烘烤30 min。梯度酒精脫蠟，清水、蒸餾水沖洗。蘇木精染核，10 min。1%鹽酸酒精分化。醋酸液清洗30 s，入亮綠染色液，染色5 min。醋酸水溶液分化，30 s。酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。④HE染色法檢測(cè)肝臟組織病理形態(tài)學(xué)。取1份4%多聚甲醛固定肝臟組織，流水沖洗1 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明。石蠟包埋，切片，厚度4 μm，60℃烘箱內(nèi)烘烤30 min。二甲苯透明，梯度酒精脫蠟，蒸餾水洗凈。蘇木精染色，5 min。1%鹽酸酒精分化，流水沖洗30 min。伊紅染色，梯度酒精脫蠟，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察并記錄肝臟組織病理形態(tài)學(xué)變化。⑤采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Wnt1、Wnt3a、Wnt10、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量。取1份液氮保存肝組織，PBS液沖洗，重復(fù)2次。冰上裂解，30 min。4℃，12 000 r/min離心，離心半徑8 cm，10 min，取上清液?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，加2×上樣緩沖液，沸水浴變性10 min。10% SDS-PAGE凝膠，蛋白分離，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉，1 h。加入兔抗小鼠Wnt1、Wnt3a、Wnt10、β-catenin、Cyclin D1(1∶1 000)一抗，4℃搖床孵育，過夜。TBST洗膜，每次10 min，重復(fù)4次。加山羊抗兔IgG二抗(1∶2 500)，室溫，孵育2 h。TBST洗膜，每次10 min，重復(fù)4次。加ECL試劑，成像儀曝光成像。目的蛋白表達(dá)=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值比值。

2.4 各組小鼠Wnt1、Wnt3a、Wnt10、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量 見圖1、表4。

2 結(jié)果

2.6 各組小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué) HE染色顯示，A組小鼠肝臟細(xì)胞排列整齊，大小均勻，形態(tài)正常，無變性、壞死，小葉結(jié)構(gòu)無異常。B組、C組小鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞變性、壞死，伴空泡樣改變，小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)存在大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織異常增生，假小葉形成。與B組、C組比較，D組、E組小鼠肝細(xì)胞壞死、小葉結(jié)構(gòu)破壞程度減輕，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生減少，其中E組改善更顯著，見圖3。

如果南水北調(diào)工程供水不計(jì)所得稅，則上述等式可簡化為：工程供水價(jià)-變動(dòng)成本=（固定成本+稅后利潤）/供水量，即：

2.3 各組小鼠IL-2、IFN-γ、TNF-α水平 見表3。

2.2.1 CGF促進(jìn)牙周組織、牙髓組織再生機(jī)制 無論是牙周組織、牙髓組織再生同樣都需要干細(xì)胞、生長因子和生長支架。CGF提供了大量的生長因子和理想的3D立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些生長因子不僅能調(diào)節(jié)骨組織中的細(xì)胞，還能調(diào)節(jié)牙周、牙髓干細(xì)胞向其受損處遷徙和分化，誘導(dǎo)干細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)組織的再生[22]。細(xì)胞堿性磷酸酶的活性對(duì)牙周膜干細(xì)胞的分化能力呈正相關(guān)，同時(shí)，堿性磷酸酶還參與了牙體組織的構(gòu)建。堿性磷酸酶活性的增加是牙本質(zhì)、牙髓形成的標(biāo)志[23]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[24]，CGF可以增強(qiáng)堿性磷酸酶的活性，從而促進(jìn)牙周組織、牙髓組織和軟組織的再生。

②灌溉水有效利用系數(shù)：大型灌區(qū)不低于0.50，中型灌區(qū)不低于0.60，小型灌區(qū)不低于0.70，井灌區(qū)不低于0.85，噴微灌區(qū)不低于0.90，滴灌區(qū)不低于0.95。

2.2 各組小鼠AST、ALT、TBil水平比較 見表2。

2.1 各組小鼠體質(zhì)量比較 見表1。

3 討論

肝纖維化主要是機(jī)體肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度增生、沉積所致肝臟結(jié)構(gòu)、功能病理改變，具有一定可逆性，但若不及時(shí)干預(yù)，可逐漸進(jìn)展為肝硬化，甚至肝癌

。研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能異常改變是引發(fā)肝組織損傷的一個(gè)重要因素，故需在肝纖維化治療期間加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)

。肝纖維化形成過程受較多靶點(diǎn)影響，故單一靶點(diǎn)藥物較難發(fā)揮理想效果，目前尚無十分有效的西藥。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝纖維化根據(jù)癥狀體征可納入“癥積”“脅痛”“臌脹”等范疇

，主要病理因素包括虛、熱、濕、毒、瘀等。肝纖維化臨床無特異性，辨證復(fù)雜，尚無統(tǒng)一分型標(biāo)準(zhǔn)，考慮到該病為多種慢性肝病長期發(fā)展結(jié)果，可累及氣血，久病入絡(luò)，致正虛血瘀，故治療當(dāng)以活血化瘀、扶正補(bǔ)虛為主

。

靈芝為傳統(tǒng)中藥材之一，具有活血化瘀、清肝瀉火、補(bǔ)虛壯骨、扶正固本的功效，而靈芝多糖為靈芝有效成分之一，具有保護(hù)肝臟、降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗缺氧等多種藥理作用

。還有學(xué)者提出，靈芝多糖可通過減少TNF-α合成，防治慢性肝炎患者肝損傷，且其肝保護(hù)作用與免疫調(diào)節(jié)、抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)

。IL-2、IFN-γ、TNF-α與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。其中，IL-2有較廣泛免疫增強(qiáng)效應(yīng)，且可激活脾淋巴細(xì)胞對(duì)羊紅細(xì)胞產(chǎn)生抗體的應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)IFN-γ產(chǎn)生。IFN-γ具有較強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化作用。IFN-γ、IL-2分泌增加，可降低TNF-α水平，改善免疫功能，發(fā)揮抗肝臟纖維化損傷作用

。本研究結(jié)果顯示，靈芝多糖組治療后AST、ALT、TBil水平降低，體質(zhì)量及IL-2、IFN-γ水平升高，TNF-α降低，肝纖維化程度、肝臟組織病理形態(tài)學(xué)異常改變有所減輕，這提示靈芝多糖可減輕肝纖維化小鼠肝損傷，改善免疫功能，保護(hù)肝臟組織。蔡德雷等

也發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可減輕肝纖維化小鼠肝功能損傷，抑制肝纖維化，與本研究結(jié)果一致。

（2）檢查通報(bào)：重慶市婚管中心每月不定期對(duì)項(xiàng)目單位進(jìn)行檢查和電話抽查，以了解項(xiàng)目實(shí)施情況。同時(shí)對(duì)于實(shí)施情況不符合要求的項(xiàng)目單位，提出限期整改、緩撥經(jīng)費(fèi)、減少經(jīng)費(fèi)、暫停項(xiàng)目或終止項(xiàng)目的處理意見。重慶市婚管中心每兩月對(duì)項(xiàng)目單位進(jìn)行項(xiàng)目錯(cuò)情通報(bào)，一方面對(duì)項(xiàng)目實(shí)施中出現(xiàn)的錯(cuò)情進(jìn)行通報(bào)批評(píng)，并依據(jù)扣分規(guī)則對(duì)終期評(píng)估進(jìn)行扣分，另一方面也要對(duì)各項(xiàng)目單位實(shí)施效果進(jìn)行排名，連續(xù)兩次排名在后3名的項(xiàng)目單位，將扣除項(xiàng)目總經(jīng)費(fèi)1%。

Wnt糖蛋白家族在機(jī)體細(xì)胞分化、增殖、極性產(chǎn)生及器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用。β-catenin多表達(dá)在細(xì)胞膜黏連連接處、細(xì)胞核及游離細(xì)胞質(zhì)中，不僅可調(diào)控細(xì)胞生長、分化、增殖等過程，還可經(jīng)由與細(xì)胞膜上鈣黏蛋白cadherin產(chǎn)生作用，影響細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移

。馬瓊等

研究中提出，由β-catenin介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中具有重要作用，可影響肝纖維化發(fā)展過程。報(bào)道顯示

，人肝星狀細(xì)胞核上存在β-catenin蛋白累積，且可促使纖維化基因表達(dá)上調(diào)。還有研究發(fā)現(xiàn)

，經(jīng)由下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可抑制慢性丙型肝炎向肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。另外，報(bào)道顯示

，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可經(jīng)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，影響肺部炎癥，暗示其免疫調(diào)節(jié)作用。這些研究均提示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能在肝纖維化疾病控制及免疫調(diào)節(jié)中有一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖應(yīng)用后小鼠Wnt1、Wnt3a、Wnt10、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且經(jīng)應(yīng)用Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑進(jìn)一步驗(yàn)證，這提示靈芝多糖可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，推測(cè)這可能是靈芝多糖改善肝纖維化小鼠肝損傷、免疫功能的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述，靈芝多糖可減輕肝纖維化小鼠肝損傷，改善其免疫功能，緩解肝纖維化程度，作用機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本研究不足之處包括：實(shí)驗(yàn)時(shí)間有待延長，以獲得更為穩(wěn)定的肝纖維化小鼠模型；實(shí)驗(yàn)僅分析了靈芝多糖經(jīng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮的作用，未研究其他途徑，故今后仍需進(jìn)一步深入分析。

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