基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大黃治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制

潘 威

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 沈陽 110003

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性炎性疾病，其病因不明確，屬疑難雜癥，近年來發(fā)病率逐漸上升，任何年齡均可發(fā)病，老年人發(fā)病率高[1-3］。UC好發(fā)于結(jié)、直腸，表現(xiàn)為結(jié)、直腸黏膜連續(xù)性彌漫性炎癥，周期性交替發(fā)作，病程遷延反復(fù)。主要癥狀為腹痛、腹瀉及黏液膿血便，出血嚴(yán)重可導(dǎo)致貧血、營養(yǎng)不良等全身癥狀，部分可能發(fā)展為結(jié)腸癌[4-5］。目前世界范圍內(nèi)尚無治療UC 的指南或共識，臨床多應(yīng)用美沙拉嗪、巴拉西亭、類固醇等藥物進(jìn)行治療，此外還有替代補(bǔ)充療法，如糞便移植、益生菌移植等[6-9］。但此類療法容易發(fā)生并發(fā)癥，且存在一定選擇標(biāo)準(zhǔn)、安全性等問題[10-11］。

潰瘍性結(jié)腸炎屬于中醫(yī)學(xué)“久痢”“休息痢”等范疇?！端貑枴ぬ庩柮髡撈吩疲骸按竽c屬腑，瀉而不藏，多實(shí)多熱。”[12］《東垣十書》中闡述：“夫腸澼者，為水谷與血另作一派……時(shí)值長夏，濕熱大盛……而主氣弱，故腸澼之病甚?！盵13］UC 在臨床上多表現(xiàn)為熱證，是由于大腸濕熱、熱毒所導(dǎo)致的里急后重、肛門灼熱等癥狀[14-15］。醫(yī)學(xué)家多應(yīng)用清解法，大量應(yīng)用大黃、黃連等苦寒堅(jiān)陰藥物來清利大腸濕熱，效果頗佳[16-17］。近年來，以大黃組方的方劑如大黃牡丹湯等廣泛應(yīng)用于臨床，獲得了滿意的效果[18-19］。大黃中含有多種化學(xué)成分，對于哪些成分通過什么途徑發(fā)揮治療UC 的作用研究較少，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大黃治療UC 的有效化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)、途徑，以期探索大黃對UC的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 篩選關(guān)鍵化學(xué)成分通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/index.php）檢索大黃的全部有效成分，共收集92 種化合物，再通過口服生物利用度（oral bioavail-ability，OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，對化合物的藥物動力學(xué)進(jìn)行篩選，其中，OB是指藥物經(jīng)口服給藥后被機(jī)體吸收進(jìn)入血液循環(huán)的相對量和速率；DL 反映化合物中特定的功能基團(tuán)與已知藥物的相似性，二者對中藥化學(xué)成分活性的評估具有重要意義。

1.2 篩選大黃-潰瘍性結(jié)腸炎共同作用靶點(diǎn)利用TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索大黃關(guān)鍵化學(xué)成分的靶點(diǎn)信息，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）查詢與靶點(diǎn)相對應(yīng)的人類基因名稱，再與通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）篩選出的潰瘍性結(jié)腸炎的蛋白靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到藥物-疾病靶點(diǎn)基因。

1.3 藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)可視化為了研究大黃治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，本研究將大黃-潰瘍性結(jié)腸炎的共同化學(xué)成分和共同蛋白靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape3.7.2 軟件進(jìn)行可視化處理，在藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)以網(wǎng)絡(luò)圖的形式呈現(xiàn)出來。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中，鍵化合物和靶點(diǎn)以節(jié)點(diǎn)表示，節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系以邊來表示。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建PPI 即蛋白間相互作用關(guān)系（protein-protein interaction）的網(wǎng)絡(luò)將大黃與潰瘍性結(jié)腸炎的共同靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù) 庫（https：//string-db.org/Version 10.5），選擇研究物種為人類（homo sapiens），得到蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，將蛋白關(guān)系評分設(shè)為0.7，并隱藏出現(xiàn)的游離蛋白，下載PPI 蛋白互作關(guān)系圖，并篩選排名前15的PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.5 GO（gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析通過Bioconductor 數(shù)據(jù)庫（http：//bioconductor.org/bioc Lite.R）查詢藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因的基因ID。利用R 語言安裝Bioconductor 平臺相關(guān)安裝包，設(shè)置pvalue=0.05，qvalue=0.05 進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，輸出結(jié)果并繪制barplot柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 大黃中化學(xué)成分的篩選通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得大黃的有效化合物共92 種，再經(jīng)OB≥30%，DL≥0.18 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到大黃的有效化合物16 種，包括大黃酸、蘆薈大黃素、兒茶素、β-谷固醇、澤蘭黃醇、決明內(nèi)酯等。見表1。

表1 大黃中的有效化學(xué)成分

2.2 藥物-疾病靶點(diǎn)預(yù)測通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢大黃有效化合物的靶點(diǎn)信息，通過UniProt 進(jìn)行基因ID的注釋。通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索UC的靶點(diǎn)基因，輸入“Ulcerative colitis”，獲取相關(guān)性評分大于5的基因共945個(gè)，將大黃與UC 的靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到大黃-UC 的共同靶點(diǎn)共25個(gè)，并通過R語言繪制venn圖，見圖1。記錄共同靶點(diǎn)所對應(yīng)的大黃關(guān)鍵化合物，最終得到大黃-UC 的關(guān)鍵化學(xué)成分共6 個(gè)，分別為大黃酸、蘆薈大黃素、兒茶素、β-谷固醇、澤蘭黃醇、決明內(nèi)酯。大黃-UC 的共同靶點(diǎn)基因分別為NOS2、PTGS2、ESR2、PRSS1、KDR、PTGS1、JUN、ESR1、CHEK1、SLC6A4、BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8、PON1、CDKN1A、TNFSF15、FASN、PCNA、MYC、IL1B、PRKCD、CCNB1、PPARG。見圖1。

2.3 藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過Cytoscape 3.7.2 軟件將藥物-關(guān)鍵化合物-疾病-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，見圖2。

2.4 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析將大黃-UC共有的25個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫平臺，研究物種選擇人類，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，篩選評分＞0.4的蛋白關(guān)系，并繪制蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)包括25個(gè)節(jié)點(diǎn)，102條邊，其中評分≥0.98的互作蛋白為CASP8-CASP3、CDKN1A-PCNA、MYC-CDKN1A、BCL2-CASP8、CASP8-CASP9、CDKN1A-CCNB1、MYCJUN、MYC-ESR1、CDKN1A-JUN、CDKN1A-CASP3。這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中非常重要，通過計(jì)算每個(gè)基因連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，找出前15個(gè)PPI核心基因，為MYC、CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、CASP8CASP 9、IL1B、CCNB1、CDKN1A、CHEK1、PPARG、BAX、NOS2、BCL2。這些即為大黃治療UC 的核心基因，見圖3—4。

2.5 GO 功能富集分析GO 富集分析結(jié)果顯示共獲得43條GO生物學(xué)過程，排名靠前的生物學(xué)功能主要為半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程（3個(gè)靶點(diǎn)CASP9/CASP3/CASP8）、雌激素受體結(jié)合（3個(gè)靶點(diǎn)ESR1/PCNA/PPARG）、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合（3 個(gè)靶點(diǎn)CASP3/CASP8/TNFSF15）、核受體活性（3 個(gè)靶點(diǎn)ESR2/ESR1/PPARG）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合（3 個(gè)靶點(diǎn)ESR2/ESR1/PPARG）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)劑活性（3 個(gè)靶點(diǎn)CASP3/CDKN1A/CCNB1）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（5 個(gè)靶點(diǎn)JUN/BCL2/CASP8/CDKN1A/CCNB1）、類固醇激素受體活性（3 個(gè)靶點(diǎn)ESR2/ESR1/PPARG）、BH 域綁定（2個(gè)靶點(diǎn)BCL2/BAX）、死亡域結(jié)合（2個(gè)靶點(diǎn)BCL2/BAX），說明大黃可以通過多種生物學(xué)調(diào)控過程發(fā)揮治療UC的作用。見圖5。

2.6 KEGG 通路富集分析KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，半夏治療直腸癌的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要富集的通路有17條，主要通路涉及p53信號通路、多種凋亡通路、鉑耐藥通路、細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞周期通路、VEGF 信號通路、細(xì)胞衰老通路、壞死性通路、ErbB 信號通路、MAPK 信號通路、NF-κB 信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等，見圖6。

3 討論

腸道微環(huán)境對機(jī)體發(fā)揮著多種重要的生理調(diào)節(jié)作用，腸道菌群的抗原對腸道內(nèi)的免疫細(xì)胞具有一定的刺激作用，可以刺激產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，其中促炎因子與抗炎因子之間的動態(tài)平衡維持著腸道以及整個(gè)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，UC 患者在發(fā)病過程中，上述細(xì)胞因子之間的平衡被打破，腸道微生態(tài)發(fā)生混亂[20-21］。大黃分布于陜西、甘肅、四川等地，為蓼科大黃屬，味苦、性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，具有瀉火、清熱解毒、活血祛瘀、利水、清化濕熱的功效。《本草綱目》云：“主治下痢亦白，里急腹痛，小便淋瀝，實(shí)熱燥結(jié)，潮熱譫語，黃疸，諸火瘡。”[22］大黃含有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚等化合物，主治腹痛、瀉痢不爽、腸癰疔瘡等。

本研究中，共檢索出大黃治療UC 的關(guān)鍵化合物6 種，包括大黃酸、蘆薈大黃素、兒茶素、β-谷固醇、澤蘭黃醇、決明內(nèi)酯。大黃酸又名大黃苷，具有免疫抑制作用和抗炎作用，大黃酸能抑制機(jī)體產(chǎn)生抗體，有研究表明它能減輕免疫器官的質(zhì)量，降低機(jī)體白細(xì)胞數(shù)目，此外，大黃酸還具有抗腫瘤、抗菌、利尿的作用[23-24］。蘆薈大黃素是大黃的有效抗菌成分，對葡萄球菌、炭疽、鏈球菌、痢疾桿菌等均有強(qiáng)大的抑制作用，其免疫抑制作用能夠降低腹腔巨噬細(xì)胞的功能，它對肝癌、肺鱗癌、胃癌等腫瘤具有較強(qiáng)活性，抗癌范圍廣泛，對白血病細(xì)胞亦具有抑制作用[25-26］。兒茶素又名兒茶酸，廣泛存在于茶葉中，其直接抗菌作用較強(qiáng)，具有廣譜性和高效性，能夠增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，造成細(xì)菌死亡，還可影響細(xì)菌的基因表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)兒茶素可產(chǎn)生過氧化氫，誘導(dǎo)katB、sodM 等基因上調(diào)，增強(qiáng)細(xì)胞對氧化應(yīng)激和DNA 損傷的抵抗作用[27-28］。β-谷固醇通常用于降血清膽固醇，具有解熱抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，同時(shí)對肺纖維化的損傷具有修復(fù)作用[29］。本研究通過PPI蛋白互作分析，得到15 個(gè)PPI 核心基因，分別為MYC、CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、CASP8CASP9、IL1B、CCNB1、CDKN1A、CHEK1、PPARG、BAX、NOS2、BCL2。這些即為大黃治療UC的核心基因。

本研究通過GO 生物學(xué)功能富集分析和KEGG通路富集分析靶點(diǎn)在基因功能和信號通路方面作用。上述PPI 核心基因可以通過半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程而起到治療UC的作用。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，大黃治療UC 的靶點(diǎn)基因主要富集的通路涉及p53 信號通路、ErbB 信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。p53 基因是人體的抑癌基因，能夠促進(jìn)血細(xì)胞凋亡，組織細(xì)胞周期，它誘導(dǎo)的磷酸酶對機(jī)體炎癥具有調(diào)節(jié)作用[30-31］。MAPK 與細(xì)胞增殖、免疫調(diào)控相關(guān)，宿主細(xì)胞可通過抑制MAPK來抑制病毒的活性[32］。NF-κB信號通路與調(diào)節(jié)機(jī)體對感染的免疫應(yīng)答有密切關(guān)系，NF-κB的調(diào)節(jié)作用錯(cuò)誤會導(dǎo)致出現(xiàn)炎癥、癌癥、自身免疫性疾病及感染性休克等，NF-κB 信號通路可激活TNF 通路和IL 通路，后者與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫能力密切相關(guān)[33-34］。PI3K-Akt是經(jīng)典信號通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能，有研究[35-36］表明，在內(nèi)毒素癥小鼠模型中，PI3K-Akt 信號通路在凝血激活和先天免疫應(yīng)答中產(chǎn)生了作用，同時(shí)與機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)。有研究顯示，HIF-1 可以通過依賴性方式調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的平衡，進(jìn)而控制腸道炎癥，HIF-1 的表達(dá)與小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[37］?？梢?，大黃可以通過抑制炎癥反應(yīng)，改善機(jī)體免疫能力的方式治療UC。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，闡述了大黃的有效活性成分及靶點(diǎn)基因與UC 作用通路的關(guān)系，分析了大黃治療UC 的復(fù)雜作用機(jī)制，為未來更深入的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。